Interactions de la région C-terminale de MLH1 nécessaires à la voie de réparation des mésappariements de l'ADN, Structure-function analysis of the interactions mediated by MLH1 C-terminal region and essential for DNA mismatch repair

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Sous la direction de Jean-Baptiste Charbonnier
Thèse soutenue le 18 mars 2011: Paris 11
La protéine Mlh1 eucaryote est un acteur central de la voie de réparation des mésappariements (MMR). Chez la levure, Mlh1 forme un hétérodimère via sa région C-terminale avec les endonucléases Pms1 et Mlh3. La région C-terminale de Mlh1 est également en interactions avec l’exonucléase Exo1 du MMR et deux protéines Ntg2 et Sgs1 qui sont impliquées dans d’autres voies de réparation. Dans un premier temps, nous avons identifié et caractérisé le site d’interaction de Mlh1 avec les protéines Exo1, Ntg2 et Sgs1, qui utilisent un même motif de 5 acides aminés, (R/K)SK(Y/F)F appelé motif MIP pour Mlh1 Interacting Protein. Nous avons montré que ces 3 protéines interagissent en un même site, appelé site S2. Nous avons identifié 10 positions de Mlh1 impliquées dans le site S2 et caractérisé par microcalorimétrie, une affinité micromolaire entre des peptides contenant le motif MIP et la région C-terminale de Mlh1. Nous avons montré que les protéines EXO1 et BLM humaines qui possèdent également un motif MIP, interagissent spécifiquement avec MLH1 humain par ce motif. Dans un second temps, nous avons résolu la structure cristallographique à 2.6Å de la région C-terminale de l’hétérodimère Mlh1*Pms1. Le site d’hétérodimèrisation présente une surface d’interaction supérieure à celle observée dans les homodimères de MutL bactériens. La structure résolue confirme le rôle des 10 acides aminés de Mlh1 identifiés lors de la caractérisation du site S2. La structure du site endonucléase de Pms1 révèle la présence de deux atomes de zinc chelatés par 5 acides aminés de Pms1 et le dernier acide aminé de la protéine Mlh1, la cystéine C769. Cette première structure d’une région C-terminale d’un complexe Mlh1*Pms1 eucaryote permet d’analyser la position des nombreux mutants ponctuels de MLH1 humain associés à des cancers du côlon HNPCC.
-Mmr
-Recombinaison méiotique
Eucaryotic Mlh1 is a core component of mismatch repair pathway (MMR). In yeast organisms, Mlh1 forms heterodimer with its C-terminal region with endonucleases Pms1 and Mlh3. The C-terminal region of Mlh1 is also involved in interactions with MMR exonuclease Exo1 and two proteins, Ntg2 and Sgs1, which are involved in other DNA repair pathways. First, we identified and charaterised the interaction site between Mlh1 and proteins Exo1, Ntg2, and Sgs1, that share the same motif of 5 amino acids, (R/K)SK(Y/F)F, named MIP box for Mlh1 Interacting Protein. We showed that these 3 proteins bind to the same site, named site S2. 10 positions of Mlh1 important for interactions on site S2 were identified and a micromolar affinity was measured by calorimetry between the C-terminal region of Mlh1 and peptides containing a MIP box. We showed that human EXO1 and BLM specifically with human MLH1 through their MIP box. Secondly, we solved the X-ray structure of the C-terminal region of Mlh1*Pms1 heterodimer at 2.6Å. The structure shows that the surface buried upon heterodimerisation is higher in eucaryotes than in MutL homodimers. The structure confirms the overall structure of the site S2 predicted in the first part of this study. The endonuclease site of Pms1 presents in the crystal two zinc atoms that are bound by five Pms1 residues and the last residue of Mlh1 chain, cystein C769. This structure represents the first image of the C-terminal region of an eucaryote Mlh1*Pms1 heterodimer. It allows localizing the positions of human MLH1 mutants associated with colon cancers named HNPCC.
-Mismatch repair
-Mmr
-Crystallography
-Itc
-Colorectal cancer
-Meiotic recombination
Source: http://www.theses.fr/2011PA114804/document
Publié le : samedi 29 octobre 2011
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UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11


FACULTÉ DE PHARMACIE DE CHÂTENAY-MALABRY

ECOLE DOCTORALE :
INNOVATION THÉRAPEUTIQUE : DU FONDAMENTAL A L’APPLIQUÉ
PÔLE : INGENIERIE DES PROTEINES ET CIBLES THERAPEUTIQUES


ANNÉE 2010 - 2011 SÉRIE DOCTORAT N°


THÈSE

Présentée

À L’UNITÉ DE FORMATION ET DE RECHERCHE
FACULTE DE PHARMACIE DE CHATENAY-MALABRY
UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11

pour l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11

par

Emeric GUENEAU

Titre de la thèse :

INTERACTIONS DE LA REGION C-TERMINALE DE
MLH1 NECESSAIRES A LA VOIE DE REPARATION
DES MESAPPARIEMENTS DE L'ADN


Soutenuele18mars2011


JURY: Prof.HermanVANTILBEURGH Président
Dr.IvanMATIC Rapporteur
Dr.MarcDELARUE Rapporteur
Dr.Sophie QUEVILLON/CHERUEL Examinateur
M.EtienneROULEAU Examinateur
Dr.Jean/BaptisteCHARBONNIER Directeurdethèse

tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011

- 2 -
tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011Avant-propos

Cettethèse,financéeparleMinistèredel’EnseignementSupérieuretdelaRecherche
etlaFondationpourlaRechercheMédicale,s’estdérouléeauLaboratoiredeBiologie
Structurale et Radiobiologie au sein de l'iBiTec/S du CEA/Saclay. Je remercie
BernardGILQUIN,directeurdulaboratoire,pourm’avoiraccueilliaucoursdeces
troisannéesetdemie.

LadirectiondecetravailaétéassuréeparJean/BaptisteCHARBONNIER,quim’a
encadréetconseilléauquotidien.Sadisponibilité,sondynamismeetsabienveillance
m’ont permis de surmonter les difficultés rencontrées au cours de cette thèse. Par
ailleurs,parsarigueuretsonespritcritique,ilasuapporteràcetravaillerecul
nécessaire.Pourtoutcela,jeluisuistrèsreconnaissant.

JetiensàremercierHermanVANTILBEURGHpouravoiracceptédeprésiderle
jurydemasoutenancedethèse.J’exprimemagratitudeàMarcDELARUE etIvan
MATIC qui ont accepté de juger ce travail en tant que rapporteurs, ainsi qu’à
Sophie QUEVILLON/CHERUEL et Etienne ROULEAU qui ont accepté de faire
partiedujury.Jelesremercietouspourletempsqu’ilsontconsacréàlalectureetà
lacritiquedecemanuscrit.

Parailleurs,cettethèseestloind’êtrelerésultatd’untravailisolé,jesouhaiterais
doncremerciertouteslespersonnesayantcontribuéàsonaboutissement.
Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Floriana LONDINO et Pierre
BONNESOEURquim'ontépaulétoutaulongdemathèse.Sanseux,unegrande
partie des résultats n'aurait pas vu le jour. Je remercie également le programme
"PlasticitéetInstabilitéduGénome"duCEAquilesafinancés.
Je remercie également Marcela NUNEZ et Carine TELLIER/LEBEGUE pour leur
participationaudémarrageduprojet.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Marie/Hélène LE DU pour son aide en
cristallographie ainsi que Sophie ZINN/JUSTIN pour sa contribution dans la
modélisation.

Je suis également très reconnaissant envers les personnes avec lesquelles j’ai eu le
plaisirdecollaborer.
JeremercieSergeBOITEUXetClaudineDHERINpourleurimmensecontribution
au projet, aussi bien pour les expériences de génétiques que pour leurs nombreux
conseilsetidées.
tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011
JeremerciePierreLEGRANDetAndyTHOMPSONpourm’avoiraccueilliplusieurs
moissurlaligneProxima1etpouravoirpassédenombreusesheuresàm’aiderdans
l’étudestructurale.
Je remercie Simona MIRON pour son aide précieuse et ses conseils avisés en
calorimétrieetendichroïsmecirculaire.
Enfin,jeremercieJosanA.MARQUEZetsonéquipepourlesnombreuxessaisde
cristallisationréaliséssurleurplateformeetpourlaqualitédeleurcollaboration.

Je ne saurai oublier dans ces quelques lignes toutes les personnes du laboratoire,
permanentsetdoctorants,quiontrenducestroisannéesagréables.Millemercisà
tous.

Cela va de soi, je remercie ma famille pour son irremplaçable et inconditionnel
soutien.
Enfin,sijen’avaisqu’unepersonneàremercier,ceseraitcellequipartagemavieet
quialargementcontribuéàl’aboutissementdecetravail.Alorsmillemercis,Caroline,
pourm’avoirsoutenuetsupportédanslesmomentsdifficiles,pourtapatienceettes
nombreusesattentions.


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Nomenclature
Sommaire
NOMENCLATURE 8
INTRODUCTION GENERALE 11
1. REVUE DE LITTERATURE 14
1.1 LES PROTEINES MUTL DANS LA REPARATION DES MESAPPARIEMENTS 14
1.1.1 LAVOIEDEREPARATIONDESMESAPPARIEMENTS 14
1.1.2 MUTLETSESHOMOLOGUES 46
1.2 CONTEXTE DU PROJET: ETUDE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE LA REGION C-
TERMINALE DES HOMOLOGUES EUCARYOTES DE MUTL 55
1.2.1 ETUDESTRUCTURALEETFONCTIONNELLEDELAFAMILLEMUTL 55
1.2.2 ETUDESTRUCTURALEETFONCTIONNELLEDELAFAMILLEPMS2:ACTIVITEENDONUCLEASE
DUDOMAINEC/TERMINAL 57
1.2.3 ETUDESTRUCTURALEETFONCTIONNELLEDELAFAMILLEMLH1 61
1.3 OBJECTIFS DU PROJET: CARACTERISATION BIOPHYSIQUE ET STRUCTURALE DE LA
REGION C-TERMINALE DE MUTL 63
1.3.1 CARACTERISERLESSITESD'INTERACTIONSDUDOMAINEC/TERMINALDEMUTL 63
ERE1.3.2 RESOLUTIONDELA1 STRUCTUREEUCARYOTEDUDOMAINEC/TERMINALDEMUTL 64
2. MATERIEL ET METHODES 67
2.1 EXPRESSION ET PURIFICATION DES PROTEINES 67
2.1.1 CONSTRUCTIONDESDOMAINES 67
2.1.2 EXPRESSIONETPURIFICATIONDESREGIONSC/TERMINALESDESCMLH1,HSMLH1ET
SCMLH1*SCPMS1 67
2.2 CARACTERISATION BIOPHYSIQUE DES PROTEINES PURIFIEES 72
2.2.1 CARACTERISATIONDUREPLIEMENTPARDICHROÏSMECIRCULAIRE 72
2.2.2 CARACTERISATIONDELAPOLYDISPERSITEPARDIFFUSIONDYNAMIQUEDELALUMIERE 75
2.2.3 CARACTERISATIONDESINTERACTIONSPARCALORIMETRIEATITRAGEISOTHERME 76
2.3 ETUDE DES STRUCTURES TRIDIMENSIONNELLES 79
2.3.1 MODELISATIONPARHOMOLOGIEDUDOMAINEC/TERMINALDUCOMPLEXEMLH1*PMS1 79
2.3.2 MODELISATIONDUPEPTIDEMIPDEEXO1SURLASURFACEDELAREGIONC/TERMINALEDE
MLH1 80
2.3.3 LACRISTALLOGRAPHIEAUXRAYONSXDESPROTEINES 82
3. ANALYSE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DU DOMAINE
C-TERMINAL DE MUTL 97
3.1 IDENTIFICATION ET CARACTERISATION D'UN NOUVEAU SITE D'INTERACTION DE
MLH1 97
- 5 -
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Nomenclature
3.1.1 IDENTIFICATIONDUSITED'INTERACTIONDESPROTEINESCONTENANTUNMOTIFMIPPAR
MUTAGENESEDIRIGEEETMODELISATIONPARHOMOLOGIE 97
3.1.2 PURIFICATIONETCARACTERISATIONBIOPHYSIQUEDELAREGIONC/TERMINALEDEMLH1 103
3.1.3 CARACTERISATIONPARCALORIMETRIEDESINTERACTIONSDEPEPTIDESCONTENANTUN
MOTIFMIPAVECLAREGIONC/TERMINALEDEMLH1 107
3.2 ANALYSE STRUCTURALE DU DOMAINE C-TERMINAL DE MUTL 118
3.2.1 ETUDESTRUCTURALEDUDOMAINEC/TERMINALDEMLH1 118
3.2.2 RESOLUTIONDELASTRUCTURECRISTALLOGRAPHIQUEDELEREGIONC/TERMINALEDU
COMPLEXEMLH1*PMS1DES. CEREVISIAE 124
3.2.3 ANALYSEDELASTRUCTURECRISTALLOGRAPHIQUEDUDOMAINEC/TERMINALDEMUTL DE
S. CEREVISIAE 152
4. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 177
ANNEXE 207
ANNEXE 1: PREPARATION DE BACTERIES CHIMIOCOMPETENTES (INOUE ET AL., 1990) 207
ANNEXE 2: COMPOSITION DU MILIEU DE CULTURE POUR LA PRODUCTION DE PROTEINE
MARQUEE AU SELENIUM 210
ANNEXE 3: PROTOCOLE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DES DOMAINES 485-769 ET
503-769 DE SCMLH1 211
ANNEXE 4: PROTOCOLE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DU DOMAINE 486-756 DE
HSMLH1 215
ANNEXE 5: SPECTRE DE DICHROISME CIRCULAIRE ET DENATURATION THERMIQUE DU
VARIANT E682A DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH1 219
ANNEXE 6: THERMOGRAMME ET ISOTHERME DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH1 ET DE
PEPTIDES DERIVES DU MOTIF MIP 220
ANNEXE 7: CARACTERISATION PAR BSI DES INTERACTIONS DE PEPTIDES CONTENANT UN
MOTIF MIP AVEC LA REGION C-TERMINALE DE MLH1 224
ANNEXE 8: CONDITIONS DE CRISTALLOGENESE DU CRIBLE DU DOMAINE C-TERMINAL DE
MLH1 (485-769) 225
ANNEXE 9: CONDITIONS DE CRISTALLOGENESE DU CRIBLE DU DOMAINE C-TERMINAL DE
MLH1 (503-769) 226
ANNEXE 10: PROTOCOLE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DES DOMAINES 485-769 DE
SCMLH1*635-873 DE SCPMS1 228
ANNEXE 11: CONDITIONS DE CRISTALLOGENESE DU CRIBLE DU DOMAINE C-TERMINAL DE
MLH1*PMS1 232
ANNEXE 12: SCRIPTS DE REMPLACEMENT MOLECULAIRE 233
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ANNEXE 13: COMPARAISON DES STUCTURES SECONDAIERS PREDITES ET REELLES DES CTD
DE MLH1 ET PMS1 237
ANNEXE 14: ANALYSE DE L’INTERFACE DE DIMERISATION PAR LE SERVEUR PROTORP ;
RESIDUS DE MLH1 A LA SURFACE DE DIMERISATION 238
ANNEXE 15: ANALYSE DE L’INTERFACE DE DIMERISATION PAR LE SERVEUR PROTORP ;
RESIDUS DE PMS1 A LA SURFACE DE DIMERISATION 239
ANNEXE 16: ALIGNEMENTS DE 10 SEQUENCES DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH1 A L’AIDE
DU PROGRAMME KALIGN 240
ANNEXE 17: ALIGNEMENTS DE 10 SEQUENCES DU DOMAINE C-TERMINAL DE PMS1 ET 2
SEQUENCES DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH3 A L’AIDE DU PROGRAMME KALIGN 242

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g
g
b
b
g
g
Nomenclature
Nomenclature

ADP AdénosineDi/Phosphate
ADPnP ou AMPPNP Adenosine5'/[ , /imido]triphosphate
AID ActivationInducedcytidineDeaminase
ATP AdénosineTri/Phosphate
ATP S Adenosine5'/O/thiotriphosphate
ATR AtaxiaTelangiectasiaandRad3/relatedprotein
BER BaseExcisionRepair
CD CircularDichroïsm
CHARMM ChemistryatHARvardMolecularMechanics
Co-IP Co/ImmunoPrécipitation
CSR ClassSwitchRecombination
CTD CTerminalDomain
DLS DynamicLightScattering
DMSO DiMéthylSulfOxyde
DO600nm DensitéOptiqueà600nm
EDTA AcideEthylèneDiamineTétraacétique
ERISCAM EstimationdesRISquesdeCAncerchezlesporteursde
mutationdesgènesMMR
FANCJ FanconianemiacomplementationgroupJ
GST GlutathioneS/Transferase
HEPES Acide4/(2/hydroxyéthyl/)/1/pipérazineéthanesulfonqui e
HereditaryNonPolyposisColorectalCancerHNPCC
HTX HighThroughputCrystallisation
IDCL Interdomainconnectingloop
IDL Insertionetdélétion
IPTG Isopropyl /D/1/thiogalactopyranoside
ITC IsothermalTitrationCalorimetry
InSiGHT InternationalSocietyforGastrointestinalHereditary
Tumours
LB LysogenyBroth
Ligation/MediatedPolymeraseChainReactionLM-PCR
MBP Maltose/BindingProtein
MIP Mlh1InteractingProtein
MLH MutLHomologprotein
MMR MisMatchRepair
MNNG N/methyl/N'/nitro/N/nitrosoguanidine
MSH MutShomologprotein
MSI MicrosatelliteInstability
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MUSCLE MUltipleSequenceComparisonbyLog/Expectation
NER NucleotideExcisionRepair
NHEJ NonHomologousEndJoining
NTD Nterminaldomain
PhosphateBufferedSalinePBS
ProliferatingCellNuclearAntigenPCNA
PEG PolyEthylèneGlycol
PIP PCNAInteractingProteinbox
PMS PostMeoiticSegregationincreasedprotein
PMSF FluoruredePhénylMéthaneSulfonyle
Ppi Eaupourpréparationsinjectables
PSI-BLAST PositionSpécificitératedBLAST
PositionSpécificitératedPREDictionPSI-PRED
PWWP MotifPro/Trp/Trp/Pro
RFC ReplicationFactorC
RPA ReplicationProteinA
SAXS Small/AngleX/rayScattering
SHM SomaticHypermutation
SSB Single/strandbindingprotein
TobaccoEtchVirusproteaseTEV
AcideTriFluoroAcétiqueTFA
Tris Trishydroxyméthylaminométhane
UNG UracilN/Glycosylase
UV Unclassidiedvariants
XDS X/rayDetectorSoftware
3R Réplication,RecombinaisonetRéparation

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