Etude de l'effet de l'interaction entre la nucléoporine 153 et la capside du virus de l'hépatite B

Michael Foss

Description

Sous la direction de Michael Kann, Alfred Pingoud
Thèse soutenue le 18 décembre 2009: Université Justus-Liebig Giessen, Bordeaux 2
Environ 350 millions de personnes dans le monde sont infectées par le virus de l’hépatite B (VHB), dont un million meurent chaque année des conséquences d’une infection VHB chronique. Cette chronicité implique la capacité du VHB de moduler l’apoptose. Dans le cadre du projet présent, l’influence de la capside du VHB sur l’apoptose au niveau du clivage de la Nucléoporine153 (Nup153) par la caspase 3 et l’influence de la protéine core en général sur l’apoptose ont été analysées. Pour répondre à l’effet de la capside sur le clivage de la Nup153 par la caspase 3, des systèmes analytiques in vitro et in vivo ont pu être mis en place. Après avoir purifié la GST-Nup153, l’impact de la capside du VHB sur son clivage a été analysé. Il a été constaté que la capside du VHB n’avait pas d’influence sur le clivage de la Nup153. Ce résultat a été confirmé par le système in vivo qui consistait en des cellules HeLa perméabilisées par la digitonine dans lesquelles la Nup153 a été également clivée en présence ou absence de la capside du VHB. Pour accrocher la capside à la Nup153, des essais de transport ont été réalisés avant le clivage par la caspase 3 recombinante. Dans la deuxième partie, l’influence de la protéine core du VHB sur l’apoptose induite par le récepteur Fas a été étudiée. Des cellules HepG2 ont été transfectées soit avec un vecteur codant pour la construction GFP-core, soit avec le vecteur de contrôle codant pour la GFP sans fusion. Après induction de l’apoptose par le ligand IgFasL, l’apoptose a été mesurée soit par l’analyse de l’activité de la caspase 3, soit par réduction du signal GFP. Les cellules contenant la GFP-core démontraient un taux apoptotique fortement réduit, comparées aux cellules transfectées avec la GFP, indiquant une fonction anti-apoptotique de la protéine core du VHB.
-Nucléoporine 153
-Hépatite B
-Virologie
-Apoptose
-Lapside du virus de l'hépatite B
Around 350 million people worlwide are infected with the hepatitis B virus (HBV) and one million of people per year die because of the consequences of a chronic HBV-infection. The capacity of the HBV to become chronic suggests that this virus is capable to modulate the apoptosis. In the context of the present project, the influence of the HBV-capsid on the cleavage of the Nucleoporin153 (Nup153) by the caspase 3 and the influence of the HBV-core protein on the apoptosis in general have been investigated. In order to address the effect of the capsid on the cleavage of the Nup153 by the caspase 3, in vitro and an in vivo analytical systems have been developed. After the purification of the GST-Nup153, the impact of the HBV-capsid on his cleavage has been analyzed. It has been observed, that the HBV-capsid has no effect on the cleavage of the Nup153. This result has been confirmed by the in vivo system which has been represented by digitonin-permeabilized HeLa cells, in which the Nup153 has also been cleaved in presence or absence of the HBV-capsid. In order to attach the capsids on the Nup153, nuclear transport assays have been realized before the cleavage with the recombinant caspase 3. In the second part, the influence of the hepatitis core protein on the Fas induced apoptosis has been investigated. HepG2 cells have been transfected either with a vector coding for the construction GFP-core or with a control vector coding for the GFP-protein without any fusion. After induction of apoptosis by the ligand IgFasL, the apoptosis has been measured by the analysis of the caspase 3 activity and by the decreasing of the GFP signal. Cells containing GFP-core showed a strong decreasing regarding the amount of apoptosis compared to the cells transfected with GFP. This result suggests an anti-apoptotic function of the core protein of the HBV.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21687/document

Sujets

• Hépatite B
• Virologie
• Apoptose

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 76
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 1 Mo

Extrait

UNIVERSITE DE BORDEAUX 2 ET UNIVERSITÉ DE GIEßEN

ECOLE DOCTORALE DE LA SCIENCE DE LA VIE BORDEAUX 2
NATURWISSENSCHAFTLICHES PRÜFUNGSAMT GIEßEN
IFR 66 : Pathologies Infectieuses et Cancer

Laboratoire de Microbiologie Cellulaire et Moléculaire et
Pathogénicité. UMR - CNRS 5234

Année : 2009 Thèse N° : 1687


Thèse en cotutelle
pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Bordeaux 2
et de l’Université de Gießen
Discipline / Spécialité : Biologie Cellulaire et
Biochimie
présentée par
Michael FOSS


Etude de l'effet de l'interaction entre la nucléoporine 153
et la capside du virus de l'hépatite B
Thèse co-dirigée par M. le Professeur M. KANN et M. le Professeur A. PINGOUD








JURY :

Rapporteurs
Camille SUREAU– Directeur de Recherche, CNRS, INTS, Paris
Hans WILL– Professeur, Heinrich-Pette Institut für experimentelle Virologie und
Immunologie der medizinischen Fakultät an der Universität Hamburg.

Examinateurs
M. KANN – Professeur, UMR - CNRS 5234, Bordeaux
A. PINGOUD – Professeur, Institut für Biochemie des Fachbereichs 08 der
Universität Gießen

ABREVIATIONS

ADN : acide désoxyribonucléique
ARN: acide ribonucléique
ATP : adenosine triphosphate
BAR: bifunctional apoptosis regulator
Bax: bcl-2 associated X protein
Bcl-2: B-cell leukaemia/lymphoma 2-like
BSA : Bovin Serum Albumin, albumine sérique bovine
CAD : caspase activated DNase
Cdk : kinases dépendantes des cyclines
Cyt c : cytochrome c
DAPI : 4’,6-DiAmidino-2-PhénylIndole
DD : death domain
DFF: facteur de fragmentation de l’ADN
DMSO : diméthylsulfoxide
DR : death receptors
DTT : dithiothréitol
EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétra Acétique
FADD: Fas-associated death domain
FasL: Fibroblast-associated Ligand
FITC : Fluoresceine IsoThioCyanate
kDa : kilo dalton
MEM : Minimum Essential Medium
PARP: Poly-(ADP-ribose) polymérase
PrC : Capside recombinante du VHB, phosphorylée in vitro
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PBS : tampon phosphate salin
PMSF : phenylmethylsulfonyl fluoride
PVDF : polyvinylidène difluoride
rC : capside recombinante du VHB, non phosphorylée
RE: réticulum endoplasmique
SDS : dodécylsulfate de sodium
SVF : sérum de veau fœtal



























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Pour mes parents Gerda et Manfred Foss. Sans vous, rien n’aurait été possible !
Merci pour votre amour et votre soutient !













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Remerciements


J’aimerais bien remercier mon directeur de thèse Michael KANN pour tout son
engagement et pour sa nature positive et encourageante. Merci pour ces années de
thèse ! C’était un très grand plaisir et j’ai beaucoup appris !

Merci beaucoup aussi à mon co-directeur de thèse Alfred PINGOUD au côté
allemand de ma thèse en cotutelle. Chez vous j’ai fait mes « premiers » pas dans le
cadre de mon master 2, dont j’ai beaucoup profité ! Merci d’avoir accepter de
continuer le chemin dans le cadre de ce projet !

J’exprime ma profonde gratitude et mes plus vifs remerciements à Monsieur le
Professeur Camille SUREAU et à Monsieur le Professeur Hans WILL qui m’ont fait
l’honneur d’accepter d’être rapporteurs de ce travail.

Je tiens également à remercier Dominique BEGU, qui s’est engagé d’une façon
exceptionnelle pour moi ! Tu as fourni une partie des « outils » responsables pour les
résultats obtenus. Merci pour tout ce travail et ta gentillesse !

J’ai été accueilli par l’équipe de l’ancien REGER d’une façon très chaleureuse ! Merci
pour cette agréable atmosphère de travail et pour toute aide dans la vie quotidienne !

Merci à Sophie DABURON pour la collaboration et la production du ligand IgFasL

Last but not least: Merci beaucoup à ma partenaire….pour la correction de ma thèse
en français, de s’être occupée de tout pendant que j’étais plongé dans la rédaction
de ma thèse, mais encore plus important….tout simplement pour que tu sois comme
tu es !




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Sommaire

1 Introduction_______________________________9
1.1 Les virus _______________________________________________________________ 9
1.2 Le virus de l’hépatite B__________________ 10
1.2.1 Classification________________________________ 11
1.2.2 Morphologie et structure_______________________ 11
1.2.3 Structure de la capside_________________________ 12
1.2.4 Organisation du génome ________________________________ 14
1.2.5 Le cycle de vie du VHB 16
1.3 Le pore nucléaire 18
1.4 Structure et fonctions de la nucléoporine 153 ________________________________ 21
1.5 L’import effectué par la superfamille caryophérine β _________________________ 22
1.6 L’ apoptose ____________________________________________________________ 23
1.6.1 Les voies intrinsèques et extrinsèques de l’apoptose_ 23
1.6.2 La caspase 3 25
1.6.3 L’apoptose comme outil de défense l’organisme contre les virus________________________ 26
1.7 Objectifs de l’Etude_____________________ 27
2 Matériel et méthodes ______________________30
2.1 Matériels ______________________________________________________________ 30
2.1.1 Tampons utilisés d’une façon fréquente ___________________________________________ 30
2.1.2 Appareils___ 32
2.1.3 Produits chimiques___________________________ 33
2.1.4 Kits_______ 36
2.1.5 Enzymes et standards_________________________ 36
2.1.6 Plasmides utilisés____________________________ 37
2.1.6.1 pGEX-2TK ________________________________ 37
2.1.6.2 pET-32a_______________________________ 38
2.1.6.3 pEGFP-C3 et pEGFP-core_________________ 39
2.2 Méthodes______________________________ 40
2.2.1 Travaux microbiologiques______________________ 40
2.2.1.1 Culture des bactéries_____________________ 40
2.2.1.2 Souches bactériennes________________________________ 41
2.2.1.3 Production des bactéries compétentes________ 41
2.2.1.4 Transformation par choc thermique__________ 42
2.2.1.5 Production des stocks glycérol______________ 43
2.2.2 Méthodes de biologie moléculaire________________ 43
2.2.2.1 Élektrophorèse__________________________ 43
2.2.2.1.1 Électrophorèse par gel d’agarose _________________________________________ 44
2.2.2.1.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) _________________________ 44
2.2.2.2 Western-blot ___________________________________________________________ 46
2.2.2.2.1 Transfert des protéines séparées par électrophorèse sur la membrane _____________ 46
2.2.2.2.2 Développement de la membrane par utilisation d’anticorps ____________________ 47
2.2.2.3 Isolation de de l’ADN plasmidique__________ 48
2.2.2.3.1 Quantification de la concentration d’ADN__ 49
2.2.2.3.2 Contrôle des plasmides par clivage par enzymes de restriction __________________ 49
2.2.2.4 Détermination de la concentration de protéine _________________________________ 50
2.2.3 L’étude de l’effet de la capside du VHB sur le clivage de la nup153 par la caspase 3 ________ 50
2.2.3.1 Expression et purification de la nup153_______ 50
2.2.3.1.1 Tests d’expressions et de solubilité________ 50
- 6 -
2.2.3.1.2 Expression de la GSTnup153 ____________________________________________ 52
2.2.3.1.3 Purification de la GST-nup153___________ 53
2.2.3.1.4 Test de stabilité de la GST-nup153________ 54
2.2.3.1.5 Purification par colonne hydrophobique____ 54
2.2.3.1.6 Test d’activité de la nup153 : Interaction avec l’importine β et la PrC_____________ 56
2.2.3.2 Phosphorylation de la capside recombinante du VHB____________________________ 59
2.2.3.2.1 Contrôle de la phosphorylation par la PKC _________________________________ 60
2.2.3.3 Test d’activité de la caspase 3 recombinante___ 63
2.2.3.4 Essais de clivages _______________________________________________________ 63
2.2.3.4.1 In vitro______________________________ 64
2.2.3.4.2 Semi in vitro_________________________ 64
2.2.4 Ètude de l’influence de la protéine core du VHB sur l’apoptose ________________________ 65
2.2.4.1 Culture des cellules eucaryotes_____________ 65
2.2.4.1.1 Congélation er d