Etude de l'effet de l'interaction entre la nucléoporine 153 et la capside du virus de l'hépatite B

De
Publié par

Sous la direction de Michael Kann, Alfred Pingoud
Thèse soutenue le 18 décembre 2009: Université Justus-Liebig Giessen, Bordeaux 2
Environ 350 millions de personnes dans le monde sont infectées par le virus de l’hépatite B (VHB), dont un million meurent chaque année des conséquences d’une infection VHB chronique. Cette chronicité implique la capacité du VHB de moduler l’apoptose. Dans le cadre du projet présent, l’influence de la capside du VHB sur l’apoptose au niveau du clivage de la Nucléoporine153 (Nup153) par la caspase 3 et l’influence de la protéine core en général sur l’apoptose ont été analysées. Pour répondre à l’effet de la capside sur le clivage de la Nup153 par la caspase 3, des systèmes analytiques in vitro et in vivo ont pu être mis en place. Après avoir purifié la GST-Nup153, l’impact de la capside du VHB sur son clivage a été analysé. Il a été constaté que la capside du VHB n’avait pas d’influence sur le clivage de la Nup153. Ce résultat a été confirmé par le système in vivo qui consistait en des cellules HeLa perméabilisées par la digitonine dans lesquelles la Nup153 a été également clivée en présence ou absence de la capside du VHB. Pour accrocher la capside à la Nup153, des essais de transport ont été réalisés avant le clivage par la caspase 3 recombinante. Dans la deuxième partie, l’influence de la protéine core du VHB sur l’apoptose induite par le récepteur Fas a été étudiée. Des cellules HepG2 ont été transfectées soit avec un vecteur codant pour la construction GFP-core, soit avec le vecteur de contrôle codant pour la GFP sans fusion. Après induction de l’apoptose par le ligand IgFasL, l’apoptose a été mesurée soit par l’analyse de l’activité de la caspase 3, soit par réduction du signal GFP. Les cellules contenant la GFP-core démontraient un taux apoptotique fortement réduit, comparées aux cellules transfectées avec la GFP, indiquant une fonction anti-apoptotique de la protéine core du VHB.
-Nucléoporine 153
-Hépatite B
-Virologie
-Apoptose
-Lapside du virus de l'hépatite B
Around 350 million people worlwide are infected with the hepatitis B virus (HBV) and one million of people per year die because of the consequences of a chronic HBV-infection. The capacity of the HBV to become chronic suggests that this virus is capable to modulate the apoptosis. In the context of the present project, the influence of the HBV-capsid on the cleavage of the Nucleoporin153 (Nup153) by the caspase 3 and the influence of the HBV-core protein on the apoptosis in general have been investigated. In order to address the effect of the capsid on the cleavage of the Nup153 by the caspase 3, in vitro and an in vivo analytical systems have been developed. After the purification of the GST-Nup153, the impact of the HBV-capsid on his cleavage has been analyzed. It has been observed, that the HBV-capsid has no effect on the cleavage of the Nup153. This result has been confirmed by the in vivo system which has been represented by digitonin-permeabilized HeLa cells, in which the Nup153 has also been cleaved in presence or absence of the HBV-capsid. In order to attach the capsids on the Nup153, nuclear transport assays have been realized before the cleavage with the recombinant caspase 3. In the second part, the influence of the hepatitis core protein on the Fas induced apoptosis has been investigated. HepG2 cells have been transfected either with a vector coding for the construction GFP-core or with a control vector coding for the GFP-protein without any fusion. After induction of apoptosis by the ligand IgFasL, the apoptosis has been measured by the analysis of the caspase 3 activity and by the decreasing of the GFP signal. Cells containing GFP-core showed a strong decreasing regarding the amount of apoptosis compared to the cells transfected with GFP. This result suggests an anti-apoptotic function of the core protein of the HBV.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21687/document
Publié le : jeudi 27 octobre 2011
Lecture(s) : 95
Nombre de pages : 134
Voir plus Voir moins


UNIVERSITE DE BORDEAUX 2 ET UNIVERSITÉ DE GIEßEN

ECOLE DOCTORALE DE LA SCIENCE DE LA VIE BORDEAUX 2
NATURWISSENSCHAFTLICHES PRÜFUNGSAMT GIEßEN
IFR 66 : Pathologies Infectieuses et Cancer

Laboratoire de Microbiologie Cellulaire et Moléculaire et
Pathogénicité. UMR - CNRS 5234

Année : 2009 Thèse N° : 1687


Thèse en cotutelle
pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Bordeaux 2
et de l’Université de Gießen
Discipline / Spécialité : Biologie Cellulaire et
Biochimie
présentée par
Michael FOSS


Etude de l'effet de l'interaction entre la nucléoporine 153
et la capside du virus de l'hépatite B
Thèse co-dirigée par M. le Professeur M. KANN et M. le Professeur A. PINGOUD








JURY :

Rapporteurs
Camille SUREAU– Directeur de Recherche, CNRS, INTS, Paris
Hans WILL– Professeur, Heinrich-Pette Institut für experimentelle Virologie und
Immunologie der medizinischen Fakultät an der Universität Hamburg.

Examinateurs
M. KANN – Professeur, UMR - CNRS 5234, Bordeaux
A. PINGOUD – Professeur, Institut für Biochemie des Fachbereichs 08 der
Universität Gießen

ABREVIATIONS

ADN : acide désoxyribonucléique
ARN: acide ribonucléique
ATP : adenosine triphosphate
BAR: bifunctional apoptosis regulator
Bax: bcl-2 associated X protein
Bcl-2: B-cell leukaemia/lymphoma 2-like
BSA : Bovin Serum Albumin, albumine sérique bovine
CAD : caspase activated DNase
Cdk : kinases dépendantes des cyclines
Cyt c : cytochrome c
DAPI : 4’,6-DiAmidino-2-PhénylIndole
DD : death domain
DFF: facteur de fragmentation de l’ADN
DMSO : diméthylsulfoxide
DR : death receptors
DTT : dithiothréitol
EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétra Acétique
FADD: Fas-associated death domain
FasL: Fibroblast-associated Ligand
FITC : Fluoresceine IsoThioCyanate
kDa : kilo dalton
MEM : Minimum Essential Medium
PARP: Poly-(ADP-ribose) polymérase
PrC : Capside recombinante du VHB, phosphorylée in vitro
- 2 -
PBS : tampon phosphate salin
PMSF : phenylmethylsulfonyl fluoride
PVDF : polyvinylidène difluoride
rC : capside recombinante du VHB, non phosphorylée
RE: réticulum endoplasmique
SDS : dodécylsulfate de sodium
SVF : sérum de veau fœtal



























- 3 -























Pour mes parents Gerda et Manfred Foss. Sans vous, rien n’aurait été possible !
Merci pour votre amour et votre soutient !













- 4 -

Remerciements


J’aimerais bien remercier mon directeur de thèse Michael KANN pour tout son
engagement et pour sa nature positive et encourageante. Merci pour ces années de
thèse ! C’était un très grand plaisir et j’ai beaucoup appris !

Merci beaucoup aussi à mon co-directeur de thèse Alfred PINGOUD au côté
allemand de ma thèse en cotutelle. Chez vous j’ai fait mes « premiers » pas dans le
cadre de mon master 2, dont j’ai beaucoup profité ! Merci d’avoir accepter de
continuer le chemin dans le cadre de ce projet !

J’exprime ma profonde gratitude et mes plus vifs remerciements à Monsieur le
Professeur Camille SUREAU et à Monsieur le Professeur Hans WILL qui m’ont fait
l’honneur d’accepter d’être rapporteurs de ce travail.

Je tiens également à remercier Dominique BEGU, qui s’est engagé d’une façon
exceptionnelle pour moi ! Tu as fourni une partie des « outils » responsables pour les
résultats obtenus. Merci pour tout ce travail et ta gentillesse !

J’ai été accueilli par l’équipe de l’ancien REGER d’une façon très chaleureuse ! Merci
pour cette agréable atmosphère de travail et pour toute aide dans la vie quotidienne !

Merci à Sophie DABURON pour la collaboration et la production du ligand IgFasL

Last but not least: Merci beaucoup à ma partenaire….pour la correction de ma thèse
en français, de s’être occupée de tout pendant que j’étais plongé dans la rédaction
de ma thèse, mais encore plus important….tout simplement pour que tu sois comme
tu es !




- 5 -

Sommaire

1 Introduction_______________________________9
1.1 Les virus _______________________________________________________________ 9
1.2 Le virus de l’hépatite B__________________ 10
1.2.1 Classification________________________________ 11
1.2.2 Morphologie et structure_______________________ 11
1.2.3 Structure de la capside_________________________ 12
1.2.4 Organisation du génome ________________________________ 14
1.2.5 Le cycle de vie du VHB 16
1.3 Le pore nucléaire 18
1.4 Structure et fonctions de la nucléoporine 153 ________________________________ 21
1.5 L’import effectué par la superfamille caryophérine β _________________________ 22
1.6 L’ apoptose ____________________________________________________________ 23
1.6.1 Les voies intrinsèques et extrinsèques de l’apoptose_ 23
1.6.2 La caspase 3 25
1.6.3 L’apoptose comme outil de défense l’organisme contre les virus________________________ 26
1.7 Objectifs de l’Etude_____________________ 27
2 Matériel et méthodes ______________________30
2.1 Matériels ______________________________________________________________ 30
2.1.1 Tampons utilisés d’une façon fréquente ___________________________________________ 30
2.1.2 Appareils___ 32
2.1.3 Produits chimiques___________________________ 33
2.1.4 Kits_______ 36
2.1.5 Enzymes et standards_________________________ 36
2.1.6 Plasmides utilisés____________________________ 37
2.1.6.1 pGEX-2TK ________________________________ 37
2.1.6.2 pET-32a_______________________________ 38
2.1.6.3 pEGFP-C3 et pEGFP-core_________________ 39
2.2 Méthodes______________________________ 40
2.2.1 Travaux microbiologiques______________________ 40
2.2.1.1 Culture des bactéries_____________________ 40
2.2.1.2 Souches bactériennes________________________________ 41
2.2.1.3 Production des bactéries compétentes________ 41
2.2.1.4 Transformation par choc thermique__________ 42
2.2.1.5 Production des stocks glycérol______________ 43
2.2.2 Méthodes de biologie moléculaire________________ 43
2.2.2.1 Élektrophorèse__________________________ 43
2.2.2.1.1 Électrophorèse par gel d’agarose _________________________________________ 44
2.2.2.1.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) _________________________ 44
2.2.2.2 Western-blot ___________________________________________________________ 46
2.2.2.2.1 Transfert des protéines séparées par électrophorèse sur la membrane _____________ 46
2.2.2.2.2 Développement de la membrane par utilisation d’anticorps ____________________ 47
2.2.2.3 Isolation de de l’ADN plasmidique__________ 48
2.2.2.3.1 Quantification de la concentration d’ADN__ 49
2.2.2.3.2 Contrôle des plasmides par clivage par enzymes de restriction __________________ 49
2.2.2.4 Détermination de la concentration de protéine _________________________________ 50
2.2.3 L’étude de l’effet de la capside du VHB sur le clivage de la nup153 par la caspase 3 ________ 50
2.2.3.1 Expression et purification de la nup153_______ 50
2.2.3.1.1 Tests d’expressions et de solubilité________ 50
- 6 -
2.2.3.1.2 Expression de la GSTnup153 ____________________________________________ 52
2.2.3.1.3 Purification de la GST-nup153___________ 53
2.2.3.1.4 Test de stabilité de la GST-nup153________ 54
2.2.3.1.5 Purification par colonne hydrophobique____ 54
2.2.3.1.6 Test d’activité de la nup153 : Interaction avec l’importine β et la PrC_____________ 56
2.2.3.2 Phosphorylation de la capside recombinante du VHB____________________________ 59
2.2.3.2.1 Contrôle de la phosphorylation par la PKC _________________________________ 60
2.2.3.3 Test d’activité de la caspase 3 recombinante___ 63
2.2.3.4 Essais de clivages _______________________________________________________ 63
2.2.3.4.1 In vitro______________________________ 64
2.2.3.4.2 Semi in vitro_________________________ 64
2.2.4 Ètude de l’influence de la protéine core du VHB sur l’apoptose ________________________ 65
2.2.4.1 Culture des cellules eucaryotes_____________ 65
2.2.4.1.1 Congélation er décongélation des cellules eucaryotes 65
2.2.4.1.2 Culture des différentes lignées cellulaires___________________________________ 66
2.2.4.2 Tests de transfections des cellules HepG2_____ 67
2.2.4.3 Analyse des taux de transfections par FACS___ 67
2.2.4.4 Analyse par microscopie confocale de l’expression de la GFP/GFP-core_____________ 69
2.2.4.5 Analyse de l’activité de la caspase 3_________ 69
2.2.4.6 Analyse de la réduction du signal GFP/ GFP-core ______________________________ 70
3 Résultats ________________________________71
3.1 L’étude de l’effet de la capside du VHB sur le clivage de la nup153 par la caspase 3 71
3.1.1 Mise en place du système analytique _____________________________________________ 71
3.1.1.1 Purification de la GST-nup153 71
3.1.1.1.1 Test d’expression de la GST-nup153______ 72
3.1.1.1.2 Test d’expression de la nup153-His_______ 76
3.1.1.1.3 Tests de stabilité de la GST-nup153 77
3.1.1.1.4 Purification GST-nup153_______________ 79
3.1.1.1.5 Tests d’activité de la GSTnup 153 purifié : Interaction avec l’imp β ______________ 80
3.1.1.1.6 Essai d’amélioration du rendement de la purification de la GST-nup153 par colonne HIC
81
3.1.1.2 Phosphorylation in vitro des PrC____________________________________________ 83
3.1.1.2.1 Migration, RNA-Gehalt, Capsid-breathing_______ Fehler! Textmarke nicht definiert.
3.1.1.2.2 Test d’activité de la capside du VHB dans le contexte cellulaire ________________ 86
3.1.1.3 Contrôle de l’activité de la caspase 3 recombinante _____________________________ 88
3.1.2 Essais de clivages ____________________________________________________________ 89
3.1.2.1 In vitro________________________________ 89
3.1.2.2 Semi- in vitro___________________________ 90
3.2 Etude de l’effet de la protéine core du VHB sur l’apoptose induite par IgFasL ____ 92
3.2.1 Mise en place du système analytique_____________ 92
3.2.1.1 Tests de transfections_____________________ 92
3.2.1.1.1 lipofectamin™2000 ________________________ Fehler! Textmarke nicht definiert.
3.2.1.1.2 FugeneHD® HepG2 ___________________________________________________ 97
3.2.1.2 Localisation GFP-Core___________________ 99
3.2.2 Inhibition de l’activité de la caspase 3___________ 100
3.2.3 Inhibition de la diminution du signal GFP________ 101
4 Discussion______________________________103
4.1 Etude de l’effet de la capside du VHB sur le clivage de la nup153 par la caspase 3 103
4.1.1 L’expression optimisé de la nup153 sous conditions natives est la clé pour sa purification___ 103
4.1.2 Validation de la PrC comme modèle recombinant pour la capside immature______________ 109
4.1.3 Essais de clivages ___________________________________________________________ 110
4.2 Étude de l’effet de la protéine core sur l’apoptose induite par IgFasL___________ 112
4.2.1 Mise en place du système analytique ____________________________________________ 113
4.2.2 Inhibition de l’activité de la caspase 3 115
4.2.3 Inhibition de la diminution du signal GFP tant que marqueur apoptotique________________ 115
- 7 -
5 Conclusion et perspectives ________________117
6 Bibliographie____________________________119
7 Publications ____________________________134
- 8 - Introduction

1 Introduction
1.1 Les virus

Des virus sont des particules infectieuses d’une taille de 15 nm virus de circo à 800
nm mimi-virus qui se reproduisent à l’aide des cellules procaryotes et eucaryotes.
Selon le ICTV (International Commitee on Taxonomy of Viruses) les virus sont
classifiés selon leurs modes de réplication, leurs propriétés de génomes, leurs
formes, leurs tailles, ainsi que leurs symétries. Contrairement à ces cellules, des
virus ne possèdent pas de métabolisme et utilisent les voies de synthèse des
matériaux biologiques (lipides, acides nucléiques et protéines) des cellules infectées
pour produire les substances nécessaires à leurs amplifications. Ils sont en général
construits d’une capside qui contient leurs génomes et quelques protéines
accessoires variables par espèce de virus. Le génome peut être constitué par de
l’ARN ou de l’ADN. De plus, un virus peut être enveloppé par une membrane
lipidique qui peut avoir encastrée des différentes protéines. Chaque virus se
reproduit au cours d’un cycle viral, qui peut être divisé en trois parties. Dans la
première phase, un virus s’accroche à la membrane cellulaire à un premier
récepteur. Cette interaction est fixée par une deuxième espèce de récepteur. Les
interactions avec les récepteurs ont comme conséquence une induction de cascades
de signaux intracellulaires qui aboutissent à la pénétration du virus dans la cellule
[1,2]. Ce processus est dépendant de l’énergie et est réalisé soit par endocytose, soit
par fusion avec la membrane cellulaire. Des virus enveloppés fusionnent soit
directement avec la membrane cellulaire, soit avec la membrane endosomale. À la
fin de la première phase du cycle viral, le virus se retrouve dans le cytoplasme. La
prochaine phase consiste à l’infiltration du métabolisme cellulaire par le virus. Les
virus ARN répliquent dans le cytoplasme à l’exception des virus Borna, Influença et
des rétrovirus. L’amplification des virus ADN est située dans le noyau de la cellule
exception virus de variole. Ces virus utilisent les systèmes de transports
intracellulaires parce que des structures de > 50 nm diffusent très lentement dans le
cytoplasme. Le virus, Herpes simplex-1 (HSV-1), l’adénovirus et le virus de l’hépatite
B par exemple sont transportés en long des microtubules en direction du noyau de la
cellule [3-5]. Le seul virus qui n’est pas transporté en long des microtubules est le
- 9 - Introduction
virus Polyhedrosis (NPV), qui est transporté en direction du noyau cellulaire par la
polymérisation des filaments actines [6,7]. Une fois arrivé à la membrane nucléaire,
le virus ADN doit trouver un moyen d’introduire son génome dans le noyau de la
cellule. Dans la littérature, deux mécanismes d’introduction dans le noyau cellulaire
sont décrits : le premier mécanisme est appliqué par les rétrovirus à l’exception des
lentivirus. Ils restent jusqu’à la prochaine division cellulaire dans le cytoplasme de la
cellule infectée. Ensuite, ils sont enfermés au cours de la division cellulaire par la
reconstitution de la membrane nucléaire dans le caryoplasme. Cette stratégie est
donc dépendante des cellules qui se divisent. Le deuxième mécanisme concerne
des virus qui infectent des cellules qui ne se divisent pas. Ils sont transportés comme
des autres macromolécules à travers le pore nucléaire à l’aide des récepteurs
d’import. À cause de leurs tailles trop importantes, les capsides de ces virus doivent
par contre se dissocier dans le pore nucléaire à la fin de l’import nucléaire, pour que
le génome viral puisse être largué dans le noyau cellulaire. Une exception est le virus
de l’hépatite B, dont les caractéristiques et le cycle de vie sont décrits en détail
figurant ci-dessous. Après que les virus aient mis en place leurs génomes, ceux-ci
sont répliqués et transcrits. La troisième phase du cycle viral consiste à la sécrétion
du virus en dehors de la cellule.

1.2 Le virus de l’hépatite B

Le virus de l’hépatite B humain (VHB) est la cause de la maladie du foie qui est
nommée « hépatite ». Deux formes de cette maladie existent : la forme aigue avec
ictère se manifeste souvent après une infection avec une haute dose de virus. Le
déroulement aigu le plus grave est l’hépatite fulminante, qui se manifeste à 1% des
déroulements ictères et qui est mortelle dans 70 % des cas. La deuxième forme de la
maladie est l’hépatite chronique, qui se développe en fonction de l’âge et du statut
immunitaire chez 5 % des adultes et chez 90 % des nouveaux nés. Une infection
chronique peut entraîner une cirrhose et à un carcinome hépatique.
Dans le monde entier, on retrouve chez environ 2 milliards de personnes des traces
d’une infection de l’hépatite B soit présente, soit surmontée [8] et plus de 370 millions
de personnes sont infectées d’une façon chronique. Les régions les plus touchées
sont l’Asie du Sud-est et l’Afrique centrale. Dans certaines de ces régions, 10-20 %
des habitants sont infectés d’une façon chronique. Dans les pays industriels de
- 10 -

Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.

Diffusez cette publication

Vous aimerez aussi