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Papel de la Proteina Doblecortina en los procesos de neurogenesis y migracion neuronal en el Sistema Nervioso Central adulto

De
176 pages
Colecciones : DBCP. Tesis del Departamento de Biología Celular y PatologíaTD. Ciencias biosanitarias
Fecha de publicación : 2010
[ES] En esta tesis se quiere dilucidar el papel ejercido por la proteina DCX, implicada en el proceso de migración celular que tiene lugar durante la corticogénesis, en los mecanismos de migración y diferenciación que tienen lugar durante el desarrollo postnatal del sistema olfatorio, para conocer si existen diferencias entre los procesos neurogenénicos en el SNC adulto frente a los que tienen lugar durante el desarrollo embrionario.[EN] In this thesis is to elucidate the role played by the DCX protein, involved in the process of cell migration that occurs during the corticogénesis, in the mechanisms of migration and differentiation that occur during postnatal development of the olfactory system, to see if there neurogenénicos differences between processes in the adult CNS compared to those taking place during embryonic development.
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PAPEL DE LA PROTEÍNA DOBLECORTINA EN
LOS PROCESOS DE NEUROGÉNESIS Y
MIGRACIÓN NEURONAL EN EL SISTEMA
NERVIOSO CENTRAL ADULTO

TESIS DOCTORAL

MARÍA VIDAL GARCÍA


Salamanca, Octubre 2009
















DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y PATOLOGÍA
INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS DE CASTILLA Y LEÓN





PAPEL DE LA PROTEÍNA DOBLECORTINA EN
LOS PROCESOS DE NEUROGÉNESIS Y
MIGRACIÓN NEURONAL EN EL SISTEMA
NERVIOSO CENTRAL ADULTO


Memoria presentada por María Vidal García para optar al grado de
Doctor por la Universidad de Salamanca

Director:
Prof. Dr. D. Jesús María García Briñón



Octubre 2009














DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y PATOLOGÍA
INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS DE CASTILLA Y LEÓN





PAPEL DE LA PROTEÍNA DOBLECORTINA EN
LOS PROCESOS DE NEUROGÉNESIS Y
MIGRACIÓN NEURONAL EN EL SISTEMA
NERVIOSO CENTRAL ADULTO



María Vidal García



Octubre 2009

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Son muchas las personas a las que quiero dar las gracias por participar, de un
modo u otro, en la realización de este trabajo. Me gustaría dedicar las primeras líneas a
las que son las personas más importantes en mi vida, a mis padres y a David. Quiero
agradecer a mis padres su apoyo incondicional y su fuerza, soy lo que soy gracias a
ellos y, de la forma más sincera, creo que nadie lo podría haber hecho mejor. Me
gustaría dar las gracias a David por su paciencia, sus consejos, su confianza, por
hacerme sentir segura y hacer que camine siempre hacia delante.
Quiero agradecer a mi Director de Tesis, el Dr. Jesús García Briñón, todo el
esfuerzo, el trabajo y el empeño que ha dedicado durante estos años a la realización de
este proyecto, especialmente en los últimos meses, en los que ha trabajado a
contrarreloj.
Me gustaría agradecer al Dr. Jordi Alberch y al Dr. Josep Canals por abrirme las
puertas de su laboratorio y tratarme como un miembro más del grupo. Quiero además,
dar las gracias a todo su equipo, pero de forma especial a Raquel, Miriam, Cris y a
Noelia… os echo de menos chicas!
Gracias a la Dra. Tabernero, al Dr. Medina y a todo su equipo, especialmente a
André y a Vega, por ayudarme en mis inicios con los cultivos primarios y con las
transfecciones.
Gracias al Dr. Didier Trono y al Dr. Antonio Bernad por su amabilidad a la hora de
cederme los plásmidos necesarios para que el proyecto despegara.
Gracias al Dr. Juan Pedro Bolaños y a todo su equipo por su ayuda con algunas de
las construcciones vectoriales.
Gracias a Ana, Lorena y Lau por ser mi apoyo, por ser como son, por encontrar
siempre la palabra de ánimo, o porque a veces vale sin hablar… gracias por estar ahí.
Gracias también a toda mi familia por su confianza, y por no tener en cuenta las horas
que nos ha “robado” esta Tesis.
He querido reservar estas últimas líneas para dar las gracias a todos y cada uno de
los miembros del Dpto. de Biología Celular y a todo el Instituto de Neurociencias de
Castilla y León, donde he podido aprender y desarrollarme en todos los aspectos.
Quiero agradecer de forma especial el apoyo, personal y profesional, de mis
compañeros de laboratorio. En mi opinión no hace falta nombrar a nadie, creo que se
reconocerán en mis palabras. Lo mejor de todos estos años ha sido poder venir a
trabajar con una sonrisa. Las personas no podemos elegir la gente con la vamos a
trabajar, pero si pudiera elegir, nadie mejor que vosotros.
Gracias a todos los que en este trabajo habéis puesto manos, cabeza y corazón.

ÍNDICE
INTRODUCCIÓN .................................................................................... 1
NEUROGÉNESIS EN EL SNC ADULTO .......................................................................... 3
Nichos neurogénicos .................................................................................................................. 4
Regulación de la neurogénesis .................................................................................................. 5
Hormonas ......................................................................................................................................... 5
Neurotransmisores .......................................................................................................................... 6
Factores de crecimiento o neurotrofinas ...................................................................................... 6
Moléculas de adhesión celular ...................................................................................................... 8
SIGNIFICADO FUNCIONAL DE LA NEUROGÉNESIS ............................................... 9
SISTEMA ZSVBO ............................................................................................................... 11
ZSV adulta: estructura y tipos celulares. ............................................................................... 11
Bulbo olfatorio principal: estructura y función ..................................................................... 15
Células de nueva generación del bulbo olfatorio ................................................................. 19
MECANISMOS DE MIGRACIÓN CELULAR ................................................................ 23
Migración radial ........................................................................................................................ 23
Migración tangencial ................................................................................................................ 25
MIGRACIÓN CELULAR EN LA CMR Y BO ................................................................. 25
Desarrollo embrionario vs. Desarrollo postnatal .................................................................. 28
ALTERACIONES EN LA MIGRACIÓN CELULAR: LISENCEFALIAS .................... 30
Doblecortina............................................................................................................................... 32
RNA DE INTERFERENCIA .............................................................................................. 35
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ........................................................ 39
MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................... 43
ANÁLISIS IN VITRO .......................................................................................................... 45
Cultivos primarios de neuronas corticales ............................................................................ 45
Transfección con siRNA ............................................................................................................... 46
Westernblot .............................................................................................................................. 46
Preparación de los geles ............................................................................................................... 47
Electroforesis y transferencia ....................................................................................................... 47
Inmunodetección ........................................................................................................................... 48
Inmunofluorescencia para cultivos primarios ...................................................................... 49
Construcciones vectoriales ...................................................................................................... 50
Diseño de los oligonucleótidos DCXshRNA y scrambleDCXshRNA ................................... 50
Modificación del ADN plasmídico ............................................................................................. 52
Reacción de ligación ...................................................................................................................... 53
Transformación bacteriana .......................................................................................................... 53
Obtención de ADN plasmídico ................................................................................................... 53
Northern blot ............................................................................................................................. 53
Extracción de RNA enriquecido en RNA de pequeño tamaño ............................................... 54
Preparación de los geles de acrilamida y electroforesis ........................................................... 54
Transferencia.................................................................................................................................. 55
Marcaje de la sonda e hibridación ............................................................................................... 55
Producción de partículas lentivirales ..................................................................................... 56
Cultivo de la línea celular 293FT ..................................................................................................... 57
Cotransfección de las células 293FT con plásmidos virales ..................................................... 58
Concentración ................................................................................................................................ 58
Titulación viral............................................................................................................................... 59
Cultivos de progenitores embrionarios de LGE de ratón.................................................... 60
Mantenimiento .............................................................................................................................. 60
Análisis de diferenciación ............................................................................................................ 61
Inmunofluorescencia y westernblot .......................................................................................... 63

Extracción de RNA ........................................................................................................................ 63
Transducción lentiviral de los progenitores embrionarios ...................................................... 63
Ensayo de PCR cuantitativa .................................................................................................... 64
ANÁLISIS IN VIVO ............................................................................................................ 65
Inyecciones estereotáxicas ....................................................................................................... 65
Obtención y preparación del tejido ........................................................................................ 66
Sacrificio y disección ..................................................................................................................... 66
Seccionamiento .............................................................................................................................. 67
Inmunohistoquímica convencional ........................................................................................ 67
Controles de la técnica inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia ............................... 68
Cuantificación ............................................................................................................................ 69
Análisis cuantitativos de GFP ...................................................................................................... 69
Análisis estadísticos .................................................................................................................. 70
Documentación y tratamiento de imágenes .......................................................................... 70
RESULTADOS ......................................................................................... 71
SILENCIAMIENTO IN VITRO MEDIANTE siRNA ...................................................... 73
CONSTRUCCIÓN DE UN SISTEMA DE EXPRESIÓN CONSTITUTIVA DE shRNA
................................................................................................................................................ 73
Determinación de la expresión de shRNA mediante northerblot ..................................... 74
GENERACIÓN DE LENTIVIRUS RECOMBINANTES ................................................ 74
SILENCIAMIENTO IN VITRO MEDIANTE shRNA ..................................................... 79
Determinación de la expresión de doblecortina ................................................................... 80
Infección con lentivirus recombinantes ................................................................................. 83
Determinación del grado de silenciamiento .............................................................................. 83
Efecto del silenciamiento sobre la expresión de otros genes ................................................... 83
SILENCIAMIENTO IN VIVO MEDIANTE shRNA ....................................................... 84
Determinación del grado de silenciamiento .......................................................................... 89
Efectos producidos por el silenciamiento de doblecortina .................................................. 89
Análisis de migración tangencial ................................................................................................ 89
Tipos morfológicos de células de nueva generación ................................................................ 90
Análisis de migración radial ........................................................................................................ 97
Efectos sobre la diferenciación .................................................................................................. 105
DISCUSIÓN ........................................................................................... 119
iRNA COMO HERRAMIENTA DE ESTUDIO ............................................................. 121
Consideraciones técnicas ....................................................................................................... 122
Lentivirus como vehículos de expresión ............................................................................. 123
EXPRESIÓN DE DOBLECORTINA EN PROGENITORES EMBRIONARIOS DE
LGE ...................................................................................................................................... 126
El silenciamiento in vitro de doblecortina reduce los niveles del mRNA de Tuj1.......... 127
SILENCIAMIENTO DE DOBLECORTINA EN PROGENITORES DE LA SVZ
ADULTA ............................................................................................................................ 129
Grado de silenciamiento de doblecortina ............................................................................ 130
Migración tangencial a través de la CMR en roedores adultos. ....................................... 131
El silenciamiento de doblecortina provoca la aparición de células multipolares. ......... 134
Migración radial a través del BO en roedores adultos ....................................................... 136
Diferenciación temprana de los granos de nueva generación del BO ............................. 138
CONCLUSIONES .................................................................................. 141
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 145

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