Microbiologie alimentaire: Techniques de laboratoire

Jean Paul Larpent. coordonnateur

Microbiologie alimentaire
Techniques de laboratoire

is/inlmm TEC DOC

Lavoisier

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE
TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Coordonné par Jean-Paul Larpent

1/oi'Oi.viVrl

LONDRES

TEC DOC

NEW YORK

PARIS 11, rue Lavoisier F 75384 Paris cedex 08

Chez le même éditeur • Mémento technique de microbiologie J.-P. Larpent, M. Larpent-Gourgaud, 3 e édition, 1997. • Microbiologie alimentaire Collection « Sciences et techniques agroalimentaires » -Tome 1, « Aspects microbiologiques de la sécurité et de la qualité des aliments », C.-M. Bourgeois, J.-F. Mescle, J. Zucca, coordonnateurs, 2e édition, 1996. - Tome 2, « Aliments fermentes et fermentations alimentaires », C.-M. Bourgeois, J.-P. Larpent, coordonnateurs, 2e édition, 1996. • Les Listeria J.-P. Larpent, 1995. • Les probiotiques en alimentation animale et humaine J.-P. Larpent, N. Château, M.-I. Castellanos, J.-L. Larpent, 1994. • Microbiologie industrielle Collection « Sciences et techniques agroalimentaires », J.-Y. Leveau, M. Bouix, coordonnateurs, 1993. • Technique d'analyse et de contrôle dans les industries agroalimentaires Tome 3, « Le contrôle microbiologique », C.-M. Bourgeois, J.-Y. Leveau, coordonnateurs, 2e édition, 1991.

DANGER
L E

PHOTOCOPILLAGE TUE LE LIVRE

© TECHNIQUE & DOCUMENTATION, 1997 ISBN: 2-7430-0155-0

Toute reproduction ou représentation intégrale ou partielle, par quelque procédé que ce soit, des pages publiées dans le présent ouvrage, laite sans l'autorisation de l'éditeur ou du Centre Français d'Exploitation du droit de copie (3, rue Hautefeuille - 75006 PARIS), est illicite et constitue une contrefaçon. Seules sont autorisées, d'une part, les reproductions strictement réservées à l'usage privé du copiste et non destinées à une utilisation collective, et, d'autre part, les analyses et courtes citations justifiées par le caractère scientifique ou d'information de l'œuvre dans laquelle elles sont incorporées (Loi du I" juillet 1992-art. L 122-4 et L 122-5 et Code Pénal art. 425).

LISTE DES AUTEURS

Avoyne Christèle Ingénieur microbiologiste AES Laboratoire Route de Dol - BP 54 35270 Combourg Bal-Fontaine Maurice Ancien directeur du laboratoire central Idéval, 2, rue du Velay 63800 Cournon Bannari Souad Chercheur, laboratoire de microbiologie. Université Biaise Pascal Complexe scientifique des Cézeaux Bat. 1er cycle Biologie C 63177 Aubière Cedex Barbalat Christian Directeur du laboratoire municipal Parc Technologique de la Pardieu 10, rue Louis Rosier, 63000 Clermont-Ferrand Bariller Jérôme Asept, Ingénieur en microbiologie rue des Docteurs Calmette et Guérin BP49 53020 Laval Cedex Bellon-Fontaine Marie-Noëlle Chargée de recherche, Inra, Laboratoire de génie de l'hygiène et des procédés alimentaires, 25, avenue de la République 91300 Massy Bertrand Didier Docteur Ingénieur Laboratoire Municipal, 60, rue Baujan 72000 Le Mans

Bervas Elisabeth Chercheur, Université Biaise Pascal, Complexe scientifique des Cézeaux Bat. 1er cycle Biologie C 63177 Aubière Cedex Biokar Diagnostics Z.I. n° 2 12 allée Monge 60000 Beauvais BioMérieux 69280 Marcy-l'étoile Boulangé-Petermann Laurence Ingénieur section corrosion, Centre de recherches Ugine Savoie 73403 Ugine Cedex Bozio Jean-Yves Directeur du laboratoire municipal 60, rue Baujan 72000 Le Mans Bracq Emmanuelle, Inra Laboratoire de Recherches fromageres 36, rue de Salers 15000Aurillac Breton André Professeur, Université Biaise Pascal Laboratoire de Microbiologie Bat 1er cycle Biologie C 63177 Aubière Cedex Butin Michel Pharmacien biologiste - Responsable de la division microbiologie - AES Laboratoire Route de Dol BP54 35270 Combourg

IV

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Callon Cécile Chercheur, Laboratoire de microbiologie. Université Biaise Pascal Complexe scientifique des Cézeaux Bat. 1er cycle Biologie C 63177 Aubière Cedex Carpentier Brigitte Chargé de Recherches au CNEVA Lerpac 22, rue Pierre Curie BP 332 94709 Maisons-Alfort Cedex Champiat Dominique Ingénieur CD Life BP 2029 69616 Villeurbanne Chouette Paulette-Jacqueline Chef de service qualité. Société des eaux de Volvic Usine du Chancet 63530 Volvic Coiffier Odile Maître de conférences, LU .P. Agroalimentaire, Esplanade de la Paix 14032 Caen Cedex Copin Marie-Pierre Docteur Ingénieur, Conseiller scientifique produits microbiologie Europe 3M, 3, rue Danton 92245 Malakoff Cedex Cotton-Reymond Pascale Maître de conférences laboratoire de biologie cellulaire fongique, Université Lyon I, CGMC, bât. 405 43, bd 11 novembre 1918 69622 Villeurbanne Cedex Crozier Alain Docteur en microbiologie. L'Oréal 1, avenue Eugène Schueller 93600 Aulnay-sous-Bois

Delarras Camille Maître de conférences, IUT département biologie appliquée 29287 Brest Cedex Desmasures Nathalie ATER, Laboratoire de microbiologie alimentaire, Université de Caen Esplanade de la Paix 14032 Caen Cedex Desmazeaud Michel Directeur recherches Inra, 78350 Jouy-en-Josas Dragacci Sylviane Unité toxines microbiologiques CNEVA 43, rue Dantzig 75013 Paris Dromigny Eric Maître de conférences, HIDAOA École nationale vétérinaire de Nantes, CP 3013, 44087 Nantes Cedex 03 Durand-Poussereau Michel Chercheur laboratoire de biologie cellulaire fongique Université Lyon I, CGMC, bât. 405 43, bd 11 novembre 1918 69622 Villeurbanne Cedex Fèvre Michel Professeur Université Lyon I, CGMC, bât. 405 43, bd 11 novembre 1918 69622 Villeurbanne Cedex Gauthier Sylvie Chercheur université Biaise Pascal Complexe scientifique des Cézeaux Bat. 1er cycle Biologie C 63177 Aubière Cedex Germonville Alain Assistant technique Gist-Brocades, Food Specialities Divisions, BP239 59472 Séclin

Liste des auteurs

V

Guéguen Micheline Maître de conférences, Université de Caen Basse-Normandie, IBBA, Microbiologie alimentaire, Esplanade de la Paix 14032 Caen Cedex Guilloux-Benatier Michèle Maître de conférences Institut universitaire de la vigne et du vin « Jules Guyot », Laboratoire d'oenologie BP138 21004 Dijon Cedex Hermant Agnès Technicienne l'Oréal, 1, avenue Eugène Schueller 93600 Aulnay-Sous-Bois Jacquet Marc Directeur commercial, Gist-Brocades 15, rue des Comtesses BP239 59472 Seclin Cedex Kodjo Angéli Maître de conférences Unité de microbiologie, Immunologie, ENVL, 1 avenue Bourgelat 69280 Marcy-l'Étoile Lafarge Véronique Ingénieur IESIEL, CNEVA - Paris 43, rue de Dantzig 75015 Paris Larpent Jean-Paul Professeur, Université Biaise Pascal, Laboratoire de Microbiologie Complexe scientifique des Cézeaux Bat. 1er cycle Biologie C 63177 Aubière Cedex Larpent-Gourgaud Monique Maître de conférences, Uuniversité Biaise Pascal Complexe scientifique des Cézeaux Bat. 1er cycle Biologie C 63177 Aubière Cedex

Magnol Isabelle Remplaçante assistante qualifiée de laboratoire, Laboratoire municipal, Parc technologique de la Pardieu, 10 rue Louis Rosier 63000 Clermont-Ferrand Mangin Irène Chercheur post-doctoral, Laboratoire de microbiologie alimentaire, Université de Caen, Esplanade de la Paix 14032 Caen Cedex Manuel Sébastien Ingénieur microbiologiste AES Laboratoire Route de Dol BP54 35270 Combourg Martinet Pascal Responsable des laboratoires d'entomologie, de mycologie et d'écotoxicologie, Société Cecil Avenue Frédéric Mistral BP16 38670 Chasse-Sur-Rhône Masson Florence Chercheur Inra Theix, 63122 Saint-Genès-Champanelle Michaux Odile Technicienne de formation et de recherche, Université Biaise Pascal, Laboratoire de Microbiologie Complexe scientifique des Cézeaux Bat. 1er cycle Biologie C 63177 Aubière Cedex Montel Marie-Christine Chargé de recherches Inra Theix 63122 Saint-Genès-Champanelle Poumeyrol Martine Docteur Vétérinaire, CNEVA - Paris 43, rue de Dantzig 75015 Paris

VI

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Reynaud Alain Directeur du laboratoire des services vétérinaires BP42-Marmilhat 63370 Lempdes Rigard Gisèle Professeur lycée Sidoine Appolinaire 20, avenue Jean Richepin 63000 Clermont-Ferrand Romond Charles Professeur université Lille II - Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques 3, rue du Docteur Laguesse 59045 Lille Cedex Romond Marie-Bénédicte Maître de conférences, Université Lille II Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques 3, rue du Docteur Laguesse 59045 Lille Cedex Rossignol Xavier Idéval, Service recherche rue Chomaget BP22 43101 Brioude Schwartzbrod Louis Professeur de virologie Centre collaborateur OMS « microorganismes » in Wastewater Université Henri Poincaré - Nancy I 5, rue Albert Lebrun BP 403 54001 Nancy Cedex Sesquès Martine Docteur es Science, Responsable du laboratoire de microbiologie alimentaire LIAL, 38, rue de Salers 15000Aurillac

Sorin Marie-Laure Pharmacien, Responsable du laboratoire Diffchamb, 8. rue Saint-Jean-de-Dicu 69007 Lyon Tailliez Patrick Ingénieur de recherches, Unité de recherches laitières Inra, 78350 Jouy-en-Josas Terrot Claude Directeur Industrie et environnement BioMéricux 69280 Marcy-l'étoile Thétas Jean-Louis Ingénieur commercial. Société UCB Pharma 21, rue de Neuilly BP314 92003 Nanterre Cedex Thiaudière Mylène Ingénieur microbiologiste de Brest Tourdot-Maréchal Raphaëlle Maître de conférences, Institut universitaire de la vigne et du vin « Jules Guyot » Laboratoire d'œnologie BP 138 21004 Dijon Cedex Vayssier Yves Professeur, IUT biologie appliquée, 24, rue Docteur Embaquès 32000 Auch Veau Patrick Docteur es Sciences Texel BP10 86220 Dangé-Saint-Romain Vernozy-Royaud Christine Maître de conférences, École nationale vétérinaire de Lyon, unité HIDAOA, 1, rue Bourgelat 69280 Marcy-FÉtoile

AVANT-PROPOS

Certains micro-organismes ont toujours été utilisés par l'homme, qui les a parfois domestiqués pour la fabrication d'aliments dits fermentes. D'autres, au contraire, ont toujours été redoutés et sont les agents de maladies et d'épidémies diverses, ainsi que les responsables d'altérations importantes des produits alimentaires. Cet ouvrage tente de combler l'absence d'ouvrages de travaux pratiques destinés : -aux chercheurs et techniciens chargés, au sein des laboratoires de contrôles officiels ou des industries privées, de protéger la santé publique ; -aux chercheurs et techniciens des services publics et privés qui tentent d'exploiter au mieux les potentialités des micro-organismes en maîtrisant les transformations biochimiques microbiennes des produits ; -aux enseignants, chercheurs et étudiants des universités scientifiques, des facultés de médecine et de pharmacie, des écoles d'ingénieurs à vocation biologique, des IUT et des BTS ; -aux enseignants de l'enseignement secondaire et technique qui assurent une formation très complète pour les bacheliers des séries professionnelles et technologiques. Bien entendu, il était impossible de rassembler dans un volume, aussi important soit-il, toutes les techniques utilisées dans le domaine des industries agroalimentaires. Néanmoins, après un exposé sur la qualité au laboratoire et dans les industries, la notion de sécurité alimentaire, avec la méthode HACCP et les systèmes d'autocontrôlés, les auteurs ont étudié les principales techniques de recherche, de dénombrement et d'identification des principaux micro-organismes importants dans les industries agroalimentaires : Campylobacter, Pseudomonas et bactéries apparentées, Enterobacteriaceae et Vibrionaceae, les ferments lactiques et apparentés, Staphylococcus et Listeria, les bactéries corynéformes dont Brevibacterium linens, les Clostridium et les Bacillus, les mycobactéries, les bactéries anaérobies, Bifidobacterium, les levures et les champignons. La recherche des mycotoxines et des virus fait l'objet de deux chapitres importants. La troisième partie de l'ouvrage est centrée sur quelques problèmes physiologiques influant sur l'hygiène industrielle : problème des biofilms et de la corrosion microbienne, contrôle des populations microbiennes, dosage des antibiotiques et des antiseptiques, suivi du développement microbien par impédancemétrie ou ATPmétrie.

VIII

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

La quatrième partie de l'ouvrage donne quelques exemples de produits alimentaires dont l'analyse microbiologique est nécessaire pour assurer leur inocuité ou leur valeur organoleptique (produits fermentes) : eaux, boissons alcoolisées ou non, lait et produits laitiers, viandes et produits carnés, produits végétaux fermentes (algues, pain, soja), conserves, plats cuisinés. Les annexes donnent des renseignements sur les normes officielles Afnor, Iso, Fil ... et des informations diverses sur les critères microbiologiques. La rédaction de ces séances de travaux pratiques ou de « démonstrations » se veut aussi précise matériellement que possible. L'indication de certains types de matériels utilisés n'implique pas que d'autres modèles ou marques ne soient pas satisfaisants, mais nous avons seulement précisé ceux que nous avons employés. Nous tenons à remercier très sincèrement tous les auteurs qui, pour leur part, ont pris en charge un ou plusieurs chapitres dont ils étaient spécialistes. Ce livre n'aurait pas pu voir le jour sans ces multiples coopérations. Nous remercions tout particulièrement les diverses sociétés qui ont bien voulu nous autoriser à reproduire les techniques d'utilisation de nombreux appareils. Leur intérêt pour cet ouvrage a permis d'exposer les techniques les plus modernes déjà utilisées dans les laboratoires industriels. Jean-Paul Larpent

TABLE DES MATIERES

Première partie La qualité
Chapitre 1
M. BALFONTAINE

La qualité au laboratoire Qualité microbiologique de transformation du lait Les analyses bactériologiques réalisées dans le cadre des systèmes autocontrôles en agroalimentaire Sécurité alimentaire et HACCP

3 13

Chapitre 2
X. ROSSIGNOL

Chapitre 3
E. DROMIGNY

25 37

Chapitre 4
J.BARILLER

Deuxième partie Les micro-organismes
Manipulation 1 A. KODJO Manipulation 2 E. DROMIGNY Manipulation 3
bloMÉRIEUX

Les sondes nucléiques. Applications en microbiologie alimentaire Méthodes de recherche, de dénombrement et d'identification de Campylobacter jejuni VIDAS Campylobacter (CAM) Pseudomonas et bactéries aérobies {Acinelobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Flavobacterium, Janthinobacterium, Xanthomonas)

61 78 104

Manipulation 4 J.-P. LARPENT Manipulation 5 M. POUMEYROL Manipulation 6
M. POUMEYROL, V. LAFARGE

111

Pseudomonadacées, dénombrement des Pseudomonas dans les viandes et produits à base de viande 128 Enterobacteriaceae et Vibrionaceae 133

O. COIFFER, M.-P. COPIN, M. LARPENT-GOURGAUD,

Manipulation 7
M.-P. COPIN

Escherichia co/i 0157 H7

167

X

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Manipulation 8
M.-P. COPIN

Salmonella

173

Manipulation 9
S. MANUEL,M. BUTIN,
C. AVOYNE

Le Salmonella

1,2 test et le mueap test
181

(référence BCL01010I)

Manipulation 10
M.-L. SORIN

Transia Salmonella spp (références SA 0178,
SA 0181, S A 0 1 6 8 et SA 0176) 185

Manipulation 11
J.-P. LARPENT

Les agents de la pourriture molle

194

Manipulation 12

Les ferments lactiques et bactéries apparentées

199

M. LARPENT-GOURGAUD, O. MICHAUX, J.-P. LARPENT. N. DESMASURES, M. DESMAZEAIID, I. MANGIN, FI. MASSON, M.-C. MONTÉE, P. TAILLIEZ, bioMÉRiEux

Manipulation 13
C. VHRNO/Y-ROZAND

Méthodes d'identification des Staphylocoques

256

Manipulation 14
M . POUMEYROL, V . L A K A R G E

Staphylococcus

à coagulase positive

267

Manipulation 15 M. SESQUÈS, M.-L. SORIN Manipulation 16
M.-P. COPIN

Biotypage de Staphylococcus uitreus et dosage des enterotoxines staphylococciques Enterotoxines staphylococciques

276 287

Manipulation 17 M. LARPENT-GOURGAUD,
O. MICHAUX

Recherche de Listeria monocytogenes et les produits laitiers

dans le lait 294

Manipulation 18
M.-P. COPIN

Listeria

306

Manipulation 19

Méthodes d'identification des Listeria

314

S. MANUEL. M. BUTIN,C. AVOYNE

Manipulation 20
M.-L. SORIN

Transia Listeria spp.(références LI 0691, LI 0689
et LI 0694) 318

Manipulation 21
J.-P. LARPENT

Bactéries corynéformes, Brevibacterium

linens

326

Manipulation 22
M . POUMEYROL

Clostridium et Bacillus

338

Manipulation 23
J.-P. LARPENT

Mycobactéries

364

Manipulation 24
M.-B. ROMOND, C. ROMOND

Anaérobies (techniques de culture)

371

Table des matières

XI

Manipulation 25
M. B.ROMOND

Bifidobacterium

: isolement et identification

383 391 397 408

Manipulation 26 Manipulation 27
J.-P. LARPENT

Système d'identification Biolog Les champignons Nutrition soufrée du Saprolegnia monoica Recombinaison génétique par fusion
et transformation de protoplastes

S. MANUEL, M. BUTIN, C. AVOYNE

Manipulation 28
J.-P. LARPENT

Manipulation 29
P. COTTON REYMOND,

410

M . DURAND-POUSSEREAU, M . FÈVRE

Manipulation 30 J.-P. LARPENT Manipulation 31 A. BRETON Manipulation 32
M.GUEGUEN

Atlas des champignons utilisés dans les méthodes d'essais microbiologiques normalisés (NFX 41-500)... 419 Clé de détermination des groupes et genres des moisissures importantes dans les industries agroalimentaires Geotrichum candidum Les levures

441 449 465

Manipulation 3 3
C. CALLON

Manipulation 34 P. MARTINET Manipulation 35 S. DRAGACCI Manipulation 36
L. SCHWARTBROD

Détermination de l'activité antifongique de produits de traitements des bois en phase liquide 473 Recherche des mycotoxines dans les produits laitiers Recherche des virus entériques Conservation des souches 481 490 512

Manipulation 37
G. RIGARD

Troisième partie Quelques problèmes physiologiques
Manipulation 3 8 M.-N. BELLON-FONTAINE Manipulation 39 L. BOULANGÉPETERMANN

Étude de l'adhésion de micro-organismes surfaces solides par sédimentation Corrosion des aciers inoxydables par des produits de nettoyage et/ou de désinfection en industrie
agroalimentaire

521

524

Manipulation 40 B. CARPENTIER

Méthode d'obtention d'un biofilm expérimental sur une surface dite « ouverte »

530

XII

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Manipulation 41
J.-P. LARPENT

Quelques notions sur l'hygiène Contrôle des populations microbiennes Sensibilité des micro-organismes aux antibiotiques Étude de la croissance bactérienne par bioluminescence : dosage de l'ATP Microbiologie et impédancemétrie

535 540

Manipulation 42
J.-P. LARPENT

Manipulation 43
J.-P. LARPKNT

549 554 562

Manipulation 44
M. LARPKNT-GOURGAUO

Manipulation 45
A. HERMANT, A. CROZIKR,

bioMérieux

Manipulation 46
M. LARPKNI-GOURGAUD

Utilisation d'une norme Afnor dans le cas de validation d'un produit en hygiène alimentaire

598

Quatrième partie Microbiologie de l'environnement et des produits alimentaires
Manipulation 47
J. Y. Bo/.io, D. BERTRAND

Eaux polluées Équivalent demande chimique en oxygène par chimiluminescence Les eaux de mer et d'eau douce, suivi sanitaire Le contrôle microbiologique des eaux Dénombrement des bactéries aquatiques
et tests de toxicité

615

Manipulation 48 D. CHAMPIAT Manipulation 49
C. DEI.ARRAS

634 637 660

Manipulation 50
Cn. BARBAI.AT, I. MAGNOL

Manipulation 51
D. CHAMPIAT,
J.-P. LARPENT

673

Manipulation 52 J.-P. LARPENT Manipulation 53 Manipulation 54 Manipulation 55
M. GUII.LOUX-BENATIER,
R. TOURDOT-MARÉCHAL

Les fermentations utilisées dans la production d'aliments fermentes Boissons non alcoolisées Analyse microbiologique des vins... Maîtrise d'un ensemencement de bactéries
lactiques dans le vin

684 693 700

J.-P. LARPENT, P.-J. CHOUETTE

R. TOURDOT-MARÉCHAL, M. GUILLOUX-BENATIER

700

Table des matières

XIII

Manipulation 56

Microbiologie du lait et des produits laitiers

704

J.-P. LARPENT, M.-P. COPIN, A. GERMONVILLE, M. JACQUET, J.-L. THÉTAS, bioMÉRiEux REVUE PAR M . BALFONTAINE

Manipulation 57
Y. VAYSSIER

Préparation de yaourt Préparation des beurres Analyse de fromages - Isolement et identification de levures Étude de Pénicillium roquefortii

806 810

Manipulation 58
V. LAFARGE

Manipulation 59
C. CALLON

812 832

Manipulation 60
J.-P. LARPENT, P. VEAU

Manipulation 61
E. BRACQ

Dosage de l'aspartyl protéinase de Pénicillium roquefortii Analyse des croûtes de fromage Microbiologie des viandes Étude du saucisson sec Analyse physicochimique des viandes fermentées

839 851 860 871 878

Manipulation 62
J.-P. LARPENT

Manipulation 63
J.-P. LARPENT

Manipulation 64 Manipulation 65
M.THIAUDIÈRE

S. BANNARI. J.-P. LARPENT, M. LARPENT-GOURGAUD, O. MICHAUX

Manipulation 66 S. BANNARI, J.-P. LARPENT. M. LARPENT-GOURGAUD,
O. MICHAUX

Analyse de la lipolyse, de la protéolyse et de l'activité acidifiante des micro-organismes responsables de la fermentation des produits carnés 907 Analyse microbiologique des céréales et des légumineuses Analyse des produits végétaux Étude des levains de panification

Manipulation 67
J.-P. LARPENT

912 913 915

Manipulation 68
J.-P. LARPENT

Manipulation 69
J.-P. LARPENT, E. BERVAS

Fabrication de « laits fermentes » de soja et de produits Manipulation 70 J.-P. LARPENT, S. GAUTHIER de type « fromage » à pâte fraîche et à pâte molle 929 Manipulation 71
J.-P. LARPENT, S. GAUTHIER

Fabrication du miso Analyse microbiologique des conserves

939 947

Manipulation 72

J.-P. LARPENT, M. LARPENT-GOURGAUD

XIV

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Manipulation 73 C. DW.ARRAS Manipulation 74 C. DKI.ARRAS Manipulation 75
A. RHYNAUD

Contrôle bactériologique des coquillages (production et consommation) Contrôle bactériologique des algues marines alimentaires et des algues marines micronisées Analyse bactériologique d*un plat cuisiné

961 973 988

Annexes
Normes d'après Afnor Exemples de milieux proposés pour les analyses normalisées Critères microbiologiques de certains produits alimentaires Analyse microbiologique des produits agroalimentaires Adresses utiles Bibliographie Index 1005 1013 1020 1028 1033 1035 1041

Première partie

LA QUALITE

Chapitre

1
LA QUALITÉ AU LABORATOIRE
Maurice Bal-Fontaine

1.

Qualité ?

Le terme qualité a toujours été très utilisé dans les laboratoires, mais actuellement il n'est pas toujours employé avec le sens qu'on lui donnait auparavant, et il semble qu'il y ait parfois confusion. Le sens originel est le même, mais l'objet sur lequel porte la qualité a changé. Au sens ancien, si l'on peut dire, il s'agit de la qualité des produits fabriqués, de leur conformité bactériologique et chimique avec la législation, avec le souci d'innocuité. Le laboratoire par ses analyses est garant de la qualité du produit fabriqué. Le laboratoire était chargé du « contrôle qualité ». Mais actuellement, le terme qualité est appliqué à ce que fait le laboratoire et à la fiabilité de ses analyses. Autour de ce mot qualité gravitent d'autres termes, tels que RNE, Cofrac, accréditation, certification, normes Iso 9 000.

1.1
• Qualité

Définitions

Quelques définitions, tirées de la norme Iso/DIS 8402 (le X 50-120).

« Ensemble des propriétés et caractéristiques d'un produit ou d'un service qui lui confèrent l'aptitude à satisfaire des besoins exprimés ou implicites [...] Les besoins sont habituellement traduits en propriétés et caractéristiques de critères spécifiés. Les besoins peuvent comporter des aspects d'aptitude à l'emploi, de sûreté, de disponibilité, de fiabilité, de maintenabilité des aspects économiques et relatifs à l'environnement [...] Le terme qualité n'est pas utilisé pour exprimer un degré d'excellence dans

4

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

un sens comparatif ; il n'est pas utilisé non plus dans un sens quantitatif pour des évaluations techniques... » • Système qualité « Ensemble de l'organisation, des responsabilités, des procédures, des processus et des moyens nécessaires pour mettre en œuvre le management de la qualité ». • Manuel qualité « Document énonçant la politique qualité et décrivant le système qualité d'un organisme ».

1.2

Le système qualité

D'après ces définitions, nous comprenons que parler qualité dans un laboratoire entraîne tout un environnement de procédures et de moyens. Ceci est décrit dans le Manuel qualité du laboratoire. L'accréditation est la « procédure par laquelle un organisme faisant autorité reconnaît formellement qu'un organisme ou un individu est compétent pour effectuer des tâches spécifiques ». La certification est « la procédure par laquelle une tierce partie donne une assurance écrite qu'un produit, un processus ou un service est conforme aux exigences spécifiées ».

13

Le Cofrac

Le Comité français d'accréditation a été mis en place en juin 1994, prenant la suite du Réseau national d'essais (RNE) et du Bureau national de métrologie (BNM - Fretac), mais qui s'élargit vers d'autres sections. Le RNE, créé en 1979, comprenait une commission sectorielle « Essais et analyses des produits agroalimentaires » depuis 1988. Peu après le Programme 59 « Analyses microbiologiques des produits agroalimentaires » voyait le jour. Demander l'accréditation Cofrac est une démarche volontaire mais tend à devenir une obligation, car beaucoup de demandeurs d'analyses l'exigent. La démarche qualité peut s'effectuer sans la démarche de demande d'accréditation Cofrac. Le Cofrac exige une formalisation de tout ce qui est fait au laboratoire : c'est la mise sous assurance qualité. Il faut apporter la preuve qu'un certain nombre de moyens sont mis en place pour donner confiance. Un audit est fait pour s'assurer : de l'indépendance et de l'impartialité du laboratoire ; que les moyens matériels et humains sont adaptés ; que les méthodes utilisées sont fiables et reconnues ; et que l'assurance qualité est mise en place selon la norme européenne EN 45001 « Critères généraux concernant le fonctionnement des laboratoires d'essais ».

Ces critères généraux sont repris dans un document du Cofrac qui les précisent (doc. 1 002), et le programme 59 ajoute des exigences spécifiques, par exemple l'ap-

La qualité

5

plication de la norme NF V 08-002, décembre 1985, Iso 7218 en cours de révision (projet 1994) « Microbiologie alimentaire - Directives générales pour les examens microbiologiques ».

2.

Exigences à satisfaire

Les principes généraux de l'obtention de la qualité sont dans la norme européenne EN 45001, cités plus haut. Le but d'un laboratoire est l'analyse ; les résultats de cette analyse doivent correspondre à ce qui est réellement dans l'échantillon analysé. On peut énumérer les différents facteurs pouvant agir sur la correspondance entre le résultat des analyses et la qualité réelle du produit : - la conservation de l'échantillon dès sa réception ; - la non contamination lors des manipulations ; - l'utilisation de méthodes reconnues ; - utilisées par un personnel compétent ; - avec des produits et consommables tels qu'ils n'influencent pas le résultat ; - du matériel en bon état et fiable ; - la maîtrise de l'organisation. Tout cela ne peut être atteint que par la volonté de la direction qui donne les moyens. Explicitons tout cela. Les paragraphes suivants peuvent être des amorces de chapitres d'un Manuel qualité.

2.1

Gestion

La maîtrise de cette organisation est décrite dans le Manuel qualité, éventuellement précisé dans un Plan qualité. Le Manuel qualité s'applique à l'ensemble du laboratoire, alors que le Plan qualité se consacre à une section Chimie, ou bien Microbiologie, etc. Si dans un laboratoire on pense facilement aux méthodes d'analyses, on associe rarement la qualité avec l'organisation interne du laboratoire. Cette organisation entraîne un certain nombre de documents. On vient de parler du Manuel, du Plan, mais il y a aussi les procédures (décrivant qui fait quoi, où, quand, comment...), des modes opératoires, et aussi les enregistrements, preuves de ce qui a été fait et par qui. Les documents qu'entraînent le fonctionnement du laboratoire sont archivés et le laboratoire doit maîtriser cette action. Par exemple, apporter la preuve qu'il y a 6 mois, c'était tel milieu utilisé dans telle analyse alors que maintenant est choisi un autre milieu.

6

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Un moyen efficace de contrôler l'efficacité de cette gestion est, partant d'un résultat ancien, de pouvoir tout retrouver : aussi bien les méthodes d'analyses, les milieux utilisés (avec les références du fabricant), les preuves de sa stérilisation à l'autoclave, les délais réels d'incubation des boîtes, le relevé des températures de l'étuve ce jour-là, etc.

2.2

Locaux

Ils doivent être suffisamment spacieux pour un maintien aisé des zones de travail en ordre et propres. Vingt mètres carrés sont recommandés par analyste. Leur conception doit s'inspirer de la « marche en avant », appliquée dans les usines agroalimentaires, évitant le croisement des circuits. Mais, même dans la construction de nouveaux laboratoires, il est très difficile de l'appliquer. Il faut alors définir, un aménagement « spatio-temporel » : ce qui ne peut être séparé dans l'espace l'est dans le temps, en étudiant très attentivement le circuit des flux propres, contaminés, des déchets. Des salles séparées pour la réception, l'analyse, les lectures évitent des contaminations croisées. L'aménagement des pièces elles-mêmes prend en compte, par exemple, la hauteur des placards (jusqu'au plafond pour éviter les nids à poussière). Il faut privilégier les surfaces lisses ou arrondies : sols, murs, plafonds, paillasses, facilement nettoyables, joints. Les tuyauteries ne sont pas apparentes, non seulement pour ne pas être recouvertes de poussières, mais aussi pour éviter les condensations. Les portes et fenêtres fermant hermétiquement évitent les courants d'air. Les aspérités, les divers rebords de matériaux sont à proscrire, pour limiter le dépôt de poussières. Des filtres sont placés pour les systèmes de ventilation. Si le mobilier est facilement amovible (placards, étuves sur roulettes), le nettoyage en est facilité. Il faut prévoir l'entretien régulier aussi bien du lavage des sols (journalier) que du lessivage des murs (annuel, par exemple).

23

Le matériel

Il faut distinguer essentiellement le matériel de mesure et celui d'analyse. Le matériel de mesure (thermomètres, masses, chronomètres, matériel de volumes) doit être contrôlé et raccordé à des étalons dont la traçabilité est assurée. Le laboratoire se doit d'organiser sa métrologie pour le raccordement de ses appareils. Beaucoup de laboratoires de microbiologie n'étaient pas familiers avec ce terme de métrologie et au raccordement d'étalons.

La qualité

7

Voici la définition de la métrologie d'après la norme NF X 07-001 : « Domaine des connaissances relatives au mesurage. Note : la métrologie embrasse tous les aspects aussi bien théoriques que pratiques se rapportant aux mesurages quel que soit le niveau d'exactitude de ceux-ci et quels que soient les domaines de la science et de la technologie. » Selon sa politique financière ou en personnel, son organisation interne, il peut : - être lui-même un SMH (service de métrologie habilité) ; - confier le soin d'étalonnage, de vérification de son matériel à un organisme habilité ; - faire étalonner ses étalons, et lui-même alors fera des étalons de travail avec lesquels il vérifiera son parc de matériel de mesure ; - faire procéder à ce travail par un organisme non habilité mais ayant des étalons raccordés (mais le Cofrac acceptera très difficilement ce cas). Le matériel d'essai doit être suivi et ses caractéristiques contrôlées. Des documents plus ou moins élaborés le permettent. On pourra créer des fiches signalétiques donnant ses caractéristiques, des « fiches de vie » sur lesquelles seront reportées les interventions, les contrôles, vérification ou autres qui ont été effectués sur lui. Une fiche de prescription précisant les opérations à effectuer avec leur périodicité peut être adjointe. Une seule fiche suffit à les remplacer selon les usages de chacun. Le matériel est vérifié régulièrement. Sur ce matériel est inscrit la date de la dernière vérification et celle de la prochaine. La précision et les incertitudes de chaque moyen de mesure sont déterminées et connues. Les tolérances du matériel d'essai sont fixées. Ainsi, on ne demande pas la même précision pour des thermomètres utilisés dans un four à cendres à 550 °C ou dans une étuve pour Escherichia coli. Dans le premier cas, une sonde graduée tous les 5 degrés et précise à ± 5 °C conviendra, mais pour le second, un thermomètre gradué à 0,2 et précis à 0 3 sera nécessaire. Les différentes températures seront enregistrées soit manuellement, soit à l'aide d'un enregistreur. Des procédures décrivent les différentes opérations d'étalonnage, de vérification, de contrôle ou d'entretien et sont portées à la connaissance des utilisateurs.

2.4

Le personnel

Le personnel doit être compétent et la formation joue un rôle important. Avant de manipuler, une « habilitation » doit être prévue. Il doit connaître les risques envers l'environnement et envers lui-même Une formation sécurité sur ce sujet est indispensable. L'effectif doit être suffisant pour réaliser les analyses correctement.

8

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Les postes du laboratoire sont définis : « qui fait quoi » ; en particulier la responsabilité de chacun des postes est bien précisée. Le travail de chaque poste est délimité, sa responsabilité envers le matériel utilisé aussi. Comprend-il le nettoyage journalier, l'entretien hebdomadaire, les vérifications, les étalonnages ? À moins que les emplois du temps permettent facilement de retrouver l'opérateur, celui-ci est amené à « parapher » souvent des relevés d'enregistrement. La confidentialité des résultats : ceux-ci ne doivent être communiqués qu'au demandeur. Aussi, la confidentialité est une obligation pour le personnel, mais se retrouve aussi dans la transmission des résultats ; établir des règles pour le téléphone : qui peut transmettre, à qui et dans quelles conditions. Un responsable qualité doit être nommé. Les relations fonctionnelles et opérationnelles sont à établir clairement.

2.5

Les consommables

Il faut définir les règles du choix des fournisseurs ainsi que celles de réception, d'étiquetage, de contrôle, de conservation, de délai d'utilisation.

2.6

Les analyses

Les méthodes normalisées ou internes sont suivies à la lettre. Pour s'assurer de la fiabilité des analyses qu'il fait, le laboratoire procède à des contrôles internes et participe à des chaînes d'analyses. En interne, des tests dits négatifs (absence de contamination dans les milieux utilisés) et de fertilité (aptitude à la croissance des germes) sont menés systématiquement. S'y ajoutent des analyses en double, deux personnes sur le même produit par exemple, ou le même produit partagé en deux et analysé par la même personne l'ignorant.

2.7

Les échantillons

Les échantillons sont parfaitement identifiés, conservés comme il convient avant analyse. À leur réception, leur état est vérifié et la faisabilité des analyses contrôlée. Des règles d'acceptabilité sont prévues ainsi que la conduite à tenir en cas de non conformité. Souvent le prélèvement n'est pas effectué par le laboratoire ni sous sa responsabilité, cependant il se doit de donner les conseils techniques sur la manière de l'effectuer et de l'envoyer. 2.8 Traçabilité

La norme Iso/DIS 8402 la définit ainsi :

La qualité

9

« Aptitude à retrouver l'historique, l'utilisation ou la localisation d'une entité au moyen d'identifications enregistrées. » La traçabilité est délicate à mettre en place. Plus haut, la formule « qui fait quoi » a été utilisée, et ici, c'est son application : « qui a fait et avec quoi ? ». À partir d'un ancien rapport d'analyse, il faut pouvoir remonter à l'enregistrement de l'échantillon et suivre son analyse, les personnes y ayant participé, les méthodes utilisées, les produits consommés, etc.

2.9

Anomalies, dérogations, réclamations et mesures correctives

Penser que, ayant pris toutes les précautions nécessaires, il ne peut jamais y avoir de déviations, d'accidents, relève de l'utopie. Il faut donc aussi faire en sorte de maîtriser et de remédier à ces dysfonctionnements. Les réclamations venant des clients ou d'autres services rappellent qu'il peut y avoir des failles. Des anomalies peuvent être détectées, et certaines situations peuvent amener à prendre des dérogations. Tout ceci doit faire l'objet de documents écrits, sur lesquels on rappellera la date, les faits et l'action menée. Des procédures décriront le traitement des anomalies, dérogations, réclamations. Des audits internes sont effectués à des fréquences déterminées, pour examiner si les dispositions décrites dans le Manuel qualité ou les procédures sont suivies. Une Revue système, par l'étude des dérogations, anomalies, réclamations permettra de vérifier l'adéquation de ce qui est mis en place avec le but du laboratoire et l'assurance qualité et d'être à l'origine de certaines évolutions.

3.

Aspect international

Dans les échanges internationaux, pour garantir les consommateurs sans que chaque pays revérifie ce qui a déjà été analysé ailleurs, il faut la confiance provenant d'un processus « tierce partie » d'évaluation des laboratoires ayant réalisé les analyses, telle qu'une accréditation. La confiance ne peut exister que s'il existe des critères communs d'appréciation. Des accords de reconnaissance entre organismes nationaux peuvent exister après des audits réciproques sur leur manière de procéder aux accréditations. C'est ainsi qu'une dizaine de pays ont signé un accord multilatéral pour reconnaître l'équivalence de leurs systèmes d'accréditation. Citons la France, l'Angleterre, la Suède, l'Italie, la Norvège, l'Espagne, mais il y en a d'autres et le mouvement continue. Des organismes internationaux tels que l'ILAC (International Laboratory Accréditation Conférence) et européen, le EAL continuant le Western European Testing Laboratory Accréditation Coopération, ont été créés pour harmoniser et favoriser les échanges. Ils étudient les implications commerciales des accréditations, leur pratique et le fonctionnement des laboratoires. Ces instances élaborent des guides qui servent de base aux exigences nationales.

10

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

4.

BPL

Le terme « bonnes pratiques de laboratoire (BPL) » est souvent utilisé aussi, mais là encore, comme pour le mot qualité, il y a ambiguïté. Le Cofrac, en plus de son activité en accréditation, effectue les « inspections BPL ». Et le Groupe interministériel des produits chimiques (Gipc) utilise les résultats pour prononcer la « reconnaissance BPL » d'un laboratoire. Ce référentiel BPL concerne la réalisation d'études non cliniques pour l'évaluation des effets sur l'homme, les animaux et l'environnement, effectuées à des fins réglementaires sur tous les produits chimiques autres que les médicaments et certains produits visés par le code de la santé. Le domaine de ces laboratoires se situe dans la toxicologie, la microbiologie, etc. Les BPL portent par exemple sur la réalisation, la planification, l'enregistrement, le rapport des résultats, l'archivage des brouillons, etc. C'est donc un terme « officiel » qui a un sens précis. Dans Les bonnes pratiques de fabrication, qui est le référentiel pour les fabricants de médicaments, il y a un chapitre concernant les bonnes pratiques de laboratoire. Le terme a sans doute été validé par la FDA (Food and Drug Administration) qui a publié dans Fédéral Rcgister, le 22 décembre 1978, « Non clinical laboratory studies, good laboratory practice régulations). L'OCDE a lui aussi préconisé les « OECD principles of good laboratory pratices » dans l'annexe 2 de la décision du conseil de l'OCDE adoptée le 12 mai 1981. Et des instructions ministérielles françaises y font référence.

5.

Note sur les normes

Lorsqu'on veut rechercher un micro-organisme se pose la question de la méthode : chacun sait que deux méthodes proposant la même recherche risquent fort de ne pas donner le même résultat. Comme la réglementation fixe des teneurs minimales ou maximales, une méthode officielle est préconisée en même temps et obligatoirement appliquée par les services officiels. Mais on trouve ou on trouvait quantités de méthodes : arrêtés officiels, méthodes Afnor ou Iso, ou de certains corps de métiers (Fédération internationale de laiterie, ou Centre technique de la salaison et des conserves de viandes, par exemple). À cela vient s'ajouter que chaque laboratoire a souvent mis au point sa propre méthode. La Communauté Européenne préconise aussi des méthodes. Il y a donc pléthore d'organismes proposant des méthodes. Heureusement des coordinations ont été créées tant au plan national, qu'européen et international. Au plan international, souvent des normes ont été un moyen de protectionnisme, mais les différents accords commerciaux internationaux luttent contre cette tendance.

La qualité

11

5.1

Plan international

L'Iso a été créée en 1926, sous le nom alors de Fédération internationale des associations nationales de normalisation. Il y a aujourd'hui environ 90 pays membres de cette organisation. Elle est composée de comités techniques (TC) avec de nombreux sous-comités. Ainsi le Comité Iso/TC 34 « Produits agricoles et alimentaires » a un sous-comité 5 « Lait et produits laitiers » et un sous comité 6 « Viandes et dérivés ». Le siège de l'Iso est à Genève. Les langues officielles en sont l'anglais, le français et le russe. Les normes ont un numéro chronologique d'édition. Un pays, même membre de l'Iso, n'est pas obligé d'adopter une norme Iso. Les membres de l'Iso ont établi un code avec classe et sous-classe qui apparaît maintenant sur toutes les normes nationales et internationales des membres de l'Iso, permettant de classer les normes par grands groupes sur lesquels tous les pays se sont mis d'accord et qui s'ajoute à la première numérotation : c'est le code ICS.

5.2

Plan européen

L'Europe a mis en place, en 1961, le CEN pour harmoniser les normes d'analyses en Europe. Les langues officielles sont l'anglais, l'allemand et le français. Quand le CEN officialise une norme, chaque pays membre doit alors la faire sienne et abandonner sa norme traitant du même sujet l'application est donc différente de celles des normes Iso.

53

Plan national

Certes une méthode normalisée d'analyse n'est pas d'emploi obligatoire pour un industriel. Cependant il semble difficile de ne pas la pratiquer, si l'on veut parler le même langage que les autres analystes. Sur le plan national, le 6 janvier 1988, un protocole d'accord a été signé entre l'Afnor (Association française de normalisation) et la DGCCRF (Direction générale de la concurrence, de la consommation et de la répression des fraudes) pour l'harmonisation des méthodes d'analyse. C'est ainsi que maintenant, les Arrêtés officiels renvoient aux normes Afnor quand elles existent pour le sujet concerné. L'Afnor a été créée en 1926. C'est une association privée dotée d'un statut officiel. Elle est chargée, entre autres rôles, de coordonner toutes les activités de normalisation. Elle participe au Comité européen de normalisation (le CEN) et à l'Organisation internationale de normalisation (Iso). Avant, chaque commission sectorielle éditait les normes qu'elle estimait nécessaires, ce qui fait que par exemple on avait une norme coliformes pour le lait, une autre pour la viande, une autre pour la gélatine, etc. Maintenant au fur et à mesure de

12

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

l'édition de normes, la tendance en microbiologie est de favoriser les normes dites « horizontales », de préférence aux verticales. C'est-à-dire que la méthode s'applique à tous les produits, sauf démonstration que c'est vraiment indispensable d'en éditer une autre pour le produit concerné. Un autre travail actuel de la commission Microbiologie alimentaire est de mettre au point des méthodes de routine, dont la principale différence d'avec les autres méthodes est souvent de n'utiliser qu'une boite par dilution. Pour la classification des normes, l'Afnor utilise les lettres de l'alphabet, chaque lettre s'appliquant à un champ particulier. Ainsi, les normes V concernent l'agriculture, l'agroalimentaire. Des sous-groupes sont distingués par deux chiffres : ainsi les V 04 concernent les produits laitiers et la viande, alors que les V 08 portent sur la microbiologie agroalimentaire en général. Les normes commençant par V 45 traitent des produits de la pêche. Trois chiffres supplémentaires permettent un classement individuel de la norme Pendant un temps, l'Afnor indiquait si la norme était identique ou équivalente à la norme internationale correspondante. Maintenant dans une tendance vers une plus grande uniformisation internationale, l'Afnor si elle accepte une norme Iso l'intègre dans son recueil et l'appelle par exemple norme NF Iso 7218, reprenant le numéro de la norme Iso, et l'ancienne appellation V 08-002, devient alors l'Indice de classement ou le. Pour les normes européennes, la référence devient NF EN avec le numéro CEN. Mais le CEN s'efforce aussi de prendre les normes Iso quand elles existent. Une norme Iso devenue norme européenne donc française peut avoir une référence un peu compliquée, car rappelant sa généalogie. Exemple, la norme NF EN 29002, Iso 9002, Indice de classement X 50-132, « Systèmes qualité - Modèle pour l'assurance de la qualité en production et installation », sans compter le code ICS !

Chapitre

2
QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE DE TRANSFORMATION DU LAIT
Xavier Rossignol

Sous le terme générique de qualité, plusieurs points ou définitions sont sous entendus. Il est donc important et primordial de définir ce que l'on cherche et de tracer son objectif. L'objectif étant établi, nous pouvons remonter dans la technologie et marquer les points sensibles ou carrefours qui risquent de dévier de l'objectif final souhaité. L'analyse des risques n'est pas le sujet traité (cf. HACCP).

1.

Définition de la qualité
Sous ce terme, trois définitions peuvent être sous entendues :

1.1

Qualité technique

La démarche du technique est d'assurer au produit une garantie jusqu'à sa DLUO (date limite d'utilisation optimale) suivant un cahier des charges précis. Le rôle du technicien est de repérer et d'identifier les causes de dégradations du fromage lors de sa conservation et de sa commercialisation. Le fait de repérer et d'identifier permet de remonter la technologie afin d'évaluer les risques associés aux différents stades du process de fabrication. Le process est une source de risques mais l'élaboration d'un fromage provient d'une matière première qui répond à des critères qualitatifs souvent différents du transformateur. Toutefois, la qualité d'un produit ne se borne pas à sa non-dégradation, l'aspect sanitaire est un aspect important qui souvent n'est pas en relation avec la qualité technique.

14

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

1.2

Salubrité alimentaire

La législation définit des critères bactériologiques suivant le produit. Le rôle du transformateur est de garantir les critères légaux en vigueur. Ces critères concernent les bactéries pathogènes (ex. : Listeria) et les bactéries d'indicatrices de contamination fécale (ex. coliformes). Ces deux types de contaminations identifient le risque. En effet, les bactéries d'indication de contamination fécale traduisent le degré d'hygiène dans l'élaboration du produit tandis que les bactéries pathogènes traduisent la maîtrise du process. Nous distinguons dans le pouvoir pathogène deux types de « mécanismes » : - la toxinogénèse ; - la virulence. 12.1 La toxinogénèse

C'est le processus de production d'une toxine, sécrétée par la bactérie à l'endroit où elle se trouve. Nous distinguons deux types de toxines : - les exotoxincs ; - les endotoxines. 1.2.1.1 Les exotoxines

Elles sont libérées par le micro-organisme dans le milieu. Produites par les bacilles à Gram + (ex. : Clostridium botulinum), ce sont des protéines solubles, souvent thermolabiles avec un pouvoir pathogène élevé. Elles sont responsables d'intoxication 1.2.1.2 Les endotox i nés

Responsables des toxi-infections, ce sont des parties constituantes du corps microbien. Produites par les bacilles à Gram- (ex. : Salnionellci). Elles sont formées de glucides, lipides, polypeptides. Elles sont thermostables et ont un pouvoir toxique modéré. 1.22 La virulence

C'est l'aptitude propre à certains germes à se répandre dans l'hôte et à s'y multiplier malgré les défenses que l'hôte a opposées (ex. : pneumocoques). Les qualités technique et sanitaire sont indissociables même s'il n'existe pas de relation directe entre elles. Le terme général de la qualité est défini suivant des normes.

13

Définition de la qualité par Iso NFX 50-120

« Ensemble de propriétés et caractéristiques d'un produit ou service qui lui confère l'aptitude à satisfaire des besoins exprimés ou implicites ».

La qualité

15

Dans le cadre microbiologique, cette norme englobe les deux points cités plus haut à savoir la réponse à un besoin exprimé par le marché (conservation, distribution, commercialisation...) et des besoins implicites ou sous-entendus à savoir la non-toxicité du produit.

2.

Connaissance de la matière première

La qualité microbiologique (souvent sanitaire) de la matière première est déterminée sur des critères généraux pouvant satisfaire globalement toutes les filières de l'industrie laitière. Le niveau de qualité du lait reflète l'état bactériologique de celui-ci chez le producteur à un moment donné. La qualité du lait arrivant en début de process est aléatoire et peu précise car les délais des moyens de contrôle sont trop longs par rapport aux délais de traitement du lait. En conséquence, trois paramètres sont à prendre en compte pour repérer et identifier l'état microbiologique du lait à l'entrée de l'usine. L'objectif de cet état des lieux permet de trier le lait en fonction des critères recherchés d'évaluation du risque de dégradation et sanitaire du produit.

2.1

Provenance

La provenance du lait permet par rapport à un historique de données d'appréhender son état. En effet, un lait provenant d'un bassin laitier où se situe l'usine possède en fonction des saisons un caractère qualitatif d'une relative constance (méthode d'élevage identique, ramassages réguliers...). Un lait provenant de l'extérieur de cette zone est complètement inconnu car aucune donnée historique ne permet de le qualifier. De plus si ces données étaient connues celles-ci seraient erronées par les conditions de mélange, de traitements physiques, de transports...

2.2

Conditions d'acheminement à l'usine

Ce critère est très important surtout pour des laits extérieurs, la connaissance des paramètres suivants peut permettre d'évaluer et de repérer l'état qualitatif : - température du lait au « dépotage » ; - acidité ; - mélange de différentes zones de ramassage ; - existence de stockages intermédiaires ; - existence de traitements physiques (ex. : traitement thermique) ; - âge moyen. 23 Âge

Le lait étant un très bon milieu de culture, le développement microbien est étroitement lié à l'âge du lait : c'est-à-dire au temps écoulé entre la traite et sa transforma-

16

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

tion. Les conditions de traite et de ramassage couplées à l'âge du lait peuvent faire varier fortement l'état bactériologique.

2.4

L'état physique et bactériologique

Cet état est la résultante de la provenance, des conditions d'acheminement à l'usine et de l'âge du lait. Le transformateur face à tous ces paramètres inconnus ou mal évalués a recours à des procédés technologiques adaptés aux critères du produit recherché.

3.

Connaissance du process : maîtrise

Le process employé dans l'élaboration d'un produit doit permettre la maîtrise des risques de contaminations ou de recontaminations tant de la matière mise en œuvre que du produit. Cette maîtrise du risque se situe à quatre niveaux :

3.1

Le matériel

Le matériel doit être adapté à la technologie employée et à l'objectif final recherché. Exemple : - M a l utilisé, il est le siège de contaminations d'ordre hygiénique (nettoyage...) et d'ordre sanitaire (couple temps température mal adapté ou non respecté...). - Peu maîtrisé (ex. : manque de sonde pH, de sondes température...), la qualité du produit par rapport aux critères établis est aléatoire et imprévisible. - Mal adapté, ex. : conditionnement d'un produit fragile (produits frais) en atmosphère non contrôlée.

3.2

L'environnement

Des règles simples et provenant du bon sens permettent de limiter la recontamination du produit en phase d'élaboration. En partant du principe que plus la matière est transformée plus celle-ci est propre, une marche en avant du processus s'impose. Le produit ne doit pas être en contact avec d'autres productions plus recontaminante (ex. : séparer la fabrication d'un fromage au lait cru d'un fromage pasteurisé ou commencer par la fabrication du fromage en lait pasteurisé pour finir par la fabrication d'un fromage au lait cru si les ateliers ne sont pas séparés). Les sous produits résultants de la transformation, souvent source de recontaminations doivent être évacués et stockés dans un endroit éloigné de l'atelier (lactosérum par exemple). L'atelier doit répondre à des normes spécifiques d'hygiènes (carrelage, points d'eau...). L'élaboration d'un fromage fait appel à différents process schématisés comme suit : traitement du lait, transformation du lait, salage ou conditionnement, affinage ou stockage. Afin d'éviter les risques de recontaminations dans la succession des

La qualité

17

étapes, un cloisonnement de chaque étape doit être réalisé (on ne fait pas tout dans le même atelier !).

33

Le personnel

Celui-ci doit être formé, sensibilisé et motivé sur l'hygiène. Il doit connaître les points faibles du process et de la technologie afin d'être encore plus vigilant. Il doit être formé au matériel et à son environnement pour que la technologie réalisée soit conforme à l'objectif fixé et attendu.

3.4

La technologie

Celle-ci doit être établie en fonction de l'évaluation des risques du produit qui sont dépendants « des besoins exprimés et implicites ». La maîtrise de la transformation de la matière première est importante mais non suffisante car dans l'élaboration d'un produit laitier, l'industriel a besoin d'adjuvants ou d'auxiliaires de fabrication. Cette « matière secondaire » peut être une source de contamination ou de recontamination. Lorsque celle-ci subit des traitements adéquats et prévus dans la technologie le risque est réduit surtout si les points cités plus haut sont appliqués. Il est envisageable que certains auxiliaires ou adjuvants ne puissent pas supporter la technologie (ex. : traitement thermique des enzymes coagulantes). Des contrôles supplémentaires doivent être réalisés sur les lots mis en œuvre. Généralement cela est possible car les résultats bactériologiques sont connus avant l'utilisation de cette matière secondaire. Si ce n'est pas le cas, la technologie doit être modifiée pour minimiser les risques microbiologiques (techniques et sanitaires) en fonction des critères recherchés. La technologie employée doit répondre à l'objectif souhaité. Il n'est pas rare de modifier une technologie afin de réduire les risques sanitaires (Listeria) et/ou de satisfaire une demande commerciale (ex. : augmentation de la DLUO). Une technologie n'est jamais fixée, elle fluctue en fonction de l'évolution de la consommation et des critères bactériologiques légaux. Une technologie doit être adaptée au produit à fabriquer. Pour cela une connaissance du produit est nécessaire et impérative.

4.

Connaissance du produit

Par rapport au sujet traité, la connaissance du produit se focalise sur son aptitude à développer une croissance microbienne ou à favoriser tel ou tel agent d'altération ou sanitaire. Enfin de déterminer un niveau de population qui répond à nos préoccupations de qualités (définies au préalable). Cette « écologie » microbienne dépend des facteurs suivants : 4.1 « Autoprotection »

Aptitude du produit à limiter une croissance microbienne. Dans ce domaine, nous distinguons deux niveaux :

18

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

4.1.1

Physicochimique

pH, a„. Les pH acides et les aw basses réduisent voire inhibent le développement microbien. aw est déterminée par : - l'extrait sec (ES) du produit. Les poudres de lait ne favorisent pas le développement microbien ; - la teneur en sel : le sel est depuis longtemps connu comme un moyen efficace de conservation (inhibition du développement microbien). Le pH acide inhibe le développement bactérien mais réduit aussi l'activité enzymatique. Les enzymes sont issues de la lyse bactérienne. Cet aspect sera évoqué au paragraphe 5. 4.12 Bactériologique

Dans un produit, tel que le fromage coexistent les germes qui proviennent de la matière première et des ferments lactiques apportés. Ces ferments sont indispensables dans l'industrie laitière pour : - la coagulation et l'arôme ; - l'égouttage des fromages ; - la fabrication du beurre. Des interactions favorables (synergie) ou défavorables (antagonisme) interviennent. La maîtrise de ces interactions permet d'assurer au produit une protection dite lactique. - Une bonne activité des ferments lactiques empêche le développement des germes de gonflement (coliformes). - Une bonne activité des streptocoques lactiques favorise le démarrage des lactobacilles qui prennent le relais dans l'acidification de certains produits (yaourt...). - Une bonne activité protéolytique des lactobacilles dans les pâtes cuites favorise le développement des bactéries propioniques. - Certaines bactéries produisent des substances bactériostatiques. - Le développement de ferments lactiques se traduit par des modifications du milieu (pH, potentiel redox, diminution des teneurs en lactose...) ou favorise l'implantation d'autres groupes de germes utiles dans la protection du produit (le développement des microcoques favorise l'implantation des Corynebacteria sur la croûte du fromage). Dans le cas des desserts ou produits assimilés l'ensemencement en ferments lactiques n'est pas recherché, il n'existe pas de protection lactique ni de protection physique. Pour remédier à ce manque, le choix d'une technologie adaptée a donc été nécessaire : emploi de la stérilisation, ingrédients stérilisés, conditionnement sous ambiance stérile, emballage étanche aux micro-organismes.

La qualité

19

4.2

Composition

L'autoprotection physicochimique et bactériologique est la résultante de la composition du produit. Cette composition répond à des critères organoleptiques et commerciales. Elle dépend de la technologie et du process employé. Généralement, la composition d'un produit (physicochimique et bactériologique) n'est pas suffisante pour assurer au cours du temps une garantie sanitaire et de non altération. C'est pourquoi les points 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 dépendent étroitement de la composition du produit.

43

Emballage

L'emballage sera d'autant plus sophistiqué que le produit a un niveau d'auto-protection faible.

4.4

Durée de vie souhaitée

La durée de vie du produit est dépendante du niveau de population de germes et de leur faculté à se développer.

4.5

Chaîne du froid dans l'entreprise

Un produit à faible protection (desserts) ou à population microbienne très élevée doit être stockée au froid le plus rapidement possible pour éviter le développement de germes indésirables (germes acidifiants, levures, germes pathogènes...) ou à activité excessive des ferments lactiques qui altérerait le produit du point de vue organoleptique (yaourt...). De plus un stockage prolongé dans l'entreprise réduit le temps de commercialisation pour une DLUO donnée.

4.6

Circuit de distribution

Si la maîtrise de la chaîne du froid à l'extérieur de l'entreprise n'est pas certaine, il faut repérer et identifier les causes supplémentaires de dégradation afin d'évaluer des risques supplémentaires au niveau de la matière première, du process et de la technologie. Un plan qualité dans l'élaboration d'un produit laitier dépend beaucoup plus du devenir du produit hors de l'entreprise que du produit lui-même. C'est pourquoi, le chapitre suivant sera développé.

5.

Relations matières premières - process - produit

Tout au long des quatre sous parties précédentes a été situé le cadre dans le lequel les critères qualitatifs définis évoluent pour un produit donné. Nous définissons ainsi qu'il n'existe pas de règle universelle pour gérer la qualité d'un process.

20

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

La connaissance approfondie du produit génère le plan minimum et incontournable du suivi qualité (technologique et sanitaire) de la matière première et du process.

5.1

Identifier le risque produit

L'identification du risque produit vise à prévoir la croissance, la survie ou la destruction des micro-organismes importants dans les aliments afin de préciser le temps pendant lequel la sécurité et la qualité microbiologique sont garantis. 5.1.1 Altération

Généralement, la prévision de la microbiologie prédictive détermine une DLUO du produit (déterminée par des tests au laboratoire : recherche des causes de vieillissement accéléré d'un produit). Face à la pression du marché, cette DLUO est déterminée par le dialogue commercial. Le technicien est chargé de garantir la fraîcheur du produit en évitant une prolifération microbienne. Pour cela, il doit : - connaître la source des micro-organismes constituants le produit : - lait - levains - contamination -caractériser leur environnement (t °C,pH,a w , pression osmotique...) ; - identifier le ou les micro-organismes qui limitent la durée de vie du produit. La population la plus importante dans un groupe donné n'est pas toujours responsable d'une dégradation excessive ; - évaluer le potentiel enzymatique de son produit et l'origine ; - fixer le niveau de contamination tolérable en un point de la chaîne en fonction de la tolérance en bout de chaîne. 5.12 Sanitaire

Le niveau sanitaire est généralement établi par la réglementation. Cet aspect législatif est souvent donné pour une denrée alimentaire sortie usine. Depuis quelques années, la vie « commerciale » du produit est de plus en plus longue, c'est pourquoi, ces normes doivent être garanties jusqu'à la DLUO du produit. Cela pose le problème de la pertinence de la méthode employée pour rechercher un germe (absence dans 25 g ou dans 1 g, fiabilité, précision...). En effet, le technicien n'étant plus maître de son produit à l'extérieur de l'entreprise, il doit se reposer sur la fiabilité de l'analyse microbiologique afin d'assurer à la denrée alimentaire un niveau sanitaire optimal à DLUO.

5.2

Connaître les sources de contaminations et leurs implications sur l'altération du produit et sur la salubrité du produit

Dans cette situation, le technicien doit passer en revue toutes les causes possibles d'altération de son produit en répondant oui ou non à toutes les questions posées. Le

La qualité

21

but de cette démarche est de créer une check-list des raisons susceptibles de dégrader son produit. À cette liste, il positionne les points possibles dans l'élaboration de son process responsables de ses préoccupations. Le technicien doit préciser à quel moment l'état microbiologique du produit a été élaboré afin de pouvoir le cas échéant remonter à un point précis du process et non à la source.

53

Préciser la nature des micro-organismes

Il faut dans cette démarche différencier les agents d'altération, de contamination et pathogènes car le raisonnement ne peut être global. Il est spécifique à chaque agent. 53.1 Agents d'altération

Plutôt liés à la technologie ou recette employée (association de ferments non pertinente, activité fermentaire trop élevée...) et à la matière première (présence de sporulés, stock enzymatique important (psychrotrophes). 532 Agents de contamination

Plutôt liés au process et à la matière première : hygiène (coliformes, entérobactéries...). 533 Agents pathogènes

Plutôt liés à la matière première et à la manipulation humaine. Souvent un process favorise la prolifération de l'agent mais il ne contamine que rarement sauf si les problèmes d'hygiène sont importants.

5.4

Évaluer les facteurs de développement de contamination

Ce point est important car il définit le comportement du produit hors le site de production. 5.4.1 Par rapport à la matière première

Un développement important des psychrotrophes dans le lait (âge avancé, froid entre 6 °C et 9 °C, lait peu chargé en ferment lactique...) entraîne l'apparition d'un stock de lipases et de protéases thermorésistantes important. Le produit issu de ce lait peu devenir rance ou être amer alors que toutes les conditions microbiologiques voulues sont atteintes. La charge en sporulés doit être connue car son niveau de population ou la température de stockage du produit induisent un développement de ces germes. Si le lait doit être travaillé en cru (absence de traitement thermique) celui-ci doit être exempt de pathogènes... 5.4.2 Par rapport au process

Le process et/ou la technologie doit être raisonné pour éviter la prolifération d'un agent de contamination soit par voie biologique (occupation du milieu, acidification

22

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

rapide, traitement thermique, hygiène maîtrisée...) soit par le process proprement dit (matériel adapté à la technologie). 5.4.3 Par rapport au produit

La composition physicochimique et bactériologique permet de prévoir des moyens de contrôles pour repérer et identifier les causes de dégradations. Globalement, plus le produit est fragile (aw élevée, taux de sel faible, pH élevé, population microbienne apportée et revivifiable faible...), plus les points de contrôle sur toute la chaîne seront importants, plus le process et la technologie seront complexes. La fragilité du produit se caractérise par son aptitude à développer un germe ou un groupe de germes pathogènes ou non au cours de temps. C'est la combinaison induite ou voulue entre la physicochimie du milieu et le niveau de population de germes sélectionnés qui assureront à la denrée une confiance sanitaire et un bon maintien organoleptique au cours de sa DLUO. Un dépassement de la DLUO et/ou une chaîne du froid fluctuante aura peu d'incidence sur le produit si celui-ci allie composition et bactériologie adaptées. 5.4.4 Par rapport au circuit de distribution

Deux paramètres essentiels sont à connaître : les conditions de stockage de la denrée et le circuit de distribution. Ces données permettront de repérer et d'identifier d'autres facteurs.

6. 6.1

Exemple sur fromage frais Description produit
- lait concentré pasteurisé emprésuré ; - pas de flore sélectionnée apportée ; - pH = 6,60 ; - matière sèche : 30 % ; - faiblement salé (< 1 %).

6.2
-

Détermination des risques
lait concentré : riche en facteurs de croissance ; lait emprésuré : traitement thermique modéré afin de pouvoir coaguler ; pH : élevé : aucune protection acide et activité enzymatique élevée ; EST faible : aw élevée ;

Produit fragile par sa composition :

- teneur en sel négligeable : pression osmotique faible ; - absence de flore sélectionnée : pas de protection lactique (occupation de milieu). Nous sommes en présence d'un produit extrêmement fragile. Sa DLUO ne devra pas dépasser 30 jours et le plan de contrôle tout au long de la chaîne doit être sévère.

La qualité

23

Une recontamination très légère peut atteindre un niveau très élevé en fin de cycle de produit. La maîtrise de la qualité sera l'aptitude à limiter la croissance de la flore apportée par le lait et à éviter toute recontamination (hygiène et manipulation humaine).

63

Étude de schéma de fabrication

Pour tracer une technologie, il faut préciser la nature des micro-organismes susceptibles d'altérer le produit et les sources de contamination. Les facteurs de développement des germes dans notre exemple sont tous réunis. Nous distinguons : 63.1 Agents Nature Flore importante d'altération Risques Protéolyse, Acidification, Exsudation Moyens Lait faiblement chargé en germes (tri par l'âge du lait et par la connaissance des zones de collecte). Pasteurisation + traitement thermique en cours de process. Vérification population produit. Matières secondaires : faiblement chargée en germes et/ou traitement thermique à appliquer. Chaîne du froid : sévère (dans et hors l'entreprise). Type de micro-organismes dans le lait, charge en psychrotropes faibles (tri, âge du lait, température stockage). Tri du lait sur la charge en Clostridium tyrobutyricum et des matières secondaires sur ce critère. Utilisation de la bactofugation. Stockage du produit en cours d'élaboration limité voire inexistant. Chaîne du froid : sévère (dans et hors entreprise). Traitement thermique du produit avant emballage. Emballage sous enceinte contrôlée. Emballage stérile et operculage contrôlé.

Activité enzymatique Thermorésistants (Sporulés)

Rancissement Protéolyse Gonflement

Levures et moisissures

Retour produit Goût de moisi

24

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

63 2

Agents de contamination Nature Risques
Protéolyse Mauvais goût Hors critères légaux

Moyens
Traitement thermique. Recontamination par le process ou l'eau. Contrôle du nettoyage et de la désinfection. Nettoyage avant le départ du process et en cours du process. Si le risque est important, augmenter les fréquences de nettoyage et de désinfection en cours de process. Respecter la marche en avant. Limiter le contact du produit avec tous les agents extérieurs (air, eau, personnel...). Contrôle de l'hygiène. Matériel adapté (absence de zones non accessibles aux produits de nettoyage...). Sensibilisation du personnel sur l'hygiène.

Entérobactéries

Coliformes

Gonflement Mauvais goût hors normes

633

Agents Nature

pathogènes Risques Sanitaires Moyens Choix des matières (tri). Contact produit-personnel : inexistant. Traitements thermiques bien appliqués sur la matière première et au cours du process pour les adjuvants (sel...). Aucune tolérance admissible.

Tous définis sur ce type de produit

Chapitre

3
LES ANALYSES BACTERIOLOGIQUES RÉALISÉES DANS LE CADRE DES SYSTÈMES AUTOCONTRÔLES EN AGROALIMENTAIRE
Éric Dromigny

Il existe à l'heure actuelle deux sortes d'autocontrôlés en agroalimentaire conduisant à la réalisation d'analyses bactériologiques : - L a première sorte correspond à l'autocontrôlé bactériologique des denrées alimentaires d'origine animale, comprenant des analyses bactériologiques des aliments, ou « analyses de routine », telles qu'elles doivent être réalisées dans le cadre de l'arrêté ministériel du 21 décembre 1979, fixant les critères microbiologiques de certaines denrées alimentaires. Ce type d'autocontrôlé (ou contrôle réalisé par le producteur) est fondé sur la vérification de la conformité de l'aliment à des critères microbiologiques, déterminée par voie d'arrêtés ministériels et interprétés dans le cadre de plans d'interprétation. - L a deuxième sorte correspond à l'autocontrôlé hygiénique et de conformité devant être réalisé dans les entreprises agroalimentaires, dans le cadre général de la directive CEE concernant l'hygiène des denrées animales ou d'origine animale. À côté de dispositions concernant les bonnes pratiques de fabrication et d'hygiène, les textes réglementaires français pris pour transposition de cette directive imposent aux professionnels d'avoir recours à certaines analyses bactériologiques, notamment pour vérifier la conformité de la fabrication aux règles d'hygiène.

26

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

1. 1.1

Bases réglementaires des autocontrôles L'autocontrôlé bactériologique des denrées alimentaires d'origine animale

Deux arrêtés ministériels principaux définissent les conditions de l'autocontrôlé bactériologique des denrées alimentaires d'origine animale : - l'arrêté ministériel du 21 décembre 1979 ; - l'arrêté ministériel du 30 mars 94. /././ L'arrêté ministériel du 21 décembre 1979

Son titre est : Critères microbiologiques auxquels doivent satisfaire certaines denrées animales ou d'origine animale. Dans l'article 1er de cet arrêté ministériel, il est précisé que : - Pour être reconnues propres à la consommation, les denrées animales ou d'origine animale, ci-après énumérées, doivent satisfaire aux critères microbiologiques fixés au présent arrêté et vérifiés selon les dispositions décrites en annexe. En outre, elles doivent être exemptes de micro-organismes ou toxines dangereux pour la santé publique. Ces denrées animales ou d'origine animale sont les suivantes (pour ne citer que les principales) : - Viandes de boucherie ; -Viandes hachées à l'avance, viandes cuites, produits de charcuterie, quenelles, plats cuisinés à l'avance, potages déshydratés ; - Viandes de volaille ; - Produits de la pêche ; - Ovoproduits, pâtisseries, crèmes pâtissières ; -Laits fermentes (yaourts, kefir) laits gélifiés, fromages frais pasteurisés, crèmes fraîches pasteurisées, glaces et crèmes glacées, caséines et caséinates ; - Conserves à base de denrées animales ou d'origine animale ; - Semi-conserves à base de denrées animales ou d'origine animale ; - Graisses animales. Pour ces denrées animales ou d'origine animale, le producteur devra donc vérifier la conformité de son produit aux critères énoncés dans l'annexe de cet arrêté ministériel. Pour cela, les méthodes utilisées seront obligatoirement celles qui figurent aussi dans cette annexe. De plus, les résultats devront être interprétés grâce à un plan d'interprétation, figurant aussi en annexe.

La qualité

27

1.12

L'arrêté ministériel du 30 mars 94

Il est relatif aux critères microbiologiques auxquels doivent satisfaire le lait et les produits laitiers. Il est construit à la manière de l'arrêté ministériel du 21 décembre 1979, mais les critères seront différents sur certains points car ils seront adaptés aux produits laitiers.

1.2

L'autocontrôlé hygiénique et de conformité

Les bases de cet autocontrôle ont été jetées par la directive CEE 93/43, dite la directive hygiène, car son champ d'application est la mise en place de mesures d'hygiène pour les denrées animales ou d'origine animale, pour assurer la sécurité de ces denrées. À côté de ces mesures, ce texte met en place un système d'autocontrôlé fondé sur l'analyse des risques et des points critiques pour leur maîtrise (ARPCM) et sur la mise en place de procédures de sécurité. Nous donnerons ici les éléments mis en place par la directive hygiène accompagnés d'un bref commentaire. 12.1 Extrait de la directive hygiène

Les entreprises du secteur alimentaire identifient tout aspect de leurs activités qui est déterminant pour la sécurité des aliments et elles veillent à ce que des procédures de sécurité appropriées soient établies, mises en œuvre, respectées et mises à jour en se fondant sur les principes suivants qui ont été utilisés pour développer le système HACCP (analyse des risques, points critiques, pour leur maîtrise) : - analyser les risques alimentaires potentiels d'une opération menée dans le cadre des activités d'une entreprise du secteur alimentaire ; - mettre en évidence les niveaux et moments (les « points ») de l'opération où des risques peuvent se présenter ; - établir quels points parmi ceux qui ont été mis évidence sont déterminants pour la sécurité alimentaire (les « points critiques ») ; - définir et mettre en œuvre des procédures de vérification et de suivi efficaces au niveau de ces points critiques ; et -revoir périodiquement, et à chaque modification de l'opération menée dans le cadre de l'entreprise secteur alimentaire, l'analyse des risques alimentaires, les points de contrôle critiques, ainsi que les procédures de vérification et de suivi. 122 Commentaires des dispositions de la directive hygiène

Ces dispositions ont été prises dans le cadre de la CE, le législateur considérant que la libre circulation des denrées alimentaires est une condition préalable essentielle de l'achèvement du marché intérieur.

28

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Elles font référence au système « HACCP » mais sans le rendre obligatoire : on s'est seulement inspiré des principes du système « HACCP » pour établir les différentes étapes de l'autocontrôlé La nature des risques analysés est sanitaire car ce principe implique la confiance dans le niveau de sécurité des denrées alimentaires destinées à la consommation humaine mises en libre circulation, et en particulier dans leur niveau d'hygiène, à tous les stades de la préparation, de la transformation, de la fabrication, du conditionnement, du stockage, du transport, de la distribution, de la manutention et de la vente ou mise à disposition au consommateur. Les risques sanitaires sont une préoccupation majeure, et il importe d'assurer la sécurité et la salubrité des denrées animales ou d'origine animale.

2.

L'autocontrôlé bactériologique des denrées alimentaires d'origine animale : réalisation

Nous ne séparerons pas ici les éléments relatifs à l'arrêté ministériel du 21 décembre 1979 de ceux relatifs à l'arrêté ministériel du 30 mars 94, sauf pour détailler les éléments les plus spécifiques concernant les produits laitiers. Les éléments que nous présentons ici sont volontairement simplifiés pour faire ressortir les éléments principaux. 2.1 2.1.1 Principe Recherche ou dénombrement de bactéries pathogènes

Les bactéries pathogènes (c'est-à-dire capables de provoquer une maladie chez le consommateur des denrées animales ou d'origine animale) recherchées ou dénombrées à l'heure actuelle sont essentiellement les Salmonella, les anaérobies sulfitoréduetcurs 46° C (pour Clostridium perfringens : bacilles Gram + anaérobies stricts, commensaux de l'intestin, telluriqucs, réduisant les sulfites en sulfures. Ils existent sous forme sporulée très résistante) et Staphylococcus aureus pour l'ensemble des denrées animales ou d'origine animale. Dans le cas particulier des produits laitiers, on recherchera aussi Listeria monocytogenes et on dénombrera les Streptocoques P-hémolytiques 2.12 Dénombrement de bactéries tests d'hygiène générale

Les recherches de bactéries pathogènes étant insuffisantes pour dépister les fautes d'hygiène, un certain nombre de tests indicateurs de l'hygiène générale de l'aliment ont été mis en place. Ce sont : - l e dénombrement de l'ensemble des micro-organismes aérobies cultivant à 30 °C (appelés souventy7ore totale) ; - le dénombrement de bactéries tests de contamination fécale dites Coli formes fécaux.

La qualité

29

En effet, une contamination fécale fera toujours soupçonner la présence de pathogènes, tels que Salmonella ou E. coli ou des virus intestinaux. Ce sont des Entérobactéries fermentant le lactose avec production de gaz à 44° C. E. coli leur est parfois préféré car plus spécifique de la microflore fécale. Pour les produits de la mer, on dénombre aussi les Streptocoques fécaux (Entérocoques). Les Streptocoques fécaux sont des commensaux de l'intestin de recherche plus difficile que les Coliformes mais qui résistent mieux dans le milieu extérieur que les Coliformes, notamment en milieu salé. Les Coliformes, eux, sont des Entérobactéries fermentant le lactose avec production de gaz à 37 °C. Ils sont significatifs de contamination par l'environnement.

22

Méthodes

L'ensemble de ces méthodes est normalisé pour assurer la reproductibilité des résultats. 22.1 Prélèvement

Il doit bien sûr être stérile. Le transport se fera au froid pour limiter les multiplications. 5 échantillons par lot de denrées animales ou d'origine animale seront prélevés, quelle que soit la taille du lot. 222 Préparation de l'aliment

Chaque échantillon subira des dilutions successives de façon à permettre le dénombrement. Pour un aliment liquide comme l'eau ou le lait, on procédera directement. Pour un aliment solide comme la viande, on procédera au broyage de l'aliment solide dans un liquide stérile pour le mettre en suspension. 223 Milieux utilisés

Les dénombrements effectués et la technique utilisée sont définis dans l'arrêté ministériel. Recherche ou dénombrement Micro-organismes aérobies (30 °C) Streptocoques fécaux Anaérobies sulfitoréducteurs à 46 °C Staphylococcus aurens Salmonella Milieux utilisés Gélose pour dénombrement ou PCA (dénombrement direct) Bouillon de Rothe et Litsky Gélose de Slanetz (pour les surfaces) Milieu Tryptone Sulfite Cvclosérine Milieu de Baird-Parker Enrichissement sur bouillon au sélénite ou au tétrathionate. Isolement sur gélose au vert brillant et rouge de phénol et une autre gélose éventuellement.

30

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Nous ne donnerons que quelques exemples de milieux dans le tableau précédant, en rappelant au préalable que ces milieux sont pour la plupart sélectifs et permettent d'orienter l'identification des bactéries recherchées.

23

Résultats et interprétation

Les résultats sont interprétés en fonction de critères et selon des plans d'interprétation. Nous ne présentons ici que les critères les plus importants.

23.1

Critères
Microorganismes aérobies 30 °C 'g 500(3) 50000 (31 Coliformes 30 "C Coliformes fécaux S.aureus Anaérobies sulfitoréducteurs 46 T 'g Salmonelle dam 25 g

AM 21 décembre 1979

/g

'g

/g

Carcasses ou coupes de demigros, réfrigérées ou congelées ( 1 ) Pièces conditionnées sous vide ou non. réfrigérées ou congelées ( 1 ) Portions unitaires conditionnées réfrigérées ou congelées et portions unitaires du commerce de détail réfrigérées ou congelées (2)"

2

Absence Absence Absence

-

100 300 100

2 10

( 1 ) Le prélèvement est effectué en profondeur, après cautérisation de la surface. (2) Le prélèvement concerne profondeur plus surface sans cautérisation. (3) Seules les tolérances de caractère analytique sont acceptées (plan à deux classes). Viandes hachées à l'avance ou à la demande (AM 28/9/1989) Plats cuisinés à 1 avance. escargots préparés, pièces de viandes cuites tranchées ou non Produits de charcuterie crus, hachés : Soumis à dessiccation et à consommer en l'état A consommer après cuisson Produits de salaison crus salés et/ou séchés, tranchés ou non Produits de charcuterie cuits, tranchés ou non quenelles Jambon cuit entier Potages déshydratés 500000 300000 1000 50 £.co/i (M = 30liq) 100n = 5 C=l I0n = 5 C= l Absence Absence

10

100

30

(2)

"(3) 300000 (2)(3) 10000 300000

» "
1000

100
1000 1000

300
1000

50 100 50 30
Absence

Absence Absence Absence Absence Absence Absence

500 100
Absence

10
Absence

10
1000

10

100

30

( 1 ) Tolérance prévue en annexe comprise. (2) Pour les pâtes farcies du type ravioli, cannelloni, lasagne, les quenelles et les plats cuisinés auxquels est incorporé du fromage, ce critère doit être interprété. (3) Pour les produits de charcuterie conditionnés sous pellicule plastique et sous vide, le critère relatif aux micro-organismes aérobies 30 °C soit 300 000 par gramme ne s'applique qu'au stade de la fabrication (usine).

La qualité

31

AM 21 décembre 1979

Microorganismes aérobies 30 "C

Coliformes 30 °C

Coliformes fécaux

5.aureus

1%
Volailles entières réfrigérées, congelées ou surgelées *C = 1 Rôtis, escalopes et paupiettes crus, panés ou non Rôtis cuits, entiers ou tranchés et paupiettes cuites ou précuites Viande crue séparée mécaniquement Viande cuite séparée mécaniquement Viande crue séparée mécaniquement traitée par rayonnements ionisants (2) (3)

* » -

/g

/g

Anaérobies sulfitoréducteurs 46 °C 'g

Salmonelle dans 25g

»
500000 300000 1000000 300000

1000

• •
500 100
100O

•'

*Abs. dans 25 g (musc, pect.) Abs.dans 1 g (1) Abs.dans 25 g Abs.dans 1 g

30

1 0
5000

10 100
30

(U

10

100

Abs. dans 25 g Abs.dans 25 g

10000

u

50

1 0

1

(1) (2) (3) (Arrêté du 5 mars 1985, art. 2) « Seules les viandes crues séparées mécaniquement répondant aux critères miaobiologiques les rendant propres à la consommation , à l'exception de ceux visant les salmonelles, pourront être traitées parrayonnementionisant conformément aux dispositions réglementaires en vigueur. »

Pour les produits laitiers, ces critères présentent des différences :
Arrêté ministériel 30 mars 1994 Ikteria monocytogènes (6) dans 25 g Sahnonella spp. (6) S. aureus (7) 30 "C (7) Coliformes Streptocoques 0-hémolytiques (8) dans 0,1 ml Absence n = 5C = 0
m= 50000

Teneur en germes a 21 "C(7)

Teneur en germes à 30 °C

dans 25 g Absence n = 5C = 0

/ml
m = 100 M = 500 n=5C=2

/ml
m =100 M=1000 n=2C=2 m=0 M=5 n=5C=l

/ml

/ml
<50000 (3)

Lait cru de vache dest. à cons. en l'état Lait pasteurisé Absence n=SC=0

Absence n=5C=0

M = 10m n=5
C = 1 (4) < 10 pour 0,1ml

Lait stérilisé

E. coli Fromages à pâte dure au lait traité thermiquement Absence dans 1 g n=5C=0 Absence n=5C=0

32

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Arrêté ministériel 30 mars 1994

Listeria monocvlogeirn 16) dans 25 g Absence n=5C=0

Salmonella spp. (6)

S. aurais (7) 30 "C(7)

Conformes

dans 25 g Absence n=5C=0

/ml
m=IOO M=IO00 n = 5C = 2 m =10 M= 100 n=5C=2

/ml
m=IOO M = I000 n=5C=2 m=0 M=I0 n=5C=2 m=0 M=5 n=5C=2

Streptocoques (5 hémolvtiimes (8) dans 0.1 ml m=IOO0O M = l0m n=5 C=2

Teneur en germes à 2PCI7I

Teneur en germes à 30 °C

/ml

/ml

Fromages à pâte molle au lait traité thermique ment Pourdre de lait

_

Absence n=10C = 0 Absence dans 1 g n=5C=0 Absence n=5C=0

Produits liquides à base de laits traités thenniquement et fermentes

-

_

_

-

En particulier, ces critères comprennent Listeria monocytogenes, qui comme pour les Salmonelles, s'exprime par : absence dans 25 g ou ml de produit. 232 Plans d'interprétation

Les plans d'interprétation sont au nombre de deux : le plan d'interprétation à deux classes est destiné aux critères Salmonelles et Listeria monocytogenes. Cela veut dire que si un seul échantillon sur 5 contient des Salmonelles (ou Listeria monocytogenes pour les produits laitiers), l'ensemble du lot n'est pas satisfaisant.
ABSENCE DE SALMONELLES DANS 25 g ou Listeria monocytogenes PRÉSENCE DE SALMONELLES DANS 25 g ou Listeria monocytogenes

LOT SATISFAISANT

LOT NON SATISFAISANT

PLAN D'INTERPRÉTATION À DEUX CLASSES

Le plan d'interprétation à trois classes comprend une classe intermédiaire (lot acceptable) si deux échantillons au plus donnent des résultats supérieurs à 3 fois le critère mais inférieur à 10 fois le critère. On dit que C = 2 (m étant la valeur du critère présentée dans le tableau précédent).

La qualité

33

m

3m

10m = M lou2 échantillons ACCEPTABLE

1000m = S

5 échantillons

1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 échantillons

SATISFAISANT

3 ou 4 ou 5 échantillons

NON SATISFAISANT

CORROMPU OU TOXIQUE

Une quatrième classe (lot corrompu ou toxique) correspond à un dénombrement supérieur ou égal à 1 000 fois le critère (1 000 m).

3.

Autocontrôle hygiénique et de conformité

Plusieurs arrêtés ministériels ont été pris pour transposition de cette directive, ou ont intégré l'analyse des risques et des points critiques pour leur maîtrise (ARPCM) sous une forme plus ou moins développée. L'arrêté ministériel qui l'intègre de la façon la plus complète est l'arrêté ministériel du 9 mars 1995 relatif à la remise directe des denrées animales ou d'origine animale au consommateur.

3.1

L'arrêté ministériel du 9 mai 1995, chapitre VII, article 17

Le texte de cet article est reporté ici, avec des commentaires, de façon à préciser les principales étapes de cette démarche.

Contrôles et vérifications, art. 17. : Les responsables des établissements mentionnés à l'article 1 doivent procéder, chacun en ce qui le concerne, à des contrôles réguliers pour vérifier la conformité des aliments aux dispositions du présent arrêté et lorsqu'ils existent, aux critères microbiologiques réglementaires auxquels ils doivent satisfaire. Ces contrôles doivent notamment s'assurer de l'état des produits à réception et porter sur les conditions de conservation, ainsi que sur les méthodes de nettoyage et de désinfection.

COMMENTAIRES 1- Principe C'est un système d'autocontrôlés avec vérifications de la conformité aux dispositions réglementaires concernant : - le produit alimentaire ; - son transport et son stockage ; - les bonnes pratiques d'hygiène et notamment le nettoyage et la désinfection ; - et les critères microbiologiques réglementaires.

34

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Pour établir la nature et la périodicité de ces contrôles, ils doivent : • identifier tout aspect de leurs activités qui est déterminant pour la sécurité des produits mentionnés à l'article I • et veiller à ce que des procédures de sécurité appropriées soient établies, mises en œuvre, respectées et mises à jour • en se fondant sur les principes utilisés pour développer le système d'analyse des risques et des points critiques pour leur maîtrise, dit système « HACCP », en particulier : - analyser et évaluer les risques alimentaires potentiels aux différentes étapes du processus, de mise en vente et, s'il y a lieu, d'élaboration ; - mettre en évidence les points des étapes où des risques alimentaires peuvent se présenter ; - identifier parmi les points qui ont été mis en évidence ceux qui sont déterminants pour la sécurité alimentaire, appelés « points critiques » ; - définir et mettre en œuvre des moyens de maîtriser ces points et des procédures de suivi efficaces ; - revoir périodiquement, et notamment en cas de modification des opérations, les procédures établies ci-dessus.

2- Mode opératoire Sur la base du système ARPCM (HACCP) : 1- identification des éléments et facteurs de la sécurité du produit 2- élaboration de procédures de sécurité Le tout est inspiré des principes du système « HACCP » a- pour nous, il s'agit essentiellement du risque sanitaire lié à la production des denrées animales ou d'origine animale P- = voir y- <-'ar c'est surtout la sécurité qui est visée. y- points critiques = sécurité de l'aliment = absence réelle de danger + conditions et organisation propres à créer un tel état 5- véritables options de maîtrise (= solutions aux risques identifiés + vérifications de l'efficacité) e- cette démarche n'est pas faite une fois pour toutes, mais doit être périodiquement reprise.

11 s'agit bien d'un système obligatoire, pour lequel des preuves doivent être conservées (obligation de moyens). Comme nous venons de le voir, le législateur impose un système d'autocontrôlé fondé sur une démarche en cascade : il faut commencer par deux démarches préalables, fondées elles-mêmes sur la démarche relative au système « HACCP » : • identifier tout aspect des activités qui est déterminant pour la sécurité des produits • veiller à ce que des procédures de sécurité appropriées soient établies, mises en œuvre, respectées et mises à jour. Ces deux démarches préalables doivent permettre de définir la nature et la périodicité des contrôles réguliers de conformité que le professionnel doit mettre en place, ce qui peut être résumé ainsi :

La qualité

35

• En se fondant sur les principes utilisées pour développer le système d'analyse des risques et des points critiques pour leur maîtrise dit système « HACCP », en particulier :

-Analyser et évaluer les risques alimentaires potentiels aux différentes étapes du processus, de mise en vente et, s'il y a lieu, d'élaboration ; - Mettre en évidence les points des étapes où des risques alimentaires peuvent se présenter ; - Identifier parmi les points qui ont été mis en évidence ceux qui sont déterminants pour la sécurité alimentaire, appelés « points critiques ».

- Définir et mettre en œuvre des moyens de maîtriser ces points et des procédures de suivi efficaces ; - Revoir périodiquement, et notamment en cas de modification des opérations, les procédures établies ci-dessus.

• Identifier tout aspect de leurs activités qui est déterminant pour la sécurité des produits mentionnés à l'article 1

• Veiller à ce que des procédures de sécurité appropriées soient établies, mises en œuvre, respectées et mises à jour

Nature

CONTRÔLES RÉGULIERS pour vérifier la conformité des aliments

Périodicité

Aux dispositions du présent arrêté.

Aux critères microbiologiques réglementaires auxquels ils doivent satisfaire, lorsqu'ils existent.

= S'assurer de l'état des produits à réception et porter sur les conditions de conservation, ainsi que sur les méthodes de nettoyage et de désinfection.

36

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

3.2

Éléments d'application de l'arrêté ministériel du 9 mars 1995

Pour appliquer ces éléments, il sera nécessaire au producteur d'identifier les éléments essentiels des risques sanitaires liés à sa production, en particulier les risques de: -Contamination des denrées animales ou d'origine animale par des germes pathogènes, comme par exemple les salmonellcs ou Listeria monocytogenes. On s'intéressera principalement aux matières premières mais aussi aux contaminations par les manipulateurs ou l'environnement des denrées animales ou d'origine animale. - Multiplication des microflores pathogènes. C'est essentiellement les paramètres de cette multiplication que l'on suivra, et notamment les couples temps-température. On repérera surtout les maintiens prolongés ou répétés à température tiède. Les autres paramètres (pH, aw...) seront aussi relevés. - Survie des microflores pathogènes. Tout réside ici dans l'efficacité des barèmes appliqués (couple temps-température pour le chauffage, dose d'irradiation pour les traitements ionisants). Il faudra donc en faire des relevés systématiques.

Conclusion
Le professionnel se doit donc de mettre en place deux systèmes d'autocontrôlé. Le premier correspond à une obligation d'effectuer des analyses microbiologiques des aliments. Le deuxième est plus large et repose surtout sur une identification des ponts critiques de sa production. L'ensemble des ces autocontrôles permet d'assurer avec une quasi-certitude la salubrité des produits.

Chapitre

4
SECURITE ALIMENTAIRE ET HACCP
Jérôme Bariller

La qualité se définit généralement comme « l'ensemble des caractéristiques d'une entité qui lui confèrent l'aptitude à satisfaire des besoins exprimés ou implicites » (norme Iso 8402 1995). Pour un produit alimentaire, elle peut se décrire par la règle des 4S : • Satisfaction Le produit alimentaire doit satisfaire le consommateur au niveau des sens : aspect, goût, odeur... ; du prix ; de sa régularité, etc. • Service Dans ce critère, on pense à la praticité d'utilisation du produit, à son type de conditionnement et à son mode de distribution. • Santé Devenu très important dans notre société et soutenu par d'importantes campagnes médiatiques, ce critère se traduit par le besoin d'une nourriture plus nature et apparemment plus saine : - produits biologiques, sans conservateur, sans pesticide ; - produits plus riches : produits diététiques, produits enrichis en vitamines et en minéraux, etc. • Sécurité La sécurité alimentaire se définit comme étant la maîtrise de la santé et de la sécurité du consommateur par : - l'absence de contaminants naturels ou exogènes ;

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MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

- l'absence de pathogènes ; - l'absence d'additifs à risque toxique. Si les deux premiers critères et une partie du troisième sont explicites c'est-à-dire demandés ouvertement par le consommateur, ce sont bien souvent des arguments de vente pour les industriels de l'agroalimentaire. Le quatrième portant sur la sécurité et une partie du troisième attrait à la santé (règle d'étiquetage et d'information du consommateur) est implicite : nous ne nous posons même pas la question, lors de l'achat d'une denrée alimentaire, si celle-ci va nous rendre malade. De ce fait, le critère « sécurité du consommateur » est placé sous le couvert de la loi pour contraindre les industriels au respect de la santé publique. Comment garantir la sécurité du consommateur ? Jusqu'à une dizaine d'année environ, nous étions à l'ère du contrôle qualité avec ses excès : nous fabriquions et contrôlions uniquement la conformité du produit fini à des critères internes et réglementaires ; par exemple la conformité des produits à l'arrêté du 21 décembre 1979 relatif aux critères microbiologiques auxquels doivent satisfaire les denrées animales ou d'origine animale. Si les résultats étaient corrects la marchandise pouvait être vendue. Les limites de ce système sont nombreuses : - pour des produits à courte durée de vie, les résultats des contrôles pouvaient intervenir une fois les produits distribués avec les conséquences que cela pouvait avoir ; - la faible représentativité des résultats des contrôles au regard de la production entière ; - l e fonctionnement « stressé » de l'entreprise dans la crainte d'un contrôle positif; - les pertes importantes pour l'entreprise. Il a fallu trouver une solution. Au lieu de contrôler uniquement les produits finis, essayons de maîtriser chacune des étapes de fabrication ainsi que l'environnement de production. Dans ce cas et à fortiori le produit fini sera conforme. C'est l'apparition de l'assurance qualité avecutilisation d'outils de maîtrise préventive de la sécurité alimentaire : le HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) que nous présenterons ci-après.

1.

Le contexte réglementaire de la sécurité alimentaire

En terme de sécurité alimentaire, la réglementation est principalement horizontale avec quelques spécifications par filière. Le droit alimentaire par la loi de 1905 sur les fraudes et falsifications en matière de produits ou de services dite « loi d'hygiène alimentaire » fait état de loyauté des transactions avec apparition des termes « sain, loyal et marchand ». La loi du 21 juillet 1983 relative à la sécurité des consommateurs, dans son article premier, dit : « Les produits et les services doivent, dans des conditions normales

La qualité

39

d'utilisation ou dans d'autres conditions raisonnablement prévisibles par le professionnel, présenter la sécurité à laquelle on peut légitimement s'attendre et ne pas porter atteinte à la santé des personnes » De nombreux décrets, arrêtés, circulaires permettent l'application de ces lois. Au niveau européen, deux directives principales déjà ou en cours d'adaptation dans le droit français : La directive cadre 89/397 relative au contrôle officiel des denrées alimentaires a pour objet la protection de la santé des consommateurs et des intérêts économiques des entreprises. Elle établit les règles générales concernant le contrôle officiel par les autorités nationales de la conformité des denrées, de la conformité des matériaux et objets destinés à entrer en contact avec les denrées, des dispositions assurant la protection des consommateurs contre les risques sanitaires et les fraudes résultant d'un étiquetage inexact. La directive 93/43 sur l'hygiène des denrées alimentaires est très importante en terme de sécurité alimentaire. Elle a pour fonction de protéger la santé du consommateur en harmonisant les règles d'hygiène alimentaire qui doivent être respectées pour : la production, la transformation, la fabrication, le conditionnement, le stockage, le transport, la distribution, la manutention et la vente au consommateur final, des denrées alimentaires. Trois points principaux : « Les entreprises du secteur alimentaire doivent : - identifier tous les aspects de leurs activités qui sont déterminants pour la sécurité des aliments ; - veiller à ce que les procédures de sécurité appropriées soient : établies, mises en œuvre, respectées et mises à jour ; - veiller sur les procédures de sécurité en se fondant sur les principes qui ont été utilisés pour développer le système HACCP (analyse des risques, points critiques pour leur maîtrise) ». « Les entreprises du secteur alimentaire doivent respecter les règles d'hygiène spécifiées » « Elaboration et utilisation de guides de bonnes pratiques en matière d'hygiène » Cette directive est entrée en application le 14 décembre 1995. L'arrêté du 9 mai 1995 réglementant l'hygiène des aliments remis directement au consommateur est une transposition directe de la directive 93/43 dans le droit français avec un champ d'application plus restreint.

2. 2.1

Le système HACCP Historique

Il existe de nombreuses techniques, basées sur l'idée simple qu'il vaut mieux prévenir que guérir, et qui sont déjà utilisées dans l'industrie chimique, (Hazard and

40

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Operability Study ou HAZOP), nucléaire et aéronautique. C'est à partir d'elles qu'est né aux Etats-Unis le système HACCP, à la fin des années 60, lorsque la finne Pillsbury accepta de fabriquer des aliments pour les astronautes et voulut le faire en s'entourant préventivement d'un maximum de précautions. En 1971 : présentation du concept à la conférence nationale sur la sécurité alimentaire aux USA En 1975 : les experts de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) recommandent le système HACCP En 1980 : les experts de l'OMS et de l'ICMSF (Commission internationale pour la définition des caractéristiques microbiologiques des aliments) décrivent les principes et les définitions En 1983 : l'OMS Europe accepte le système HACCP comme outil dans l'inspection des aliments En 1984 : le National Research Council recommande le système HACCP Enfin, en 1993 : Publication des principes d'HACCP par la commission du Codex Alimentarius et élaboration de la Directive 93/43 CEE relative à l'hygiène des denrées alimentaires, dite « directive hygiène », qui recommande l'utilisation de HACCP avec obligation d'identifier les risques pour la santé du consommateur au cours de la vie du produit, et de les maîtriser.

2.2

Définition et objectif

HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) se traduit par « l'analyse des dangers - maîtrise des points critiques ». C'est un outil de prévention de la sécurité alimentaire. HACCP décrit un système de maîtrise des étapes de la vie d'un produit (des matières premières au produit fini et jusqu'à l'utilisation par le consommateur) pour assurer la sécurité alimentaire. HACCP est une approche systématique et rationnelle de la maîtrise des dangers microbiologiques, physiques et chimiques dans les aliments. HACCP est un système qui permet d'identifier le ou les dangers spécifiques, de les évaluer et d'établir les mesures préventives ainsi que les actions de maîtrise.

23.

Vocabulaire

Comme tout système, HACCP a défini un vocabulaire. Voici quelques définitions :
Action corrective (corrective action) Critère (criterion)
•<

Procédure à suivre quand une déviation a lieu et que la surveillance révèle que le CCP n'est pas maîtrisé. Paramètre ou exigence correspondant à une ou plusieurs caractéristiques, physiques, chimiques, microbiologiques de l'opération ou du produit.

La qualité

41

Danger (hazard)

Tout facteur biologique (micro-organismes, toxines, etc.), chimique (lubrifiant, additif, conservateur, etc.) ou physique (corps étranger, insecte, cheveu, etc.) qui peut entraîner un risque inacceptable pour la santé et la sécurité du consommateur ou la qualité du produit. Importance d'un danger. Non respect des limites critiques d'un CCP. Critères ou paramètres qui doivent être respectées pour assurer que la maîtrise est effective. Ensemble des techniques, des méthodes, des actions, qui devrait permettre d'éliminer le danger ou de réduire le risque à un niveau acceptable. Document qui décrit les procédures formalisées à suivre en accord avec les principes généraux du système HACCP. Tout point, lieu, personnel, opération ou protocole pour lequel la perte de la maîtrise peut entraîner un risque inacceptable pour la qualité du produit. Il s'agit de tout produit, étape ou opération pour lequel la maîtrise doit être assurée et tout danger peut être éliminé, prévenu ou réduit à un niveau acceptable. Estimation de la probabilité d'apparition d'un danger. Séquence planifiée d'observations ou de mesures conçue pour obtenir des données précises dans le but de vérifier le respect des limites critiques Méthodes, procédures et essais complémentaires utilisés pour déterminer si le système HACCP est appliqué et qu'il donne sur le plan de la sécurité, les résultats escomptés.

Gravité (severity) Déviation (déviation) Limite critique (critical limit) Mesure préventive (préventive action) Plan HACCP (HACCP plan) Point critique de maîtrise (Critical Control Point - CCP)

Risque (risk) Surveillance (monitoring) Vérification (vérification)

2.4

Principe

Le système HACCP comprend les sept principes généraux suivants : 1 Identification des dangers à tous les stades de la vie du produit, depuis la culture ou l'élevage en passant par sa transformation éventuelle jusqu'à l'utilisation plausible du produit par le consommateur. Évaluation de la probabilité d'apparition des dangers et description des mesures préventives. Identification des points critiques pour leur maîtrise ou Critical Control Point - CCP.

2

42

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

3 4 5

Établissement des limites critiques de maîtrise des CCP. Établissement et mise en place des procédures de surveillance des CCP. Établissement et mise en place des actions correctives appropriées et immédiates lorsque les résultats de la surveillance indiquent qu'une opération n'est pas maîtrisée pour un CCP et donc que les critères ne sont pas respectés. Établissement d'un système d'enregistrement qui documente le plan HACCP. Établissement des procédures de vérification et de validation du système HACCP.

6 7

2.5

Les étapes de mise en place

La mise en place d'HACCP est définie dans un planning comprenant treize étapes : 1. Réunir une équipe HACCP ; 2. Définir le champ de l'étude ; 3. Décrire le produit (fini et matière première) et identifier l'usage attendu ainsi que les utilisateurs du produit ; 4. Élaborer un diagramme de fabrication ; 5. Vérifier sur place le diagramme de fabrication ; 6. Conduire une analyse de dangers : identification des dangers, appréciation du risque et description des mesures préventives ; 7. Déterminer les points critiques pour la maîtrise ou CCP ; 8. Établir les limites critiques pour chaque CCP ; 9. Établir un système de surveillance de chaque CCP ; 10. Mettre en place des actions correctives ; 11. Établir un système d'enregistrement et de documentation ; 12. Vérifier et valider le fonctionnement du système HACCP ; 13. Révision du système HACCP. Les étapes 1 à 5 sont des étapes préalables à la mise en place de HACCP. 2.5.7 Réunir une équipe HACCP

La mise en place d'HACCP nécessite une connaissance précise de l'outil de production. C'est pourquoi, elle ne doit pas être réalisée pas un individu seul mais par une équipe. De plus, cette équipe doit être pluridisciplinaire, collective et non hiérarchique. Elle comprend généralement : - Le directeur de l'usine ou du site, pour coordonner les actions et être le garant de la disposition des moyens financiers. Il n'assiste généralement pas à l'ensemble de la démarche mais intervient lors de la prise de décisions et avant la mise en application des diverses actions.

La qualité

43

- Le responsable de production, pour préparer le diagramme de fabrication et valider la mise en application des diverses décisions en fonction de la capacité de production. Il est assisté, dans cette fonction, par les agents de maîtrise ainsi que les opérateurs eux-mêmes dans la connaissance précise de l'outil de production. - L e responsable de la maintenance et de l'entretien, pour connaître l'état de l'équipement, le suivi minimum et les conséquences de son état de fonctionnement sur la sécurité du produit. - Le responsable qualité, pour l'intégration de la démarche dans l'esprit qualité de l'entreprise. Il sera souvent l'animateur de la démarche HACCP. - Le responsable du laboratoire de microbiologie et/ou de physicochimie, pour apporter le maximum d'information relatif au produit fabriqué. -Tout spécialiste d'un domaine particulier de compétence, pour éclaircir l'avancée de l'étude : responsable achats, chef produit, service logistique, transport, expert, etc. Au sein de l'équipe, nous devons retrouver l'ensemble des compétences suivantes : - Connaître les principes d'HACCP. - Savoir construire un diagramme de fabrication. - Comprendre les types de dangers qui peuvent apparaître et les méthodes de prévention possibles. - Connaître les bonnes pratiques de fabrication. - Savoir identifier les CCP. - Savoir communiquer. - Savoir auditer. -Avoir les bases en statistique. - Connaître les techniques de résolution de problèmes. - Savoir former et informer. La mise en place d'HACCP s'accompagne d'une formation des opérateurs et d'autres personnes au système HACCP pouvant comprendre les points suivants : - Qu'est-ce que HACCP ? - Pourquoi doit-on mettre en place HACCP ? - Qui est impliqué dans la mise en place du système ? - Quels seront les changements dans la façon quotidienne de travailler ? - L'importance des points critiques. - L'importance de la sécurité alimentaire. - Compréhension des bonnes pratiques de fabrication et de l'assurance qualité. Le travail en équipe permet de progresser plus rapidement et plus efficacement. L'ensemble des décisions est défini et accepté par tous. Le succès de l'HACCP est le succès de l'équipe.

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2.52

Définir le champ de l'étude

Il est très important de borner l'application de l'étude pour éviter de « s'éparpiller » lors de l'analyse des dangers. Le champ de l'étude est défini par rapport : - au couple produit/processus de fabrication (un produit, une ligne de fabrication dans un environnement donné) ; - à la nature des dangers à considérer : physiques, chimiques et/ou microbiologiques ; - à l'application des exigences spécifiques : processus, traitement, conditionnement, stockage, expédition, transport, livraison, distribution. Ce champ de l'étude est déterminé en se rapportant aux dangers connus en matière de sécurité alimentaire du type de produit fabriqué (ex fromage au lait cru : le danger principal à étudier concerne la présence de Listeria monocytogenes). La connaissance du ou des dangers inhérents à la santé du consommateur s'acquiert par collectes d'informations : données épidémiologiques, cas existants, fragilité et sensibilité du produit, données bibliographiques... Il est défini le plus généralement en regard du produit posant le plus de difficulté en matière de qualité. 253 Décrire le produit alimentaire et son usage prévisible

Pour posséder un maximum d'information, le produit étudié doit être décrit de manière très complète en commençant par les matières premières et les ingrédients. On pensera : - à la composition chimique ; - à la préparation et aux traitements subis ; - aux caractéristiques sanitaires ; - à l'emballage et au conditionnement ; - au stockage en tenant compte de la durée de stockage prévisible et attendue ; - aux modalités normales et raisonnablement attendues d'utilisation ; - aux instructions d'utilisation ; -etc. 25.4 Réaliser un diagramme de fabrication

Cette étape suppose seulement de suivre le processus de fabrication depuis la ou les matières premières au travers des différentes opérations jusqu'à l'utilisation plausible du produit par le consommateur. Il suffit ensuite de présenter cela sous forme de diagramme. Il existe différentes façons de présenter le diagramme de fabrication ; optez pour la façon la plus simple mais la plus complète tout en restant compréhensible par tous. Il faut faire attention au diagramme de fabrication type issu de modèle ou de guide de fabrication standardisé. Il correspond très rarement à la réalité.

La qualité

45

Le diagramme de fabrication va apporter à l'équipe plusieurs informations : - l a connaissance pleine et entière des différentes étapes de fabrication. Il faut préciser les caractéristiques des opérations utiles pour la démarche : barèmes temps-température, conditions particulières... ; - le nombre total d'étapes spécifiques : le nombre d'opérations, le nombre de stockage, le nombre de transport... permettant de focaliser sa réflexion sur ce qui va être le sujet à risque (exemple : un nombre d'attente trop élevé) ; - une réflexion sur l'utilité de certaines pratiques ou usages ; - la liste des opérations où il peut y avoir une augmentation, une réduction ou une stabilisation des contaminants microbiologiques, physiques et chimiques. 2.55 Vérifier un diagramme de fabrication

Le diagramme de fabrication va constituer la colonne vertébrale de l'analyse des dangers - points critiques pour leur maîtrise. La vérification sur le terrain constitue une contrepartie indispensable. La « visite » de l'usine permet de prendre en compte des insuffisances et des lacunes du diagramme de fabrication réalisée en salle avec l'équipe HACCP. Tout se passe comme prévu, mais... ! Cette vérification doit permettre également : - d'étudier les différents flux de circulation matière, matériels et personnels ; - de visualiser « pratiquement » l'ensemble des étapes de fabrication pour chacun des membres de l'équipe ; - de se rendre compte de la réalité au quotidien : propreté, ordre, conception des locaux, nettoyabilité des équipements... Dès que besoin au cours de l'étude, il convient d'envisager le déplacement de l'équipe sur le terrain. 25.6 Conduire une analyse de dangers

Trois parties importantes : (1) identification des dangers et des causes associées, (2) évaluation du risque, (3) établissement des mesures préventives. 2.5.6.1 Identification des dangers et des causes associées

Selon les besoins de l'étude, l'analyse des dangers peut se faire sous deux formes : - Une analyse rapide étape par étape en listant les principales causes. Cette façon de procéder a l'avantage de progresser très vite à la mise en place de l'HACCP avec maîtrise des principaux dangers mais n'est pas suffisamment exhaustive. - U n e analyse plus complète conduisant à identifier l'ensemble des causes des dangers traités. Cette seconde façon, qui peut faire suite à la première, peut revêtir la forme suivante : - Existe t-il un danger de... à cette étape de fabrication ? pour répondre à cette question analysons les causes :

46

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

- Qu'est-ce qui peut entraîner le danger de... à cette étape de fabrication ? Pour ne rien omettre comme cause, la règle des 5M est efficace : Les dangers sont associés généralement à 5 éléments : Matériel, Main-d'œuvre, Milieu, Matière, Méthode. Cette recherche des causes peut se faire en utilisant d'autres outils : le « brainstorming », l'analyse fonctionnelle, l'AMDEC... Les causes peuvent ainsi être classées en cause primaire, secondaire voire tertiaire. Cette phase doit rester très pragmatique. L'erreur est de rentrer dans trop de détails entraînant une lourdeur préjudiciable à la suite de l'application du système HACCP. 2.5.6.2 Évaluation du risque

Une fois les causes recensées et les dangers identifiés, il convient de hiérarchiser ces dangers permettant de prioriser ensuite certaines actions et de les approfondir ou non : c'est l'analyse des risques. Cette hiérarchisation ne peut se faire que semiquantitativement et fait appel au ressentiment de l'équipe. À chacune des étapes, on peut classer chaque danger uniquement en fonction des avis : ce danger découlant d'une ou d'un ensemble de cause a un risque fort, moyen ou faible (le risque étant la probabilité d'apparition du danger). On peut évaluer le risque en tenant compte de 3 points : la fréquence d'apparition de la cause (F), la gravité du danger associé à cette cause (G) et la probabilité de non-détection de la survenue de la cause (P). Une note peut être attribuée à chaque point. Pour répondre à cette question, des recherches et études complémentaires peuvent être déclenchées. 2.5.6.3 Établissement des mesures préventives

Devant chaque danger identifié, il faut établir et mettre en place des mesures préventives, c'est-à-dire des actions visant soit à éliminer le danger soit à réduire le risque en jouant sur la fréquence, la gravité ou la probabilité de non-détection des causes. L'importance et l'ampleur de ces mesures préventives sont reliées au risque. À la fin de cette étape nous arrivons à un tableau de la forme :
Nom de l'entreprise Ligne de fabrication : Produit : Date: Page:

ÉTAPE

DANGERS

CAUSES Primaires Secondaires Tertiaires

F xG xP

Mesures préventives

Études ou recherche complémentaire

déjà en place

à envisager

La qualité

47

2J5.7

Déterminer les CCP

Le but de l'identification des CCP est de définir pour ces points particulièrement déterminants, en compléments des mesures préventives, des mesures de surveillance particulières. Les CCP sont spécifiques d'une opération, d'un procédé ou d'un produit. Un CCP doit permettre la maîtrise d'un danger ; si tel n'est pas le cas, ce n'est pas un CCP. Un arbre de décision (à utiliser de façon judicieuse) peut aider dans l'identification des CCP :

Q1. Existe-t-il un danger à cette étape de fabrication '

•
oui

i
non

ce n'est pas un CCP

STOP*

Q2. Des mesures préventives sont-elles prises pour le ou les dangers identifiés ?

Modifier l'étape, le procédé ou le produit

oui

non

La maîtrise de cette étape est-elle nécessaire pour la sécurité du produit ?

oui
STOP*

non
Q3. Cette étape élimine-t-elle ou réduit-elle l'arrivée du ou des dangers à un niveau acceptable ?

ce n'est pas un CCP

oui

04. La contamination par le ou les dangers identifiés peut-elle intervenir ou augmenter jusqu'à un niveau inacceptable ? ce n'est pas un CCP STOP*

oui

non

05. La ou les étapes suivantes peuvent-elles éliminer le ou les dangers identifiés ou réduire leur réalisation à un niveau acceptable ? Point critique pour la maîtrise ce n'est pas un CCP STOP*

non oui

' Ce n'est pas un CCP. Passer à l'étape suivante.

48

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25.8

Etablir les limites critiques, une et des actions correctives

surveillance

Dans la pratique, ces 3 étapes se trouvent en étroite corrélation : - Les limites critiques fixent le niveau de maîtrise d'un CCP. Ce sont des critères qui indiquent si une opération est maîtrisée pour un CCP particulier. Le plus couramment, ces critères sont des valeurs accompagnées de tolérances. Par rapport aux dangers microbiologiques, les critères de maîtrise les plus fréquemment utilisés comprennent la température, le temps, l'humidité, la viscosité, le pH, la fréquence de nettoyage et désinfection, la concentration en produit désinfectant... - Un plan de surveillance va définir les moyens, méthodes et les fréquences pour évaluer et assurer le respect des limites critiques. Elle doit être simple et facile à mettre en œuvre. Il existe deux types de surveillance : - La surveillance en continu : c'est la plus efficace car elle permet d'agir en temps réel. Ce type de surveillance doit être envisagé en priorité. - La surveillance discontinue doit se faire par rapport à une fréquence définie. Elle peut revêtir la forme d'une check-list des différents points de surveillance. - Les actions correctives doivent être définies et mises en place dès que la perte ou l'absence de maîtrise d'un CCP est détectée c'est-à-dire dès que les tolérances sont dépassées. Les actions correctives sont d'ampleur variable selon l'écart constaté. On peut travailler en déviation mineure, intermédiaire et majeure afin de réagir rapidement. Les actions correctives définissent le devenir du produit nonconforme et doivent permettre le retour aux conditions normales de production. Il faut définir des priorités d'action : - l'action immédiate nécessite une correction ou une amélioration instantanée ; - l'action différée avec planification de sa mise en œuvre.
Nom de l'entreprise : Ligne de fabrication : Produit : SURVEILLANCE N° l'étape CCPn0 Limites critiques Quoi Comment Fréquence Qui Actions correctives Date : Page

25.9

Établir un système de

documentation

L'ensemble des travaux HACCP doit rentrer dans un système documentaire performant permettant une gestion facile, souple et compréhensible par tous. Cette documentation comprend :

La qualité

49

- l'étude elle même avec la phase de conception (étapes 1 à 10) et la phase de vérification et révision (étapes 12 et 13) ; - d e s documents descriptifs : présentation générale du système, plan et manuel sécurité... - des documents opérationnels : règles et dispositions qui découlent du plan à appliquer : procédures, instructions... - des documents démonstratifs : les preuves de l'application : les enregistrements. Cet ensemble documentaire nécessite d'être lui-même maîtrisé par des règles pratiques de rédaction, d'approbation et visa, d'identification et codification, de diffusion contrôlée, de mise à jour, de modification, de classement et d'archivage. La documentation HACCP doit être une composante de la documentation qualité existante dans l'entreprise. 25.10 Vérifier et valider le système HACCP

Il est impératif de prévoir une : -Vérification que le système est efficient : c'est le respect pratique des consignes établies. Cette vérification peut se faire par un audit d'application du système HACCP, par l'examen des déviations... -Vérification que le système est efficace : c'est la validation de l'étude. Cette vérification peut prendre les formes suivantes : - analyses des déviations et des actions correctives ; - analyses renforcées de produits intermédiaires ou des produits finis ; - tests approfondis au niveau des CCP ; - essais de validation des valeurs fixées comme limites critiques (ex : barèmes de pasteurisation) ; - analyses approfondies des réclamations clients. Les modalités de vérification doivent être formalisées (procédures, documents d'enregistrement...). 25.11 Revue du système HACCP

L'objectif de la revue est de s'assurer que le système HACCP est toujours adapté. Il faut prévoir une revue systématique à intervalle régulier et une revue à chaque fois qu'une situation nouvelle apparaît par exemple : - la non validation de l'efficacité du système en place ; - une modification de matières premières ; - une modification des processus de production (conditions, équipements,...) ; - une modification des conditions d'utilisation des consommateurs ; - un changement de standards ; - de nouvelles informations scientifiques ou épidémiologiques.

50

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Comme pour la vérification, les modalités de la revue doivent être formalisées (procédures, documents d'enregistrement,...). • Tableau de synthèse associé au diagramme de fabrication permettant de rassembler les composantes de HACCP.
Dangers chimique physique biologique 1. 2. 3. etc. Surveillance procédures/ Actions conect. fréquence/ Limites personne Enregispersonne critiques responsable responsable trement Vérification pRK'édures personne responsable

N° étape

CCP
Oui ou Non

Mesures préventives

1.

3.

HACCP - certification ISO et BPF

L'élaboration de guide de bonnes pratiques de fabrication (BPF) et leur application sont demandées par la directive CEE 93/43 relative à l'hygiène des denrées alimentaires. Les Bonnes pratiques hygiéniques de fabrication sont un ensemble de règles d'hygiène concernant la conception des locaux, l'environnement de fabrication, le comportement du personnel, les flux de circulation... visant à produire dans de meilleures conditions d'hygiène. Il est indispensable de les connaître et de les transposer à son activité et de les respecter. HACCP est un outil de sécurité alimentaire qui fait référence aux BPF dans les mesures préventives. La mise sous assurance-qualité d'une entreprise conformément aux normes de la série Iso 9000 permet à l'entreprise de structurer et de formaliser son organisation pour régulariser et maintenir un niveau de qualité préalablement définie. Dans cette démarche, l'entreprise peut utiliser HACCP dans la maîtrise de ces procédés et de la qualité de ses produits. HACCP et certification Iso sont deux démarches complémentaires (voir tableau ci-après) et synergiques.

• Synthèse des relations entre Iso 9002 (version 1994) et HACCP
ISO 9002 HACCP

Responsabilité de la direction (§4.1) Déclaration de politique générale sur la maî-Objectifs qualité trise de la sécurité alimentaire - Action de prévention des non-conformités - Vérification de la mise en œuvre

La qualité

51

ISO 9002 Achats (§4.6) - Évaluation des sous-contractants (§4.6.2) - Données d'achat (§4.6.3) - Vérification du produit acheté

HACCP - Description du produit - Analyse des dangers, mesures préventives - Détermination des CCP -Limites critiques, surveillance, actions correctives - Système documentaire et vérification - Diagramme de fabrication - Identification des CCP - Limites critiques, surveillance, actions correctives - Système documentaire

Maîtrise des processus (§4.9) - Identifier les processus - Équipements et environnement adéquats pour la production - Maîtrise des paramètres des processus et caractéristiques produits -Manutention, stockage, conditionnement, préservation et livraison (§4.15) Contrôles et essais (§4.10) - Maîtrise des équipements de contrôle, de mesure et d'essai (§4.11) - État des contrôles et des essais (§4.13) Maîtrise du produit non conforme (§4.13) Actions correctives et préventives (§4.14)

-CCP - Validation - Surveillance - Système documentaire et vérification - Surveillance, actions correctives - Vérification

Maîtrise des enregistrements relatifs à la - Système documentaire qualité (§4.16) Audits qualité internes (§4.17) Formation (§4.18) - Vérification - Mesures préventives - Action correctives

4.

Conclusions

Les industriels du secteur alimentaire n'ont pas attendu l'arrivée de l'HACCP pour maîtriser leur outil de production. HACCP leur permet de formaliser l'ensemble des actions entreprises, d'avoir une démarche logique, cohérente et efficace et surtout de raisonner en préventif. HACCP est un outil de maîtrise préventive de la sécurité alimentaire. Comme tout outil, il a un mode d'emploi (qui est présenté ci-dessus) et n'est pas non-plus la panacée universelle. La façon d'utiliser l'outil aura des conséquences sur le résultat et surtout sur l'obtention des objectifs préalablement définis en terme de sécurité alimentaire.

52

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Beaucoup d'industriels utilisent la force de cet outil pour, outre garantir la sécurité du consommateur, progresser en matière de qualité des produits. Ils lui reconnaissent deux principaux avantages : c'est un outil de terrain qui développe l'esprit d'équipe et qui renforce la connaissance de l'outil de production. Une limite de HACCP dans son utilisation est qu'il peut devenir rapidement un outil inefficace voire mauvais pour l'entreprise s'il est mal utilisé : surabondance de CCP conduisant à une démotivation de l'équipe, utilisation pas assez pragmatique, multiplication des causes... Une limite dans les principes du système HACCP se trouve dans l'analyse quantitative des risques qui n'en ait qu'à ces balbutiements et qui nécessite un travail important de recherche et d'étude. S'agissant des dangers microbiologiques, les outils disponibles s'appellent microbiologie prévisionnelle, challenge-tests et analyse d'exposition du produit à certaines conditions... Pour conclure, dans l'application de l'HACCP, il faut avant tout garder son esprit « du bon sens » et utiliser la démarche d'une manière cartésienne (basée sur la raison) plutôt que platonicienne (basée sur les définitions de terme).

Références bibliographiques
Adams C E . HACCP as applied in the USA. Food Contrai ( 1994) 5, 187-188. Adams CE., Crawford L.M. Microbial concerns of the north and south american countries and scientific implications for harmonizing free trade. Dairy, Food and enviwnmentul Sunitation, 1994,14,471 -472 Afnor. Gérer et assurer la qualité. Tomes 1 et 2. 4e édition, 1992. Agroa 95. Hygiène agroalimentaire. Application des directives. État des lieux dans les filières. Textes des conférences du 16 mai 1995. Amgar A. Application du système HACCP : La démarche qualité au niveau procédure. Process, 1061, 1991,40-41. Amgar A. Le Système HACCP : principes essentiels. Revue Laitière Française, 500, 1990, 100-102. Amgar A. Mémento pratique HACCP. ASEPT, 1995. Anonyme. Application des normes ISO de la série 9000 et systèmes officiels d'inspection et de certification des denrées alimentaires importées et exportées. B.I.D., 1995,5,58-63. Anonyme. Directives concernant l'application du système de l'analyse des risquespoint critique pour leur maîtrise (HACCP). B.I.D., 1993, 11,55-61. Anonyme. HACCP and Total Quality Management - Winning Concepts for the 90's : A Review. J. Food Protection, 1992,55,459-462.

La qualité

53

Anonyme. Hazard and Risk Assessment in the Food lnduslry. Conférence Documentation, London, 13th November 1990, IBC Technical Services Ltd. Anonyme. Implementation of HACCP in a Food Processing Plant. Dairy, Food and Environmental Sanitation, 1993,56 : 6,548-554. Anonyme. Le développement et l'utilisation du HACCP par les entreprises agroalimentaires françaises. Rapport du comité de pilotage. B.I.D., 1995,4,49-65. Anonyme. Le système HACCP et ses applications dans les IAA. Crin Région IdF Infos ,28, Mai 1993,4-6. Anonyme. Recommendations of the US National Advisory Comittee on Microbiological Criteria for Foods : I HACCP principles, II méat and poultry, III seafood. Food Control, Oct. 1991, 202-211 Archer D.L. The Need for Flexibility in HACCP. Food Technology, May 1990, 174, 176,178. Arilait Recherches. L'évaluation des risques pour une meilleure maîtrise dans l'industrie laitière. CREAL 94. lre conférence européenne d'Arilait. Arilait. Guide des bonnes pratiques hygiéniques dans l'industrie laitière. Vol. 1 et 2, 1990. Arilait. Le HACCP et l'industrie laitière, vol. 1. La méthode : guide d'application. 1994. ASEPT. Auto-Diagnostic de l'Hygiène des entreprises alimentaires et entreprises associées, ASEPT éditeur, 1996, mise à jour annuelle. ASEPT. Microbiologie Prédictive et HACCP. Comptes-rendus de la 2e Conférence internationale ASEPT, 10-11 Juin 1992, Laval, France, ASEPT éditeur. ASEPT. Qualité et Certification. Compte-rendu de l'atelier-Formation du 1er octobre 1991. ASEPT. Sécurité alimentaire 94/Food Safety'94. Comptes-rendus de la 3 e Conférence internationale ASEPT, 1-2 Juin 1994, Laval, France, ASEPT éditeur. ASEPT. Sécurité alimentaire 96/Food Safety'96. Comptes-rendus de la 4e Conférence internationale ASEPT, 4-5-6 Juin 1996, Laval, France, ASEPT éditeur. Baird-Parker A.C., Mayes T. Application of HACCP to assure Microbiological Safety. Food Science & Technology Today, 3,1990,23-26. Baker D.A. Application of modelling in HACCP plan développement. Int. J. Food Microbiology, 1995,25,251 -261. Bryan F.L. Application of HACCP to Ready-to-Eat Chilled Foods. Food Technology, July 1990,70-77. Bryan F.L. Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) Concept. Dairy, Food and Environmental Sanitation, 10,1990,416-418.

54

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Bryan F.L. Hazard Analysis Critical Control Point : What he Sytem is and What is mit. 7. Environmental Health, 50, 1988,400-401. Bryan F.L., Teufel P., Riaz S., Roohi S., Qadar F., Malik Z. Hazards and Critical Control Points at a Railway Station and a Bus Station in Pakistan. J. Food Protection, 1992,55,7,534-541. Buchanan R.L. The role of microbial criteria and risk assessment in HACCP. Food microbiology, 1995,12,421-424. Bulletin législatif et réglementaire du Guide de la concurrence, consommation et de la répression des fraudes et du contrôle de la qualité. Le développement et l'utilisation du HACCP par les entreprises agroalimentaires françaises. Note de service DGAL/SDHA/N.94/N0 8136 du août 1994. Campden Food & Drink Research Association. Directives pour l'Etablissement d'un Système HACCP. Manuel Technique n° 19 (French), 3 e édition - Février 1991. Campden Food & Drink Research Association. HACCP : A Practical Guide. Technical Maimal, 38. November 1992. Cnerna-CNRS. La qualité microbiologique des aliments : maîtrise et critères. Coordonnateur J.L. Jouve. Polytechnica 1993. Corlett D.A. Regulatory Vérification of Industrial HACCP Systems. Food Technology, AprW 1991, 144-146. Corlett D.A., Stier R.F. Risk Assessment within the HACCP System. Food Control, April 1991,71-72. Creaser C. Purchase R. Food Contaminants. Sources and Surveillance. The Royal Societry of Chemistry, 1991. Dean K.H. HACCP and Food Safety in Canada. Food Technology, May 1990,172, 178. DGCCRF. Rapport d'activité 1994. Laboratoires : Activité analytique. Ministère de l'Economie et des Finances. Revue de la concurrence et de la Consommation, Supplément au n° 86. DGCCRF. Rapport d'activité 1994. Ministère de l'Economie et des Finances. Revue de la concurrence et de la Consommation, Supplément au n° 86. Dijkers J.H., Huurnink Th., Pennings P.P.L., van den Berg M.G. An exemple of HACCP application in an existing pasteurized milk plant following the Codex alimentarius model. Bulletin ofthe IDF, 302, 11-34. Doeg C. Crisis Management in the food and drinks industrv. A practical approach. Chapman& Hall, 1995. Doussin J.P. La prise en compte, par les services officiels, des systèmes de maîtrise de la qualité mis en place par les entreprises. B./.D., 1995,5,56-57. Easter M.C., Mortimer S.E., Sperber W.H. The role of HACCP in the management of food safety and quality. J. Soc. Dairy Technology, 1994,47,42-43.

La qualité

55

FAO - OMS. Application de l'analyse des risques dans le domaine des normes alimentaires. Rapport de la Consultation mixte d'experts FAO/OMS. Genève, Suisse, 13-17 mars 1995. WHO/FNU/FOS/95.3. FAO - OMS. Application of risk analysis to food standards issues. Report of the Joint FAO/WHO Expert Consultation. Geneva, Switzerland, 13-17 march 1995. WHO/FNU/FOS/95.3. original : anglais. Farber J.M. Hughes A. General guidelines for the safe handling of foods. Dairy, Food and Environmental Sanitation, 1995,15,70-78. FDA and Milk Industry Foundation International Ice Cream Association. Recommended Guidelines for Controlling Environmental Contamination in Dairy Plant. Dairy, Food and Environmental Sanitation, vol. 8, 1988,52-56. Flair. HACCP User Guide/Guide d'utilisation du HACCP. Action concertée n° 7, 1994. Food Research Institute. Food safety 1995. Marcel Dekker, Inc. 1995. GLR Information Express. HACCP. Bulletin de liaison et d'information du guide législatif et réglementaire Hygiène des denrées animales et d'origine animale. Edité par ECD, 1995. Haveaar A.H. Application of HACCP to drinking water supply. Food Control, 1994, 5,145-152. Hedman S. Recommendations for successfui ISO 9000 registration. Cereal Foods World, 1994,39,389-392. Hourigan J.A. The Critical Control Point Approach to Dairy Product Quality. Australian J. Dairy Technology, November 1988,75-78. IAMFES (International Association of Milk, Food and Environmental Sanitarians). Procédures to Impement the Hazard Analysis Critical Control point System. Published by the IAMFES, Inc., 1991. ICMSF (International Comittee on Microbial Spécifications of Foods). Micro-organisms in Foods. 2. Sampling for Microbiological Analysis ; Principles and Spécifie Applications, 2° Ed. Toronto, Canada, University of Toronto Press, 1966. ICMSF (International Comittee on Microbial Spécifications of Foods). Micro-organisms in Foods. 4. Application of Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) to ensure microbiological quality. Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1988 IFST (Institut Food Science & Technology). She If Life of Foods. Guidelines for ils détermination and prédiction. 1993. JOCE 89/392. Directive CEE relative aux exigences essentielles de sécurité et de santé concernant les machines agroalimentaires. JOCE 93/43. Directive CEE relative à l'hygiène des denrées alimentaires.

56

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Jouve J.L. Le HACCP et l'Assurance de la Sécurité des Denrées Alimentaires. Option Qualité, 90, 1991, 11-23. Jouve J.L. HACCP as applied in theEEC. Food Control , 1994,5, 181-186. Jouve J.L. HACCP et Systèmes Qualité (ISO 9000). Option Qualité, 97, 1992, 11-15. Jouve J.L. L'Assurance de la Qualité Microbiologique des Aliments par le Système Analyse des Risques-Maîtrise des Points Critiques. Jouve J.L. La méthode HACCP : Guide de l'utilisateur. Fédération Française des Industries Charcutières. Document non daté. Jouve J.L. Maîtrise de la Qualité Hygiéniques des Denrées Alimentaires - Le Système HACCP. Médecine et Armées, 18, 1990,309-313. Leitao J. Application du système HACCP au nettoyage et à la désinfection. Documentation ASEPT, 1993. Lelieveld H.L.M. HACCP and hygienic design. Food Control, 1994,5,140-144. Lhoutellier P. La méthode HACCP : principes et mise en œuvre. Viandes Prod. Carnés, 1995,16,189-192. NACMCF (National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods). Hazcird Analysis & Critical Control Point System, HACCP Working Group, Chicago. 6-7 Novembcr 1989. NACMCF (National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods). Hazard Analysis & Critical Control Point System, HACCP Working Group, Chicago, 6-7 novembre 1989. NACMCF (National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods). Hazcird Analysis and Critical Control Point System, 20 Mars 1992. NACMCF (National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods). Hazard Analysis and Critical Control Point System. Int. J. Food Microbiology, 1992,16, 1-23. NACMCF (National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods). The rôle of regulatory agencies and industry in HACCP. ////. J. Food Microbiology, 1994,21,187-195. Notermans S., Gallhoff G., Zwietering M.H., Mead G.C. Identification of critical control points in the HACCP system with a quantitative effect on the safety of food products. Food Microbiology, 1995,12,92-98. Notermans S., Gallhoff G., Zwietering M.H., Mead G.C. The HACCP concept : spécification of criteria using quantitative risk assessment. Food Microbiology. 1995, 12,81-90. Notermans S., Zwietering M.H., Mead G.C. The HACCP concept : identification of potentially hazardous micro-organisms. Food Microbiology, 1994,11, 203-214.

La qualité

57

Pearson A.M., Dutson T.R. HACCP in méat, poultry and fish processing. Advances in méat research séries, volume 10. Blackie Académie & Professional. 1995. Pierson M.D., Corlett D.A. HACCP : Principles and Applications. Van Nostrand Reinhold, 1992. Potter M.E. The rôle of epidemiology in risk assessment : a CDC perspective. Dairy, Food and Environmental Sanitation, 1994,14,738-741. Rechtman J. HACCP. Un guide d'utilisation européen. Option Qualité, 1994, 116, 13-18. Riout J. Le guide de l'AMDEC machine. CETIM, 1994. Rozier J. HACCP. De la théorie à quelques contraintes. Co-édité par La Cuisine Salvat G. Colin P., Lahellec C. Une application du concept HACCP dans une usine fabricant des plats cuisinés sous-vide réfrigérés à base de volailles. V.P.C., 11, 1990,224-226. Salvat G., Colin P. L'application de la méthode HACCP dans les abattoirs de volailles. Viandes Prod. Carnés, 1995,16,212-222. Savage R.A. Hazard analysis critical control point : a review. Food Rev. Int., 1995, 11,575-595. Snyder P.O. Applying HACCP for Food Safety Assurance in the XXI st Century. Dairy, Food and Environmental Sanitation, 1990,10, 197-204. Snyder P.O. HACCP - an Industry Food Safety Self-Control Program - Part III. Dairy, Food and Environmental Sanitation, March 1992. Snyder P.O. HACCP - an Industry Food Safety Self-Control Program - Part IV. Dairy, Food and Environmental Sanitation, April 1992. Snyder P.O. HACCP - an Industry Food Safety Self-Control Program - Part IX. Determining the Thermal Lethality of a Process. Dairy, Food and Environmental Sanitation, September 1992. Snyder P.O. HACCP - an Industry Food Safety Self-Control Program - Part V. Dairy, Food and Environmental Sanitation, May 1992. Snyder P.O. HACCP - an Industry Food Safety Self-Control Program - Part VI. Dairy, Food and Environmental Sanitation, June 1992. Snyder P.O. HACCP - an Industry Food Safety Self-Control Program - Part XII. Food Processes and Control. Dairy, Food and Environmental Sanitation, December 1992. Snyder P.O. HACCP - an Industry Food Safety Self-Control Program - Part XII. Food Processes and Controls, Cont. Dairy, Food and Environmental Sanitation, January 1993. Sperber W.H. The Modem HACCP System. Food Technology, June 1991, 116-117. Sperber W.H. Use of HACCP System to Assure Food Safety. J. Assoc. Off. Chem., 1991,74,433,434.

58

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Stevenson K.E. Implementing HACCP in the Food Industry. Food Technology, May 1990,179-180. Stringer M.F. Safety and quality management through HACCP and Iso 9000. Dairy, Food and environmental Sanitation, 1994,14,478-481. Van Schothorst M., Jongcneel S. Line monitoring, HACCP and food safety. Food Control, 1994,5, 107-110. Veit P., Bonbled P. et Brock C. Hygiène des aliments : la directive-cadre est adoptée. Option Qualité, 109, 1993, 13-19. Veit P., Pierre O., Thomas J.-C. Le premier arrêté de transposition de la directive hygiène publié : la distribution alimentaire est concernée. B.I.D., 1995,10,36-43. Vergonjcanne J.C. Le système HACCP : Méthodologie. Thèse vétérinaire, 1993.

Deuxième partie

LES MICRO-ORGANISMES

Manipulation

1
LES SONDES NUCLÉIQUES : APPLICATIONS EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE
Angéli Kodjo

1.

Introduction

L'essor de la technologie de l'ADN au cours des dernières décennies a permis la naissance et la mise au point d'une technique d'analyse biologique de conception tout à fait nouvelle : l'hybridation moléculaire. Cette technique permet d'identifier de manière spécifique des fragments de matériel génétique (séquence d'acide riboou désoxyribonucléique) appartenant à des cellules, des virus, des bactéries ou des parasites. Après quelques notions de rappel et de définition, cet article se fixe pour objectif d'exposer les principales méthodes d'utilisation des sondes à l'aide de quelques exemples pratiques.

1.1

Rappel

Pour bien comprendre la notion de sonde nucléique, il convient de rappeler que chaque espèce vivante est caractérisée par un ensemble génétique dont l'unité fonctionnelle, le gène, désormais considéré comme une séquence de nucléotides est porté soit par un acide désoxyribonucléique ou ADN, soit par un acide ribonucléique ou ARN. La séquence des nucléotides au sein de l'ADN ou de l'ARN est caractéristique de chaque espèce et peut par essence constituer une clef que l'on peut utiliser pour son identification. L'utilisation des sondes nucléiques est justement l'une des possibilités offertes par les techniques de génie génétique. Exception faite du génome des Parvoviridae et de celui du bactériophage M 13, l'ADN, est toujours une longue molécule constituée de 2 chaînes antiparallèles,

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MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

complémentaires et enroulées en double hélice. Chaque chaîne est un polymère dont le maillon élémentaire, le nucléotide, est composé d'un sucre qui est le désoxyribose (d), d'une des 4 bases suivantes : adénine (A), thymine (T), guanine (G) et cytosine (C) et d'un groupement phosphate. Ces nucléotides sont sous forme native triphosphorylés (TP), on reconnaît ainsi le dATP, le dTTP, le dGTP et le dCTP ; le mélange de ces 4 nucléotides est habituellement désigné sous le vocable de dNTPs. Les nucléotides sont reliés entre eux par des liaisons phosphodiesters 3' —> 5' engageant le groupement phosphate et le sucre. Cet enchaînement régulier constitue ce que l'on appelle le squelette sucre-phosphate commun à toutes les molécules d'ADN. À l'inverse, l'ordre des bases greffées sur le sucre côté interne de la chaîne est spécifique à chaque molécule. La cohésion des 2 brins est assurée, à l'image d'une fermeture éclair, par les liaisons hydrogène que forment les bases entre elles selon la règle d'appariement suivante : adénine et thymine engagent 2 liaisons hydrogène tandis que cytosine et guanine forment une liaison plus stable grâce à 3 liaisons hydrogène. Les principales propriétés de cette molécule sont les suivantes : -elle peut être découpée en de nombreux petits fragments double brin par l'action d'un très grand nombre d'enzymes appelées endonucléases ou enzymes de restriction agissant comme des ciseaux ; - le double brin peut être défait par rupture des liaisons hydrogène sous l'action d'agents physiques ou chimiques dits dénaturants permettant l'obtention de simples brins (ouverture de la fermeture éclair) ; -enfin, placés dans des conditions favorables, les brins dénaturés peuvent à nouveau se réapparier selon la règle A - T ; G - T.

1.2

Le concept de sonde d'acide nucléique : définition

On définit ainsi une sonde nucléique comme étant un fragment d'ADN (ou d'ARN) capable de reconnaître dans un échantillon biologique une séquence nucléotidique complémentaire à la sienne et de former avec celle-ci une molécule double brin ou duplex stable au cours d'une réaction dite d'hybridation. Actuellement, plusieurs procédés sont disponibles pour obtenir diverses catégories de sondes (fleure I). La formation des duplex peut être mise en évidence en marquant préalablement la sonde par une molécule facilement détectable (isotopes radioactifs, haptènes ou molécules fluorescentes ou luminescentes...).

13

Méthodes de marquage des sondes

Le marquage d'une sonde repose sur l'incorporation d'une molécule marqueur dans la séquence nucléotidique. Cette incorporation doit respecter le plus possible les contraintes stéréochimiques de la sonde afin de ne pas gêner la formation des duplex. Selon le type de marqueur incorporé, on distingue le marquage isotopique ou radioactif communément appelé marquage chaud (le produit obtenu est souvent appelé sonde chaude) et le marquage non isotopique ou froid et dont le produit est une sonde froide.

Les micro-organismes

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Fragment d'intérêt = sonde

ADN

Isolement d'un fragment d'ADN

Production d'un fragment d'ADN par amplification génique en chaîne (PCR) Synthèse chimique d'une courte séquence = sonde oligonucléotidique

Clonage par génie génétique dans divers vecteurs, (phages, plasmides, cosmides...) Transcription d'un fragment d'ADN clone par ARN pol (SP6, T7, T3 pol) = Ribosonde

Figure 1 • Méthodes d'obtention des sondes. 13.1 Marquage isotopique

Au cours de ce marquage, plusieurs types de radio-isotope s peuvent être incorporés dans la sonde. Selon les objectifs visés, 4 types de radio isotopes (1251,35S, 3 H, 32 P) peuvent être incorporés dans la sonde. Il faut retenir que le 32P reste le plus utilisé en raison de sa très forte émission énergétique. Plusieurs méthodes enzymatiques permettent de catalyser l'incorporation de ces nucléotides dans les sondes. • La Nick Translation ou translation de césure, ou déplacement de coupure, la plus efficace de ces méthodes, permet d'introduire plusieurs molécules marqueurs dans la sonde, elle convient particulièrement au marquage des sondes longues. Cette méthode consiste en l'utilisation d'une petite quantité de DNase qui réalise au hasard des coupures dans la sonde, secondairement une ADN polymérase répare ces coupures à l'aide de nucléotides libres dont certains sont radiomarqués. L'activité spécifique de la sonde ainsi marquée est très élevée. •Le marquage 5' terminal ou 3' terminal utilise respectivement une nucléotide kinase T4 ou une nucléotidyl transférase pour catalyser l'accrochage du radio-isotope soit à l'extrémité 5' soit à l'extrémité 3 ' . Dans ce cas, une seule molécule marqueur est fixée à la sonde dont l'activité spécifique sera faible. Cette méthode ne convient qu'aux sondes courtes ou oligonucléotidiques. • Marquage par extension d'oligonucléotides non spécifiques ou « random labeling » utilise une mixture de 6 ou 9 nucléotides (respectivement désignés hexanucléotidiques ou nonanucléotidiques). Ces derniers vont se fixer de façon aléatoire sur la sonde dénaturée puis une ADN polymérase va catalyser l'incorporation de nucléotides libres dont certains sont marqués au cours de la synthèse du brin complémentaire. Cette méthode convient aux sondes longues, mais l'activité spécifique de la sonde est parfois moins bonne que celle obtenue par la Nick translation.

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MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

• Enfin, marquage par incorporation de nucleotides au cours d'une réaction d'amplification génique en chaîne ou PCR qui peut être considéré comme une variante amélioré du ramdom labeling. Ici, les amorces (primers) oligonucléotidiques (fonctionnellemcnt assimilables aux hexanucléotides ou nonanucléotides) sont incorporées dans une réaction biochimique ou intervient une ADN polymérase thermostable dont la plus anciennement connue est la Taq polymérase. Ces procédés de marquage isotopique, s'ils permettent d'obtenir, du fait de leur émission et de leur faible contrainte stéréochimique une très bonne sensibilité présentent cependant quelques inconvénients liés à leur nature radioactive. En effet, l'utilisation de ces substances soumise à autorisation implique des dispositifs de sécurité, de stockage et d'élimination. De plus, la période de ces éléments limite la durée de conservation des sondes ce qui suppose quasiment un marquage à chaque utilisation. Enfin, on note quelque fois une radiolyse des sondes, notamment avec le •'-P. C'est essentiellement pour pallier ces inconvénients que se sont développées les méthodes de marquage non isotopique. 1.3.2 Marquage non isotopique

Le principe général repose sur la fixation covalente ou biospécifique d'une molécule non radioactive sur l'ADN sonde selon des méthodes proches de celles utilisées pour le marquage immuno-enzymatique. On distingue schématiquement 2 types de méthodes : • Le marquage direct au cours duquel la molécule marqueur est directement fixée à l'ADN sonde. Le marqueur peut être, soit une molécule de faible poids moléculaire comme la fluorescéine, soit une macromolécule enzymatique telle que la peroxydase. • Au cours du marquage indirect, un haptene est fixé à la sonde et la détection se fera grâce à une protéine spécifique de l'haptène en général un anticorps. Les haptènes les plus couramment utilisés sont représentés par la biotinc, la digoxigénine, racétoxyacétylaminofiuorènc, ou encore la fluorescéine. Une variante de cette méthode consiste à détecter les hybrides après hybridation à l'aide d'anticorps anti ADN double brin. Que ce soit par marquage direct ou par marquage indirect, l'ancrage des molécules marqueurs s'effectue par voie chimique ou par incorporation de nucleotides prémarqués à l'aide des mêmes enzymes que pour le marquage isotopique. Ces procédés non soumis à autorisation présentent les avantages suivants : rapidité, stabilité et manipulation aisée et sont de ce fait réalisables dans de nombreux laboratoires. Cependant leur sensibilité est inférieure à celle obtenue par marquage isotopique, cet inconvénient est due en grande partie à l'encombrement stérique provoqué par la molécule marqueur. De plus, elles sont quelque fois à l'origine de bruits de fond compliquant l'interprétation finale. Qu'il s'agisse de marquage chaud ou de marquage froid, il existe dans le commerce de nombreux kits complets de marquage fournissant matériel (protocoles, enzymes, nucleotides, molécule marqueur...) et décrivant les modalités du marquage (tableau 1).

Tableau 1 • Méthodes de marquage des sondes et leurs principales applications.

Méthodes de marquage

Sensibilité

Applications principales

Exemples

Déplacement de coupure (Nick Translation)

Hybridation avec sondes longues en particulier Hydritation in-situ Hybridation en Southem blot Hybridation en Northern blot Hybridation en dot blot Hybridation sur colonies Nick Translation kit (Amersham, Bukinghamshire UK) Nick Translation kit (Boehringer, Mannheim, D) Nick Translation System (Promega, Madison, USA) avec sondes longues en en Southern blot en Northern blot en dot blot sur colonies

Marquage par extension d'hexanucléotides (Random priming)

Hybridation particulier Hybridation Hybridation Hybridation Hybridation

Rediprime, Megaprime, Mutiprime, ECL random prime system (Amersham) High Prime, High prime DNA labelling kit (Boehringer) Prime-a-Gene labelling (Promega)

Les micro-organismes

Marquage 5' terminal

DNA 5' labelling kit (Boehringer, Promega) ECL 5'-Thiol oligolabelling system (Amersham)

Marquage 3' terminal ou 3' endtailing

+ ou

Hybridation avec sondes courtes en particulier oligosondes synthétiques Séquençage (5' terminal) Hybridation en Southern blot Hybridation en Northern blot Hybridation en dot blot Hybridation sur colonies Hybridation in-Situ (3' terminal)

DNA 3' end labelling kit (Boehringer, Promega) DNA tailing kit (Boehringer, Promega) ECL 3' oligolabelling system (Amersham)

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Tableau 1 • (suite).

Méthodes de marquage

Sensibilité

Applications principales

Exemples

Hybridation avec toutes sondes Kits d'amplication génique en chaîne (PCR) dans lesquels un des nucléotides est remplacé par un nucléotide marqué. Disponibles chez de très nombreux distributeurs sous forme de kits.

Marquage au cours d'une réaction de PCR

Hybridation en Southern blot Hybridation en Northern blot Hybridation en dot blot Hybridation sur colonies Hybridation in-situ

Hybridation avec ribosondes Kits de transcription d'ARN in-vitw dans lesquels un des nucléotides est remplacé par un nucléotide marque. Exemple SP6/T7 transcription kit (Boehringer) : RNA labelling kit (Amersham)

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Marquage au cours d'une réaction de transcription in vitro

Hybridation en Southern blot Hybridation en Northern blot Hybridation en dot blot Hybridation sur colonies Hybridation In-Situ

Les micro-organismes

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Le choix du type de marquage à utiliser sera en partie conditionnée par l'équipement du laboratoire. La catégorie de sonde (longue ou courte) sera quant à elle fonction de l'objectif recherché. Signalons cependant que les sondes longues ou polynucléotidiques sont plus sensibles et plus spécifiques que les sondes courtes. À l'inverse les sondes courtes vont s'hybrider plus rapidement que les sondes longues, elles permettent en particulier de détecter des variations fines au niveau des séquences complémentaires du type mutation et/ou délétion de quelques bases. Dans le domaine du diagnostic microbiologique, elles seront utilisées pour rechercher une séquence complémentaire contenue dans un échantillon biologique au cours d'une réaction d'hybridation.

2. 2.1

Hybridation moléculaire : principes, procédés et méthodes Principe

L'hybridation moléculaire repose sur trois propriétés précitées de l'ADN : - la capacité de 2 chaînes complémentaires à former dans certaines conditions des molécules doubles brins stables ; - la réversibilité de la réaction double brin — simple brin ; » - enfin l'appariement spécifique des bases. Dans le cadre du diagnostic microbiologique l'une des chaînes en présence est représentée par une sonde marquée et l'autre par l'ADN contenu dans l'échantillon biologique préalablement dénaturé. Les hybrides ainsi formés seront ainsi facilement visualisables {figure 2).

2.2

Modalités d'hybridation

Classiquement la technique d'hybridation fait intervenir 4 étapes, dénaturation, hybridation, lavages et détection. 22.1 Dénaturation

Pour être optimale, la dénaturation doit intervenir après une étape de libération de l'acide nucléique contenu dans les cellules cibles. Les méthodes de lyse utilisées pour libérer et purifier les acides nucléiques impliquent : - une étape de rupture de la membrane cytoplasmique généralement par action d'un tensio-actif tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS, Sigma ou Merck) employé à 0,5 ou 1 % final ; - une étape de digestion des protéines cellulaires par diverses protéases, protéinase K ou pronase (Sigma, Merck, Bœhringer, Eurogentec.) utilisées généralement à une concentration finale de 50 à 400 u.g/ml ; - une étape de séparation et de purification des acides nucléiques habituellement réalisée par action d'un mélange stabilisé de phénol/chloroforme/alcool isoamy-

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MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

1. Principe ADN cible double brin ADN sonde Dénaturation de l'ADN cible en 2 brins pHélevé,95°C<T°<100°C Hybridation [Na Cl] * T° faible = Formation d'une courte hélice double brin entre la sonde et l'un des brins de l'ADN cible : l'appariement est déterminé par la complémentarité des séquences nucléotidiques contenues dans la sonde et l'ADN cible

« marqueur» (enzyme, fluorochrome, peroxydase, radio-isotope...) 2. Techniques et procédés d'hybridation Bactéries Virus

Extraction acide nucléique

I

Hybridation milieu liquide Hybridation milieu solide Hybridation in situ

I CO > «5 O)0

Dénaturation
j

W

Dénaturation Frottis d'organe

Détection

Sonde marquée

Figure 2 • Principe et procédés d'hybridation.

lique en proportions respectives de 25/24/1 et saturé en tampon Tris EDTA (EDTA 1 mM ; Tris-HCl 10 mM) ou Tris EDTA Sodium à pH 8 (Tris-HCl 0,05 M ; EDTA 0,5 M ; NaCI 0,1 M). Ces mélanges très largement employés en biologie moléculaire peuvent être préparés localement ou mieux, s'obtenir prêts à l'emploi chez de très nombreux distributeurs (Appligène, Interchim...). Ce schéma valable pour les cellules animales, doit être légèrement modifié pour les cellules bactériennes. En effet, du fait de la nature particulière de leur paroi, ces dernières doivent subir au préalable un traitement visant la désintégration du peptidoglycane, composant rigide de cette paroi. Diverses substances telles que le lysozyme (Sigma, Merck), la lysostaphine (uniquement disponible chez Sigma), et l'achromopeptidase (Merck, Sigma) seront ainsi utilisées à des concentrations finales de l'ordre de 0,1 à 4 mg/ml selon le groupe de bactéries à traiter. Un broyage mécanique par billes de verre ou par ultrasons peut également s'envisager. Cette étape préliminaire de destruction de paroi reste quasi obligatoire pour les bactéries à Grain positif (figure 3a).

Les micro-organismes

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Destruction de la paroi

Destruction de la membrane cytoplasmique + Digestion des protéines (et des ARN)

Cellule bactérienne

Lysozyme 1 à 2 mg/ml final 37 °C/1 h

Séparation en gel d'agarose contenant 0,5 /jg/ml de bromure d'éthidium + observation sous UV Cathode Grands fragments

- Action du SDS (0,5 à 1 % final) - de la protéinase K (50 à 100 mg/ml final) de la ARNase (50 mg/ml final) 60°C/1 à 2 h

Purification Action d'endonucléase de restriction ADN (phase aqueuse) Débris cellulaires Phase phénolique

Anode

Petits fragments

Phénol/Chloroforme/alcool Isoamylique (25/24/1 ) + centrifugation

Figure 3a • Extraction purification de l'ADN bactérien, digestion, séparation des fragments en vue d'une hybridation de type Southern.

Pour rendre l'ADN cible accessible à la sonde il convient maintenant de séparer les doubles brins de la chaîne native en brins monocaténaires. Cette étape n'est pas indispensable lorsque l'on recherche des acides nucléiques constitutivement monocaténaires tels que l'ARN, cependant elle permet de défaire la structure conformationnelle secondaire de telles molécules, les rendant ainsi plus accessibles aux sondes. La dénaturation s'obtient par chauffage de l'échantillon biologique à 95 °C100 °C pendant 5 à 10 minutes ou par action d'agents chimiques dits dénaturants tels que la soude 0,5 à 1 M. Lorsque la sonde utilisée pour l'hybridation est sous forme bicaténaire elle doit subir également une dénaturation dans les mêmes conditions. Les chaînes ainsi dénaturées sont maintenues sous cette forme sous l'action du froid (glace pilée). 222 Hybridation et préhybridation

Une fois dénaturées, les chaînes cibles et sondes sont mises en présence l'une de l'autre afin de permettre leur appariement. Il faut dans la réaction un ratio sonde/cible (entre 1/1000 à 1/2000) tel que les fragments sondes aient plus de chance de s'apparier avec les fragments cibles qu'entre eux. Bien entendu, ce ratio dépend également de la méthode de marquage, il sera plus faible pour un marquage

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MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

- Dénaturation dans le gel des fragments d'ADN (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI) puis - Neutralisation (0,5 M TrisHCI pH 7,5 ; 1,5 M NaCI) Transfert type Southerm (12 à 16 heures) Masse d'environ 700 g Plaque Papier absorbant , Papier Whatman 3MM ^ Membrane de nylon^ Gel Papier Whatman 3MM Transfert sous vide (45 min à 1 h 30)

Tampon SSC 20 X (3M Na Cl ; 0,3 M trisodium citrate)

Tampon SSC20X

Cuves Sens du transfert Sens du transfert

Vide 30 à 50 cm H,0

Fixation des ADN sur la membrane de nylon - U V cross link 0,12 j/cm 2 - Cuisson 2 h à 80 °C

Stockage ou hybridation Figure 3b • Transfert des fragments d ' A D N sur membrane de nylon.

Gène ADN ribosomal

Amplification génique en chaîne (PCR) avec amorces sur fractions conservées + marquage simultané avec dNTPs dont certains sont marqués Exemple : Système Digoxigénine (Bœrhinger)

Sonde rDNA16S marqué

ARN ribosomal 16-23 S purifié à partir de bactéries

- Transcriptase inverse

ADNc16-23S

• Marquage chimique direct ou indirect par haptène exemples : - Kit de marquage direct ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK) marqueur = peroxydase de Raifort

Clonage dans un vecteur plasmidique Amplification biologique Marquage par random priming

- Kit AAF (Eurogentec, Seraing, B) sonde commerciale marquée par haptène = Acétylaminofluorène Figure 3c • Stratégies potentielles de préparation des sondes utilisées en ribotypie.

Les micro-organismes

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Préhybridation (60 à 65 °C) 2 à 3 heures Hybridation (60 à 65 °C) 16 heures (une nuit) Lavages - 1 er lavage à la température d'hybridation (lavage stringent) - 2e lavage à la température du laboratoire Détection : - réaction immunologique 1 (reconnaissance de l'haptène par un Ac) - réaction immunologique 2 (reconnaissance de I'Ac par un anti-Ac couplé à la phosphatase alcaline) - lavage puis détection colorimétrique des hybrides sur la membrane

Saturation de la membrane Hybridation ARN - ADN

AAF

Élimination des fragments de sondes non hybrides

AP
Ac anti Ac Ac anti AAF

Substrat Réaction colorée

APAc anti Ac Ac anti AAF

Figure 3d • Préhybridation, Hybridation et détection (sonde ARN-AAF). radioactif par définition très sensible. Les conditions physicochimiques de la réaction déterminent en partie la spécificité de cette hybridation. En effet, pour un ADN donné, il existe une température à laquelle environ 50 % de la chaîne est sous forme dénaturée, c'est la Tm (melting température) ou température de demi-dénaturation. Pour une chaîne oligonucléotique donnée la Tm est calculée par la formule Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) où G, C, A et T sont respectivement le nombre de bases guanine, cytosine, adénine et thymine. Par exemple, pour une chaîne (monocaténaire) de 21 nucléotides comprenant 5 guanines, 4 cytosines, 7 adénines et 5 thymines la Tm est égale à 4 (5 + 4) + 2 (7 + 5) = 60 °C. Lorsque la réaction d'hybridation s'effectue à des températures très voisines de cette Tm, bien entendu en dessous de cette dernière, seuls les hybrides spécifiques sont stables. Cette Tm va définir la spécificité souhaitée pour une réaction d'hybridation. Il est ainsi possible de faire varier la température de même que les conditions salines selon le degré de spécificité désiré. On considère habituellement que la température de spécificité optimale est égale à la température de demi dénaturation moins 5 °C (Tm - 5 °C) (55 °C dans l'exemple précédent). Ces considérations ne sont valables que pour une concentration saline et/ou ionique standard dont la concentration saline varie de 0,1 à 1 M en tampon de Denhardt c'est-à-dire (0,02 % polyvinylpyrrolidone, 0,02 % Ficoll 400 et 0,02 % sérum albumine bovine). Selon les laboratoires, la composition de ce tampon subi différentes modifications en vue d'une adaptation à différents usages notamment pour les sondes froides. L'influence de la température peut ainsi être modulée par la

72

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

concentration saline et le pH du milieu réactionnel. À pH 7,5-8, les fortes concentrations salines favorisent la formation et la stabilisation des duplex. On dit que les conditions d'hybridation sont peu stringentes, autrement dit, peu spécifiques. À l'inverse, la spécificité ou stringence est augmentée dans les conditions suivantes : température élevée (très voisine de la Tm), pH élevés (milieux contenant formamide, soude ou urée), concentration saline basse. Très souvent, préalablement à l'hybridation proprement dite, il convient d'effectuer une saturation du support d'hybridation et des sites non spécifiques de l'ADN cible par inondation du milieu réactionnel avec de l'ADN d'une espèce phylogénétiquement très différente, l'ADN de sperme de hareng ou de saumon sont les plus utilisés. Cette étape dite de préhybridation évite la dispersion de la sonde et optimise l'hybridation, en particulier lorsque l'hybridation s'effectue sur une membrane. 223 Le lavage

Il vise à éliminer l'excès de sonde non fixée sans défaire les hybrides. Les tampons utilisés et les températures doivent de ce fait respecter l'intégrité des hybrides formés, leur degré de salinité est ainsi défini pour chaque type de sonde. Étape simple, elle demeure indispensable et incontournable. 2.2.4 Détection

La dernière étape de l'hybridation est la détection des duplex éventuellement formés au cours de la réaction. Cette détection dépend bien évidemment de la nature de la molécule marqueur. Ce sera l'autoradiographie ou la scintillation pour le marquage isotopique, la transformation d'un substrat chromogène, la fluorescence ou l'autoradiographie dans le cas de chimioluminescence pour les marquages froids.

23

Procédés d'hybridation

Trois procédés sont actuellement utilisés pour réaliser l'hybridation (figure 2), Il s'agit de l'hybridation en milieu liquide, l'hybridation sur support solide, et enfin l'hybridation in situ. 23.1 L'hybridation en milieu liquide

L'ensemble des réactions de dénaturation et d'hybridation est réalisé en tampon liquide dans un tube d'hybridation. Plusieurs variantes peuvent être employées pour capter les hybrides. Dans la méthode à l'hydroxyapatite le liquide réactionnel est élue à travers un gel d'hydroxyapatite qui va retenir les duplex hybrides pour l'analyse tandis que les chaînes monobrins sont éliminés. Au cours de la variante à la nucléase SI les chaînes monobrins libres contenus dans le milieu réactionnel sont hydrolysées par la nucléase SI, une aliquot de tampon d'hybridation est ensuite transférée sur un filtre de nylon ou de nitrocellulose en vue de l'analyse. Dans une autre variante employée en microbiologie alimentaire dans les systèmes GENE-

Les micro-organismes

73

Système ACCU-PROBE GEN-PROBE (Distributeur EURALAM) Lyse des bactéries Libération des acides nucléiques (ARN)

Système GEN-TRAK (Distributeur AGROBIOTESTS)

Libération des acides nucléiques (ARN)

Hybridation milieu liquide 60°C/15min Hybridation + 65 °C/5 min Destruction chimique de la molécule marqueur (Ester d'Acridium) sur les sondes non hybrides 65 °C/1 h hybridation + capture simultanée des hybrides sur support solide (triple hybridation) Sonde de détection marquée à la fluorescéine

Sonde marquée à l'ester d'acridium

ADN cible

ADN cible Sonde de capture (hybridation poly A-poly T sur support plastique)

Détection + H202 + NaOH -» émission de photons -> Lecture au luminomètre = Chimilumescence en milieu liquide + Anticorps anti fluorescéine couplée à la peroxydase de raifort + substrat de la peroxydase - ) Lecture au spectrophotomètre = système proche de l'Elisa

Applications Listeria monocytogenes (validé Afnor : lait et produits laitiers, validation tout produit en cours) Staphylococcus aureus Campylobacter Listeria (validé Afnor : tout produit) Listeria monocytogenes (validé Afnor : tout produit) Escherichia coli Salmonelia (validation en cours) Staphylococcus aureus Campylobacter Yersinia enterocolitica

Figure 4 • Systèmes de diagnostic GENE-TRAK et GEN-PROBE en microbiologie alimentaire. TRAK 2 types de sonde sont simultanément ajoutées dans le milieu reactionnel, l'une permettant la reconnaissance de la séquence cible et l'autre couplée à une molécule marqueur autorisant la révélation (figure 4). L'hybridation en milieu liquide est rapide ; trente minutes à 2 heures sont généralement suffisantes pour l'hybridation.

74

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

232

L'hybridation in situ

Elle se réalise à partir de calques d'organe. L'hybridation particulièrement longue (jusqu'à 40 heures) va mettre en évidence les ARN messagers et ou les gènes chromosomiques à l'intérieur des cellules. Ce procédé, actuellement en plein essor dans le domaine de la recherche fondamentale, permet l'étude des rapports entre virus bactéries et cellules. 233 L'hybridation sur support solide

C'est le procédé le plus couramment utilisé. Là encore, plusieurs variantes sont disponibles. 2.3.3.1 Le dot/slot blot

Après lyse cellulaire, les échantillons sont immobilisés (soit par dépôt simple = dot, soit par aspiration = slot) sur un support solide en filtre de nylon ou de nitrocellulose. Dénaturation, hybridation, lavage et détection ont lieu sur la membrane. Ce procédé fournit une bonne sensibilité. Si la durée nécessaire à l'hybridation est plus longue que précédemment, cette méthode présente entre autres avantages de permettre le traitement de plusieurs échantillons par membrane. 2.3.3.2 Le Southern blot et ou Northern blot

Au cours de ce procédé, l'ADN extrait de l'échantillon est d'abord digéré par une ou plusieurs endonucléases. Les fragments obtenus, séparés par électrophorèse, sont ensuite transférés sur une membrane (nylon ou de nitrocellulose). Ce transfert est désigné sous le vocable de Southern blot. Lorsque ce transfert intéresse des ARN, il porte le nom de Northern blot. La dénaturation a lieu soit avant le transfert soit en cours de transfert. Ce procédé permet, outre l'étude de plusieurs échantillons, une double analyse, d'abord d'après le profil électrophorétique obtenu après digestion enzymatique ou REA (Restriction Endonuclease Analysis) puis d'après le signal d'hybridation. Son inconvénient réside dans la nécessité de disposer d'une quantité relativement importante d'ADN cible cardes pertes sont possibles au cours du transfert. Un soin particulier doit donc être apporté à l'extraction de l'ADN. Il est également possible de contourner cette difficulté grâce à l'amplification enzymatique ou PCR.

3.

Applications en microbiologie

La technique d'hybridation d'acide nucléique est un outil dont l'utilisation s'est considérablement répandue dans divers domaines de la biologie. En microbiologie 3 grands domaines d'application sont concernés, la taxonomie, l'épidémiologie des souches bactériennes (ou virales) et le diagnostic. Les exemples pratiques exposés sont empruntés à l'épidémiologie et au diagnostic bactériologique.

Les micro-organismes

75

3.1

Applications dans le diagnostic microbiologique alimentaire

La technique d'hybridation est en théorie applicable au diagnostic de tous les micro-organismes présents dans les aliments dès lors que l'on a identifié les séquences spécifiques d'espèce ou de type. Cependant, compte tenu de la performance de certains marqueurs classiques notamment, biochimie, anticorps monoclonaux, sérotypie ou lysotypie, elle est essentiellement appliquée au diagnostic des germes présentant un réel intérêt en termes de marqueur de salubrité et de santé publique, notamment au diagnostic de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, de Salmonella spp., des espèces du genre Listeria et de Listeria monocytogenes. L'identification d'autres bactéries telles que Campylobacter et Yersinia enterocolitica est également possible. En diagnostic microbiologique alimentaire, deux systèmes connus sous les terminologies de système GENE-TRAK et GEN-PROBE (figure 4) commercialisés respectivement par les laboratoires Agrobiotests (35769 Saint-Grégoire cedex) et Euralam (69429 Lyon cedex 03) utilisent le procédé (le plus rapide) de l'hybridation en milieu liquide dont la démarche est présentée à la figure 4. Leur principe diffère légèrement par la nature de la molécule marqueur. La sonde est marquée par la fluorescéine dans le système GENE-TRAK, la détection (marquage indirect) s'effectuant grâce à des anticorps conjugués à la peroxydase. Une détection colorimétrique est alors réalisée au spectrophotomètre selon une approche analogue à celle des tests Elisa. Dans le procédé GEN-PROBE, la sonde est marquée par un ester d'acridium (marquage direct), molécule qui en présence d'eau oxygénée et de soude est capable d'émettre des photons détectables par chimioluminescence, grâce à l'utilisation d'un luminomètre. Quel que soit le système adopté, les kits disponibles auprès des distributeurs cités, incluant tous les réactifs et protocoles nécessaires, sont d'utilisation aisée et permettent de ramener le délai de réponse à environ 48 heures. Un protocole utilisant le procédé GEN-PROBE, reproduit avec l'autorisation du laboratoire Euralam, est fourni en exemple (figure 5). Hormis les réactifs et les systèmes de détection utilisés dans ce protocole, la démarche générale reste identique pour tous les kits disponibles en microbiologie alimentaire et autorise un gain considérable de temps par rapport aux systèmes conventionnels de diagnostic.

3.2

Applications épidémiologiques

Le typage moléculaire doit permettre de suivre l'évolution dans le temps et la dissémination dans l'espace d'une souche bactérienne (ou virale) définie. La diversité des gènes d'un organisme constitue une extraordinaire source d'investigation exploitable par l'épidémiologiste. De nombreux outils épidémiologiques ou marqueurs épidémiologiques de nature moléculaire ont ainsi élargi les moyens d'analyse de la microbiologie et parmi ces méthodes l'analyse des profils de restriction des gènes codant les ARN ribosomaux (souvent appelé ribotypage) s'est rapidement imposée comme système universel de typage des bactéries. En effet, ce gène qui existe en une ou plusieurs copies chez les bactéries présente sur le chromosome bactérien des loci variables d'une espèce à l'autre et souvent d'une souche à une autre au sein d'une même espèce. Il suffit donc de disposer d'une sonde correspondant à ce gène

76

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

J0-»

Prise d'essai + Bouillon Fraser demi 25 g 225 ml 18-24 h à 30 °C Homogénéisation + Incubation

J1->

Ensemencement sur gélose sélective (ex. : gélose Oxford) (méthode en strie large à l'écouvillon) Incubation de la gélose 18-24 h à 37 °C Remise du bouillon en incubation 18-24 h à 30 °C

J2-> - Soit présence de colonies caractéristiques ou non sur la gélose : = Réalisation en tube du test d'identification rapide par sonde spécifique 1. Prélever les colonies à l'aide d'une ose calibrée à 1/JI. 2. Ajouter 50 /il de réactif 1 et incuber au bain-marie à 37 °C - 5 min (lyse de bactéries). 3. Ajouter 50 /JI de réactif 2 et incuber au bain-marie à 60 °C -15 min (hybridation spécifique). 4. Ajouter 300 JJ\ de réactif 3 Vortexer et incuber au bain-marie à 60 °C - 5 min (destruction du marqueur de la sonde non hybridée). 5. Lecture sur luminomètre AcculLDR ou LEADER 50. - Soit absence de colonies sur la gélose ou test d'identification par sonde spécifique négatif : = Ensemencement du bouillon initial sur gélose sélective -> Incubation 24 h à 37 °C. = Prolonger de 24 h l'incubation à 37 °C de la gélose. J3-» Réalisation en tube du test d'identification rapide par sonde spécifique sur les colonies caractéristiques ou non.

Figure 5 • Protocole de détection rapide de Listeria monocytogenes dans le lait et les produits laitiers par méthode GEN-PROBE ACCUPROBE. (Validation Afnor n° EUR 15/02/95) pour révéler la diversité ou l'unicité des souches dans une espèce bactérienne. Comme ce gène est resté relativement bien conservé, chez les procaryotes (du moins dans certaines régions), il est possible (en théorie) à partir d'une sonde constituée d'ARN ribosomique 16S et 23S (obtenu à partir de Escherichia coli par exemple) de typer plusieurs souches bactériennes appartenant à des genres très différents. Ce qui est effectivement le cas comme le démontre la somme considérable de publications réalisées avec cette seule sonde. Bien entendu, cet outil qui fournit en quelque sorte la carte d'identité d'une bactérie (figure 3), doit pouvoir fournir aux industriels du secteur agro-industriel, un moyen d'identification, de typage et d'épidémiologie des souches bactériennes utilisées. L'exemple proposé expose les modalités potentiellement existantes pour l'obtention de la sonde et son utilisation. Dans notre laboratoire, nous utilisons en routine les sondes marquées chimiquement à l'AAF et disponible sous sa forme de kit prêt à l'emploi (Eurogentec, Seraing, Belgique). Cet outil

Les micro-organismes

77

trouve son application dans la défense de la propriété industrielle, et/ou dans le dépôt de souches à breveter. En outre, utilisé au cours des toxi infections collectives d'origine alimentaire, il constitue un puissant moyen permettant de remonter à la source primitive de l'épidémie.

Conclusion
Les progrès réalisés dans le domaine de la technologie des acides nucléiques ont permis l'utilisation des sondes nucléiques dans de très nombreux domaines. En microbiologie alimentaire, l'amélioration des systèmes de marquage non radioactif, la performance et la simplicité d'emploi des sondes froides, notamment lorqu'elles sont vendues sous forme de Kits autorisent leur diffusion dans de très nombreux laboratoires.

Références bibliographiques
Barry J.B., Jonathan O.C., Nucleic Acid Hybridization : Application to Diagnosis of Microbial infections and to Genotypic analysis. 1989. In : Animal biotechnology, 107-137. Babiuk and Philips, Pergamon Press Edit. Dodet B. 1987. Les nouveaux diagnostics biologiques. La Recherche. 18 : 658-668. Grimont F., Chevrier D., Grimont P.A.D., Lefevre M., Gusedon J.L. 1989. Acetylaminofluorene labelled ribosomal RNA for use in molecular epidemiology and taxonomy. Res. Microbiol. 140 : 447-454. Kaplan, J.-C., et Delpech M. 1989. Biologie moléculaire et médecine. MédecineScience, Flammarion Edit. Paris

Manipulation

2
MÉTHODES DE RECHERCHE, DE DÉNOMBREMENT ET D'IDENTIFICATION DE CAMPYLOBACTER JEJUNI
Éric Dromigny

Introduction
Campylobacter jejuni fait partie à l'heure actuelle des préoccupations majeures des microbiologistes et des hygiénistes. L'intérêt de proposer des travaux pratiques portant sur C. jejuni est triple. • En premier lieu, la mise au point dans les années 1970 et 1980 de méthodes fiables de recherche de C. jejuni dans les selles diarrhéiques a permis en effet de révéler son importance en tant qu'agent de gastro-entérites chez l'homme. C'est ainsi que les chiffres publiés tant en France qu'à l'étranger font état d'une fréquence égale sinon supérieure à celle des infections humaines dues aux Salmonclles ( 1 ) (2). Cette fréquence élevée des campylobacterioses humaines fait de C. jejuni une bactérie d'importance médicale que l'on peut être amené à manipuler au laboratoire d'analyses médicales. • En second lieu, C. jejuni est maintenant reconnu en France comme responsable de maladies microbiennes alimentaires. Il peut être transmis au consommateur par divers vecteurs, comme l'eau et surtout le lait ou diverses viandes de volailles ou de boucherie mal cuites. À ce titre, en 1988, à l'occasion de la diffusion d'une brochure du journal officiel de la République Française relative aux toxi-infections alimentaires (3), C. jejuni était inclus dans la liste des agents majeurs de maladies d'origine alimentaire. Il n'existe pas encore de véritable critère microbiologique imposant sa recherche dans les aliments, mais sa recherche, voire son dénombrement peuvent être effectués dans le cadre d'expertises ou d'enquêtes menées à l'occasion de suspicion de transmission alimentaire.

Les micro-organismes

79

C'est aussi un micro-organisme qui peut être recherché dans le cadre du contrôle de conformité imposé par le législateur et reposant sur les principes de l'analyse des risques et des points critiques pour leur maîtrise (ou « HACCP »). C'est par exemple le cas pour les produits alimentaires remis directement au consommateur et régis par l'arrêté ministériel du 9 mai 1995 (4). Les occasions de mettre en évidence Campylobacter jejuni peuvent donc être particulièrement nombreuses au laboratoire d'hygiène alimentaire. • Enfin, C. jejuni est un micro-organisme que l'on peut qualifier de « fastidieux » car sa culture et son identification demande au manipulateur une certaine habitude. Il exige pour sa croissance des milieux spécifiques et enrichis, ainsi qu'une atmosphère pauvre en oxygène, sans lesquels on ne peut espérer le mettre en évidence. Même dans les conditions idéales, sa croissance n'est pas très rapide et demande bien souvent au moins deux jours. C'est une bactérie sensible aux microflores concurrentes et dont la conservation est délicate. Son identification fait appel à des tests d'interprétation souvent délicats. Cette difficulté est, en fait, un sujet de choix pour des travaux pratiques. Pour toutes ces raisons, nous présentons ici une séance de travaux pratiques portant sur C. jejuni, en proposant plusieurs options sur la base d'une séance relativement simple et en donnant un ensemble de renseignements pratiques pour la réussite des travaux pratiques. Après une partie consacrée à de brefs rappels surtout destinés à donner les principales caractéristiques de la bactérie pouvant être rappelées par le moniteur de travaux pratiques en séance introductive, ce chapitre sera présenté en cinq parties désormais classiques : principe, matériel, mode opératoire, résultats, et interprétation.

1. 1.1

Les bactéries du genre Campylobacter : éléments généraux Taxonomie

Campylobacter représente le groupe V de la deuxième section du Bergey's Manual (9e édition), regroupant des bactéries : aérobies, microaérophiles, mobiles, hélicoïdales, (vibrions), à Gram négatif. Campylobacter est une bactérie de 0,2 à 0,5 um de large et de 0,5 à 8 um de long, à une ou plusieurs ondulations (forme vibrionnaire). Le vibrion est mobile par l'intermédiaire d'un flagelle présent à un ou deux pôles de la cellule bactérienne. C'est une bactérie au métabolisme respiratoire nécessitant une teneur en oxygène allant de 1 à 15 % (optimum : 5 %) et une concentration en gaz carbonique d'environ 3 à 5 % (quelques souches pouvant cultiver en aerobiose), ne fermentant et n'acidifiant jamais les glucides, possédant une oxydase, n'hydrolysant ni la gélatine, ni l'urée, ne produisant pas de pigments.

80

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

Les Campylohacter les plus importants se cultivent aussi à 42 °C, on les dénomme pour cela Campylohacter thermotolérants par opposition avec Campylohacter fétus qui ne se cultive pas à 42 °C mais à 25 °C.

1.2

Caractères généraux de culture

Les bactéries du genre Campylohacter sont caractérisées par une grande exigence en ce qui concerne les conditions de culture. Il n'est en effet pas possible d'assurer leur croissance en présence d'air et sur les milieux ordinaires. La première condition de leur croissance est la microaérophilie. Ils ne se cultivent que dans une atmosphère ou un milieu liquide pauvres en oxygène. La teneur optimale en oxygène est évaluée à 5-6 %. A l'exception des souches dites aérotolérantes, la croissance en atmosphère ambiante (20 % d'O,) est habituellement impossible : il y a alors accumulation dans la cellule bactérienne de peroxyde d'hydrogène qui inhibent sa croissance. La deuxième condition de croissance découle de la précédente : pour atténuer la toxicité de l'oxygène, on doit fournir aux campylobactéries des milieux riches. Certains facteurs de croissance contrebalancent la toxicité des tensions trop élevées d'oxygène : le sang joue un rôle favorable en permettant la synthèse d'enzymes qui interviennent dans la destruction des peroxydes, avant que la synthèse de la catalase (pour les espèces qui en produisent) ne soit suffisante. Des agents soufrés réducteurs tels le thioglycolate, jouent en outre un rôle favorable. De plus, le gaz carbonique, même en faible quantité, est nécessaire à la croissance de Campylohacter. La troisième condition de croissance est l'inhibition ou l'élimination des microflores associées. Campylohacter est un mauvais compétiteur biologique. Il cultive lentement. On ne l'isolera que difficilement au sein de la dore fécale ou alimentaire. Enfin, la quatrième condition de croissance est une température d'incubation de 37 °C ou 42 °C. Les espèces dites thermotolérantes présentent une croissance à 42 °C, ce qui n'est pas le cas de C. fétus. Par contre à 25° C, seul C. fétus et quelques autres Campylohacter cultivent (tableau 1). En règle générale, la durée d'incubation sera d'au moins 48 heures, en raison de la lenteur du développement de Campylohacter. On les maintiendra en croissance jusqu'à 5 jours pour les souches les plus lentes. Même dans ces conditions quasi-idéales, la culture de Campylohacter est pauvre : des colonies de petite taille, transparentes, parfois envahissantes apparaissent en 48 heures sur milieu solide ; en milieu semi-gélosé, la culture apparaît dans une zone cylindrique ayant 4 à 10 mm de hauteur, située à quelques centimètres de la surface (106). Elle se présente aussi souvent sous forme coccoïde et notamment à partir de 24 heures de croissance.

Les micro-organismes

81

C'est une forme de dégénérescence qui s'avère très difficile à cultiver mais qui semble conserver son pouvoir pathogène, au moins au début de la dégénérescence. C'est une forme qui apparaît plus vite à 42 °C. Elle pourrait être associée à l'absence de croissance de certaines souches et de leur caractère spontanément non cultivable. Il faut savoir la reconnaître sous coloration de Gram. C'est pourquoi nous en reparlerons avec le diagnostic différentiel (5.3.2. Les pièges du diagnostic différentiel).

13

Caractères généraux d'identification

Parmi les caractères métaboliques de Campylobacter, il faut retenir que : - Campylobacter ne fermente et n'acidifie jamais les glucides ; le métabolisme est de type respiratoire ; - Campylobacter n'hydrolyse ni la gélatine ni l'urée et ne produit pas de pigment ; - il ne réduit pas les nitrates en nitrites ; - il possède pas ou peu d'enzymes ; - toutes les espèces de Campylobacter possèdent une oxydase mais seules certaines d'entre elles produisent une catalase telles que celle de Campylobacter jejuni.

2.

Principe

Cette séance de travaux pratiques comprend la mise en œuvre de méthodes permettant d'une part de se familiariser avec la bactérie elle-même en travaillant sur des souches de laboratoire. Elle comprend d'autre part la mise en œuvre des méthodes de recherche et d'identification, voire de dénombrement de cette bactérie dans les conditions de la pratique, c'est-à-dire dans les aliments d'origine animale. Enfin seront présentées des méthodes de recherches de souches sauvages. L'enseignant pourra ainsi choisir dans les trois approches celle qui sera la plus adaptée au temps dont il dispose pour ces travaux pratiques et en fonction des possibilités de manipulation des étudiants. D'un point de vue général, les milieux et techniques de la microbiologie classique seront supposés connus et maîtrisés et seront donc simplement cités. Ne seront véritablement développés que les milieux et techniques spécifiques de C. jejuni, et notamment ceux qui sont déterminants pour la réussite de la manipulation. Nous rappellerons enfin que C. jejuni est une bactérie pathogène pour le manipulateur et que toutes les précautions doivent être prises pour éviter l'ingestion des cellules de cette bactérie (pipettes convenablement cotonnées, poubelles de paillasse pourvues en désinfectant, port de blouses de laboratoire, nettoyage convenable des

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MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE

mains, stérilisation suffisante du matériel usagé...). En effet, même en faible quantité, son ingestion peut être à l'origine de troubles digestifs qui sont parfois graves.

3.
3.1 3.1.1

Matériel
Souches de laboratoire Comment se les procurer ?

Le mieux est de se fournir en souche auprès de collections de souches bactériennes, telle que la Collection de l'Institut Pasteur, qui dispose d'une série d'environ 10 souches. On se procurera la souche type de l'Institut Pasteur C. jejuni CIP 70 80 T, la souche type de l'Institut Pasteur C. coli CIP 70 2 T (pour disposer d'un témoin négatif pour l'hydrolyse de l'hippurate). Toutefois, de façon plus économique, des souches sauvages de Catnpylobacter thermotolérants peuvent être facilement obtenues par isolement à partir du contenu digestif de poulets ou d'autres volailles de chair, voire de matières fécales de ruminants ou de porcs (on isolera souvent C. coli dans ce dernier cas). Cet isolement pourra être réalisé avec les milieux que nous proposons dans la partie 3.2.1 Géloses, et avec la technique décrite dans la partie 4.3 Mise en évidence de souches sauvages. Éventuellement, on associera à ces souches : - une souche de C. lari, résistante à l'acide nalidixique ; - u n e souche de Catnpylobacter fétus subsp../i?/(/i, ce qui procurera un témoin négatif pour la croissance à 42 °C et un positif pour la croissance à 25 °C ; - une souche <X Helicobacter pylori, ce qui permet d'étoffer le diagnostic différentiel avec des souches de morphologie proche de celles de C. jejuni ; - une souche d'Enterococcus, ce qui procurera un témoin positif pour le test de l'hydrolyse de l'hippurate. 3.12 Comment les conserver ?

La conservation des souches de C. jejuni est toujours un point extrêmement délicat, car c'est une bactérie qui a tendance à dégénérer rapidement. Contrairement aux bactéries classiquement recherchées au laboratoire d'hygiène alimentaire, il n'est pas possible de la conserver au delà de quelques jours à température ambiante. Cette conservation doit être réalisée de deux manières : 3.1.2.1 Conservation de courte durée

La conservation de courte durée permet de conserver une souche d'une séance de travaux pratiques à l'autre. Elle est réalisée à même le milieu qui a servi à la croissance de la bactérie. Par exemple, la souche est ensemencée dans un milieu au thioglycolate contenant 2 mg

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d'amphotéricine B et conservée à l'étuve à 37 °C. La subculture tous les deux jours permet (en général) de conserver la souche. Ou bien la souche est conservée pendant environ 1 semaine à + 4 °C, sur la gélose qui a servi à son isolement, avec toutefois le risque, s'il s'agit d'une gélose sélective et d'un échantillon contenant une microflore concurrente, de voir cette dernière se multiplier et rendre l'isolement de C.jejuni impossible. Il faut aussi compter avec la dégénérescence de la souche sous forme coccoïde. 3.1.2.2 Conservation de longue durée

• Congélation Une solution rapide est de prélever environ 1 ml de Campylobacter en culture pure de 24 h sur bouillon Brucella avec une pipette stérile, que l'on dépose dans un cryotube placé ensuite à - 80 °C ou mieux dans l'azote liquide, avec si c'est possible du sérum de veau fœtal. • Lyophilisation La lyophilisation permet de conserver environ un an ou deux les souches de Campylobacter. Toutefois, la meilleure solution, si on veut conserver à tout prix la ou les souches, est de faire appel à plusieurs techniques (lyophilisation + congélation à -80 °C), plusieurs tubes ou flacons étant ensemencés par technique de conservation et par souche. Il n'est en effet pas rare de constater que la souche congelée ou lyophilisée ne reparte pas en subculture, peut-être après transformation coccoïde. 3.13 Comment les revivifier ?

De la même façon, plusieurs milieux devront être ensemencés lors de la revivification : des géloses au sang non sélectives, des milieux liquides comme du bouillon Brucella ou du bouillon au thioglycolate et à la Résazurine (cf. 3.2 Milieux). Pour les souches manifestement contaminées, un passage sur une gélose sélective (gélose Skirrow) par isolement en stries ou mieux une filtration sélective (cf. 4.2.2.3 Isolement par filtration) permettent la plupart du temps de récupérer la souche pure. La filtration peut être réalisée sur filtre posé sur gélose au sang ou avec tout système de filtration avec une porosité de 0,45 um.

3.2
32.1 3.2.1.1

Milieux
Géloses Nature et composition des géloses

• Les géloses de subculture ou d'identification Les géloses de subculture ou d'identification sont représentées par des géloses au sang dépourvues d'antibiotiques, mis à part de l'amphotéricine B à la concentration

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de 2 mg/1, pour inhiber d'éventuelles moisissures ou levures venues contaminer la souche de Campylobacier, ce qui est assez fréquent à cause de l'emploi de sachets générateurs de gaz et d'une grande humidité des atmosphères de culture de Campylobacier. Le sang utilisé peut être du sang stérile de mouton ou de cheval. • Les géloses sélectives d'isolement Les milieux sélectifs solides sont des géloses dont la base (Columbia agar ou Brucella agar ou autre base gélosée) est additionnée de 5 à 15 % de sang stérile de mouton ou de cheval. Les géloses d'isolement sont additionnés d'antibiotiques, les plus classiques étant représentés par la vancomycine, le triméthoprime, la polymixine B ou l'amphotéricine B. On les combine parfois avec un procédé de filtration. Nous avons retenu plusieurs types principaux de géloses sélectives en fonction de la nature et de la concentration des substance antibiotiques utilisées. L'amphotéricine est facultative, sauf si l'échantillon correspond à de la volaille, riche en levures. Nous avons délibérément retenu un nombre important de géloses sélectives : en raison des difficultés de la mise en évidence de Campylobacier, on en utilise le plus souvent deux en parallèle. De plus, la plupart de ces géloses sont des géloses de référence et figurent dans les normes internationales de recherche de Campylobacier thermotolérants (Géloses de Karmali, Butzler modifiée, Skirrow, CCDA, Preston). Chaque gélose est adaptée à une situation donnée en fonction de son pouvoir sélectif ou des risques d'inhibition des Campylobacier. Enfin, sous chaque dénomination, la composition des géloses peut varier. Nous donnons ici les compositions les plus souvent rencontrées. Pour se procurer ces milieux, voir annexe n°l : Références des principaux milieux de culture et d'identification. Dans le cas général, l'enseignant choisira une ou deux géloses dans la série suivante (deux géloses si on recherche C.jejuni dans les aliments, cf. 4.2 Mise en évidence de C.jejuni à partir des aliments) : • La gélose Karmali C'est une gélose sélective dépourvue de sang. Elle mérite à ce titre d'être présentée à des étudiants car elle permet de rechercher Campylobacier à moindre frais et même si on ne dispose pas d'une source régulière de sang stérile frais. C'est aussi le premier milieu d'isolement sélectif figurant dans les normes internationales de recherche de Campylobacter thermotolérants dans les aliments. Milieu de base = Campylobacter agar base (Karmali) Charbon actif Eau 40 g 4g I I

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Solution d'hématine = Hématine Eau Solution d'antibiotiques supplémentée = Pyruvate de sodium Céfopérazone Vancomycine Cycloheximide

032 g 100 ml 100 mg 32 mg 20 mg 100 mg

980 ml de milieu de base seront ajoutés à 10 ml de solution d'hématine et 10 ml de solution d'antibiotiques supplémentée. • La gélose Butzler modifiée Gélose Columbia Sang de mouton Céfopérazone Rifampicine Colistine Amphotéricine B Q.S.P. 11 50 ml 15 mg 10 mg 10 000 LU. 2 mg

C'est une gélose réputée très sélective qui peut ainsi servir à isoler Campylobacter de prélèvements très contaminés par une microflore concurrente, tels que des matières fécales, la céfopérazone étant particulièrement active sur les bacilles Gram (Pseudomonas et Entérobactéries) et les coques Gram +. La colistine est active sur les bacilles Gram - . • La gélose Skirrow Basegélosée Sang stérile lysé de cheval (ou de mouton) Vancomycine Sulfate de Polymixine B Lactate de triméthoprime Q.S.P. 11 50 ml 10 mg 2 500 U.I. 5 mg

La polymixine B inhibe essentiellement les bacilles Gram - . Le triméthoprime a un spectre d'activité large : cocci Gram + ou - , bacilles Gram - . La vancomycine inhibe la plupart des germes Gram +. Il convient bien pour l'isolement des Campylobacter possédant une catalase à partir d'échantillons dont la microflore concurrente n'est pas trop active, par exemple pour purifier une souche de C.jejuni contaminée. Ces antibiotiques seront complétés par de l'amphotéricine B à la concentration de 2 mg/1 ou de l'actidione à la concentration de 100 mg/1, pour inhiber d'éventuelles moisissures ou levures. On fabrique parfois cette gélose avec du sang stérile lysé (ou laqué) de cheval obtenu par congélation/décongélation de ce sang.

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• La gélose Preston Elle est caractérisée par l'adjonction de rifampicine à spectre très large contre Gram + et Gram -, plus sélective que les antibiotiques de la gélose de Skirrow et agissant sur des souches résistantes de Staphylococcus, et par l'absence de céphalosporines ou de colistine qui sont parfois inhibitrices de certaines souches de Campylobacter. Base gélosée Sang stérile de cheval (ou de mouton) Triméthoprime PolymyxineB Rifampicine Cycloheximide Q.S.P. Il 50 ml 10 mg 5 000U.I. 10 mg 100 mg

Nous citerons pour mémoire la gélose CCDA et la gélose de Blaser plus adaptés à la recherche de C.jejuni dans les matières fécales humaines. 3.2.1.2 Fabrication et conservation des géloses

Les géloses pourront être préparées à l'avance par l'enseignant. Toutefois, la fabrication d'un certain nombre de géloses par l'étudiant lui permettra de mieux en retenir les composants essentiels. NB : La fabrication de ces milieux sélectifs par l'étudiant est souhaitable pour ses vertus pédagogiques. Mais il faudra faire attention à prévenir tout risque de contact ou d'ingestion des composants par le manipulateur, et notamment des substances sélectives. En effet, il s'agit d'antibiotiques dont certains, comme le cycloheximide ou actidione sont toxiques par inhalation, contact avec la peau et par ingestion. Dans le cas de la manipulation de ces substances sélectives, on procédera en portant des gants et plus particulièrement pour le cycloheximide, des lunettes et un système de protection du visage, voire derrière la glace d'une hotte de manipulation des produits toxiques à extraction d'air. Différents additifs peuvent être employés comme agents de croissance : pyruvate de sodium, métabisulfite de sodium, et sulfate ferreux (par exemple à 0,25 g/1 chacun) si l'on craint une absence de croissance. Ces géloses, et notamment les géloses au sang, devront être préparées extemporanément et utilisées le plus rapidement possible. L'utilisation de géloses trop anciennes peut rendre aléatoire la croissance de la bactérie. Ce sont bien des géloses au sang et non pas des géloses chocolat. Il ne faudra pas trop chauffer la gélose avant d'ajouter le sang, sauf pour une culture d'Helicohacter pylori qui préfère les géloses chocolat. De plus, pour un dénombrement de colonies, on asséchera les boîtes sous la hotte, de façon à obtenir ensuite de véritables colonies. En effet, sur des milieux humides, C.jejuni qui est flagellée, a tendance à donner des colonies étalées ressemblant à du vernis en (laques brillantes, parfois légèrement

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grises. On devra rechercher ce dernier aspect pour le montrer aux étudiants, car c'est un aspect des colonies très caractéristique de Campylobacter. Toutes les géloses au sang devront être conservées dans un délai maximal de 3 jours à + 4 °C. 322 3.2.2.1 Milieux liquides

Bouillons non sélectifs

On devra utiliser du bouillon Brucella ou du bouillon thioglycolate à la résazurine semi-gélosé, notre préférence allant à ce dernier, même si ce n'est pas un milieu académique. En effet, la croissance de la souche peut être suivie aisément par l'étudiant par l'observation de la croissance de la bactérie en surface et à quelques millimètres de la surface, de même que la croissance d'éventuels contaminants, apparaissant alors souvent sous formes de fusées ou de traînées, voire d'une opacification de tout le milieu. Il n'est alors pas besoin de réaliser une coloration de Gram pour connaître l'état de la souche, alors que cette coloration est obligatoire dans le cas du bouillon Brucella dans lequel le trouble n'est jamais très marqué. C'est aussi un milieu qui peut être sans difficulté placé directement en étuve, sans sachet générateur d'atmosphère microaérophile, en raison de son caractère réducteur. Mais il faudra utiliser un milieu frais ou régénéré à la vapeur, présentant une collerette violette de résazurine réduite. 3.2.2.2 Bouillons d'enrichissement

Enfin, des milieux d'enrichissement devront être utilisés pour la recherche de Campylobacter dans les aliments. Ils comprennent une base liquide (Bouillon Brucella) ou semi solide (Bouillon thioglycolate à la résazurine) et des antibiotiques. • Bouillon Preston C'est un milieu d'enrichissement à utiliser pour les aliments frais (cf. 4.2 Mise en évidence de C.jejuni à partir des aliments). Bouillon nutritif de base Q.S.P. 11 Sang stérile défibriné lysé de cheval 50 ml Triméthoprime lactate 10 mg Polymyxine B 5 000 LU. Rifampicine 10 mg Cycloheximide 100 mg • Bouillon Park et Sanders C'est un milieu à utiliser pour les échantillons d'aliments ayant reçu un traitement pouvant entraîner un stress des bactéries et une absence de croissance sur les milieux (laits en poudre, viandes chauffées...).

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Il est caractérisé par deux solutions d'antibiotiques A et B qui seront rajoutées successivement, la solution A immédiatement avant l'inoculum (5 ml), la solution B 4 heures après (50 ml) (cf. 4.2 Mise en évidence de C.jejuni à partir des aliments). Bouillon nutritif de base Sang stérile défibriné lysé de cheval Solution d'antibiotiques A = Triméthoprime lactate Vancomycine Eau Éthanol à 95 % (V/V) Solution d'antibiotiques B = Céfopérazone Cycloheximide Mélange eau/acétone 50/50 (V/V) Q.S.P. 1 1 50 ml 20 mg 20 mg 5 ml 5 ml 32 mg 100 mg 50 ml

33

Autre matériel de culture

En raison du caractère microaérophile de Campylobacter, l'utilisation de jarres pour anaérobies est indispensable pour sa culture. Des générateurs d'atmosphère devront impérativement être utilisés. On utilisera de préférence le mélange suivant : 5 % d'oxygène, 10 % de gaz carbonique et 85 % d'azote. Cette atmosphère est obtenue grâce au système générateur d'atmosphère microaérophile. Il se présente sous la forme de sachets métalliques contenant un générateur d'hydrogène type borohydrure de sodium et un générateur de CO,, comme le mélange bicarbonate de sodium - acide citrique. Après addition d'eau, ils sont placés dans la jarre en présence d'un catalyseur (grains de palladium par exemple ou sacs catalyseurs métalliques) lui-même convenablement régénéré par passage au four Poupinel au moins 10 min après plusieurs utilisations. Des filtres de 0,45 nm de porosité permettront d'effectuer l'isolement de C.jejuni par filtration sur gélose (cf. 4.2.2.3 Isolement par filtration). Des étuves seront nécessaires à 37 °C mais aussi à 42 °C et 25 °C, pour les tests de croissance. Eventuellement, des bains-marie à ces températures pourront remplacer les étuves.

3.4

Matériel d'identification

Le matériel permettant la réalisation de différents tests d'identification, en plus de disques d'oxydase, d'eau oxygénée (recherche de la catalase), d'un microscope avec objectif à immersion et de trois étuves réglées à 25 °C, 37° C et 42° C (cf. supra), de divers tubes à hémolyse, comprendra :

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3.4.1

Colorations

Il est nécessaire de disposer de l'ensemble des colorants classiques pour la coloration de Gram, bien que la forme très caractéristique de la bactérie permette de l'identifier quelqu'en soit la couleur (virgules, formes en S, formes coccoïdes). C.jejuni étant une bactérie flagellée, il est possible d'effectuer une technique de coloration des flagelles par exemple par la méthode de Ribadeau et Dumas. Comme ce n'est pas un test nécessaire à l'identification de C.jejuni, nous ne développerons pas cette méthode. 3.42 3.4.2.1 Tests biochimiques et de croissance Milieu solide

Il correspond au milieu dit TSI ou « Triple Sugar Iron », ou gélose au citrate de fer et aux trois sucres contenant en particulier des sels de fer permettant de mettre en évidence la production d'hydrogène sulfuré par certaines souches de Campylobacter. Ce milieu, après reconstitution est réparti en tubes sous la forme de géloses inclinées, de façon à prévoir un culot de 2,5 cm de profondeur, et une pente. Le noircissement du milieu ou son jaunissement signeront respectivement la production d'hydrogène sulfuré et la fermentation des glucides avec acidification du milieu. 3.4.2.2 Milieux semi-solides

Pour les tests de croissance, les milieux ont comme base le bouillon Brucella ou Brucella broth (Difco ND), réparti en tubes stériles de 15 ml. Pour obtenir la consistance « semi-gélosée », rajouter environ 0,1 % d'agar. 3.43 Sensibilité aux antibiotiques

Ces tests sont réalisés par la méthode des disques sur gélose au sang. La composition de ces disques est la suivante : -Acide nalidixique 30 ug ; - Céfalotine 30 ug. On réalisera une suspension laiteuse de la souche de C. jejuni qui sera versée sur une gélose au sang. La gélose au sang servant de milieu pour ce test sera préférentiellement composé d'une gélose Mueller-Hinton. 3.4.4 Recherche de l'hydrolyse de Vhippurate

Ce test correspond à la mise en évidence de l'hydrolyse de l'hippurate de sodium en glycine (et en acide benzoïque) par les souches de Campylobacter. La présence de glycine est révélée par l'addition de ninhydrine (coloration violette soutenue).

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Il est dérivé de celui qui est habituellement utilisé pour l'identification des souches de streptocoques. Il permet de mettre en évidence la présence d'une hippuricase. Le matériel nécessaire à ce test correspond à : • une solution d'hippurate de sodium à 10 % (dans un tampon PBS ou phosphate salin) = Hippurate de sodium 10 g Tampon PBS = NaCI 8,5 g Hydrogénophosphate disodique dihydraté 8,98 g Dihydrogénophosphate monosodique monohydraté 2,71 g Eau Q.S.P. 1 1 La solution d'hippurate sera stérilisée par filtration et répartie dans de petits tubes à hémolyse, conservés à - 20 °C. • une solution de ninhydrine composée de 3,5 g de ninhydrine dans 100 ml d'un mélange à parties égales de butanol et d'acétone. Toutefois, ce test, réalisé à l'origine en tubes, est souvent d'interprétation difficile pour Campylobacter. 11 est en effet difficile d'obtenir une culture abondante du germe et d'inoculer le germe dans la solution d'hippurate de sodium en quantité suffisante pour provoquer une réaction d'intensité convenable. C'est pourquoi nous décrivons ici une technique de mise en évidence de la glycine produite en chromatographie en couche mince. Le matériel nécessaire à ce test en chromatographie en couche mince correspond à une solution de migration pour chromatographie en couche mince comprenant de l'eau distillée, de l'acide acétique et du butanol à parties égales, des plaques de Silicagel (Schleicheret Schiill ND), un pulvérisateur pour la solution de ninhydrine. 3.4 .5 Utilisation d'une mini-galerie

On peut éventuellement faire manipuler une mini-galerie, et notamment lors de recherche de souches sauvages (cf. 4.3 Mise en évidence de souches sauvages de C. je/uni et Annexe 1 B pour les références).

4

Modes opératoires

Nous proposons ici trois manipulations différentes de complexité croissante. La plus simple est la manipulation de souches de laboratoire de C.jejuni, destinée à familiariser l'étudiant avec les difficultés de la culture et de l'identification de cette bactérie.

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La deuxième manipulation a pour but de rechercher C. jejuni dans des aliments artificiellement contaminés par des souches de laboratoire. La troisième manipulation correspond à la mise en situation et à la recherche de souches sauvages de C. jejuni. 4.1 4.1.1 Manipulation de souches de laboratoire de C. jejuni Programme de préparations des souches par l'enseignant

En raison de la longueur et du caractère aléatoire de la culture de C. jejuni, il est conseillé de suivre l'échéancier suivant, qui permet de se mettre (le plus souvent) à l'abri de surprises désagréables, et de disposer à temps de souches pour les manipulations : Si J est le jour du début des travaux pratiques : - J est préférentiellement un lundi, voire un mardi. - Les souches de laboratoire sont sorties de l'azote à J - 7 et repiquées immédiatement, mises en culture 48 h, repiquées à nouveau (J - 5), mises en culture 48 h, repiquées à nouveau (J - 3), et laissées deux ou trois jours, selon qu'il s'agit d'une fin de semaine ou pas. - Le jour J, on travaille préférentiellement sur les souches de J - 3, mais les plus anciennes conservées à + 4 °C telles quelles sur leur gélose ou dans leur bouillons d'enrichissement pourront être utilisées en cas de perte des souches de J - 3, et dans tous les cas, pour observer les formes coccoïdes en coloration de Gram. - Chaque souche ensemencée devant être en général incubée 48 heures, on prévoira une inoculation par les étudiants dès le jour J, une lecture des milieux à J + 2, J + 4, etc., et des manipulations sur les boîtes de J - 3 ou plus anciennes à J + 1, J + 3, etc. pendant l'incubation des milieux, par exemple en mettant en œuvre les techniques d'identification décrite plus loin (coloration de Gram...). 4.12 4.1.2.1 Repiquage des souches de laboratoire Repiquage en souche pure

Les souches de laboratoire seront inoculées par l'étudiant sur plusieurs milieux : deux géloses au sang qui seront inoculées en stries, un bouillon Brucella et un bouillon thioglycolate à la résazurine. Ces souches de laboratoire seront fournies d'une part sous forme de colonies, qui seront prélevées à la pipette « trompe de mouche » quand elles sont petites. Dans ce premier cas, l'enseignant aura préparé et inoculé 48 heures avant des géloses au sang humides et sèches, de façon à disposer des deux aspects des colonies de Campylobacter (petites colonies et étalements, cf. 5.1 Aspects des colonies de Campylobacter). Ces souches de laboratoire seront fournies sous forme de souche congelée ou lyophilisée, de façon à familiariser avec les difficultés de la subculture de souches conservées de C. jejuni.

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Après inoculation, les milieux seront placés dans une jarre avec un sachet générateur d'atmosphère microaérophile, sauf pour le bouillon thioglycolate à la résazurine. L'incubation est réalisée à 37 °C pendant 48 heures, mais on peut commencer à observer une croissance sur les milieux dès 24 heures, en particulier sur le bouillon thioglycolate à la résazurine, où on observera un début de trouble localisé à la partie superficielle du bouillon (qu'il ne faut bien entendu pas agiter). 4.1.2.2 Repiquage en échantillon multi-microbien

La pratique de l'isolement de C. jejuni au sein d'autres microorganismes sera proposée à l'étudiant en plaçant dans quelques millilitres de bouillon Brucella une souche de C. jejuni et les représentants de la flore concurrente habituellement rencontrée sur les géloses : E. coli ou une autre entérobactérie, et notamment Proteus en raison de son pouvoir envahissant des géloses, Pseudomonus fluorescens ou des levures pour la même raison. L'isolement sera alors réalisé sur gélose sélective (cf. 3.2.1.1 Nature et composition des géloses). 4.13 4.1.3.1 Identification des souches de laboratoire Lecture des boîtes et des bouillons

Après ouverture des jarres, les colonies de C. jejuni seront observées à la loupe en raison de leur petite taille et à jour frisant. Des colorations de Gram et des états frais sont réalisés (cf. 5.2 Aspects des Campylobacter au microscope). 4.1.3.2 Tests d'identification

Ces tests d'identification sont réunis ici : Test de l'oxydase : Recherche de la catalase Tests de croissance à 25 ° C (2 à 5 jours) Tests de croissance à 37° C Tests de croissance à 42° C Production d'H,S sur TSI (5 jours) Hydrolyse de l'hippurate Sensibilité aux antibiotiques (Acide nalidixique et céfalotine) Les tests d'identification sont réalisés comme suit :

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• Test de l'oxydase La présence de cette enzyme se manifeste par une coloration violette, après avoir déposé avec une pipette Pasteur boutonnée un fragment de colonie, sur un disque imprégné de tétraméthylparaphénylènediamine. _ Les Campylobacter sont « oxydase positive ». • Recherche de la catalase Disposer d'un flacon d'eau oxygénée à 5 %. Après introduction à l'aide d'une pipette Pasteur boutonnée, la présence de la catalase est révélée par un dégagement de gaz (= effervescence). Campylobacter jejuni/coli et Campylobacter fétus sont « catalase positive ». • Tests de croissance à 25 °C, 37 °C, 42 °C Les milieux (bouillon Brucella ou bouillon thioglycolate à la résazurine) sont placés en étuve aux températures ci-dessus, après inoculation. - Campylobacter jejuni/coli se développe à 37 °C et 42 °C, mais pas à 25 °C. - Campylobacter fétus se développe à 37 °C et 25 °C mais pas à 42 °C. Sur bouillon thioglycolate à la résazurine, le développement des bactéries à quelques millimètres en dessous de la surface du milieu, permet de confirmer la microaérophilie et d'éliminer les vibrions anaérobies facultatifs. • Production d'H2S sur TSI Le milieu TSI est ensemencé sur la pente et dans le culot. Le dégagement d'H2S est mis en évidence par la coloration noire du milieu : Campylobacter est en général H,S (-). Toutefois, un biotype particulier de C.jejuni {Campylobacter jejuni biotype 2) est H,S (+). De plus, Campylobacter coli est H2S (±) au terme de cinq jours d'incubation, (une légère coloration noirâtre apparaît en partie inférieure de la pente du milieu TSI dans le liquide accumulé. Ces deux derniers tests (croissance à différentes températures et production d'H,S sur milieu TSI) peuvent être réalisés simultanément : les souches de laboratoire sont alors ensemencées sur 3 milieux TSI. • Hydrolyse de l'hippurate Il faut récolter sur gélose des formes végétatives de Campylobacter en quantité suffisante, soit une gélose par tube d'hippurate. On prendra garde à ne pas prélever par la même occasion de gélose, dont les acides aminés feraient virer au violet foncé la ninhydrine et donneraient un test positif par excès. La glycine peut être révélée en tubes par addition de 5 gouttes de ninhydrine dans la suspension après incubation à 37 °C, 2 heures du tube d'hippurate ensemencé.