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UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11


FACULTÉ DE PHARMACIE DE CHÂTENAY-MALABRY

ECOLE DOCTORALE :
INNOVATION THÉRAPEUTIQUE : DU FONDAMENTAL A L’APPLIQUÉ
PÔLE : INGENIERIE DES PROTEINES ET CIBLES THERAPEUTIQUES


ANNÉE 2010 - 2011 SÉRIE DOCTORAT N°


THÈSE

Présentée

À L’UNITÉ DE FORMATION ET DE RECHERCHE
FACULTE DE PHARMACIE DE CHATENAY-MALABRY
UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11

pour l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11

par

Emeric GUENEAU

Titre de la thèse :

INTERACTIONS DE LA REGION C-TERMINALE DE
MLH1 NECESSAIRES A LA VOIE DE REPARATION
DES MESAPPARIEMENTS DE L'ADN


Soutenuele18mars2011


JURY: Prof.HermanVANTILBEURGH Président
Dr.IvanMATIC Rapporteur
Dr.MarcDELARUE Rapporteur
Dr.Sophie QUEVILLON/CHERUEL Examinateur
M.EtienneROULEAU Examinateur
Dr.Jean/BaptisteCHARBONNIER Directeurdethèse

tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011

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tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011Avant-propos

Cettethèse,financéeparleMinistèredel’EnseignementSupérieuretdelaRecherche
etlaFondationpourlaRechercheMédicale,s’estdérouléeauLaboratoiredeBiologie
Structurale et Radiobiologie au sein de l'iBiTec/S du CEA/Saclay. Je remercie
BernardGILQUIN,directeurdulaboratoire,pourm’avoiraccueilliaucoursdeces
troisannéesetdemie.

LadirectiondecetravailaétéassuréeparJean/BaptisteCHARBONNIER,quim’a
encadréetconseilléauquotidien.Sadisponibilité,sondynamismeetsabienveillance
m’ont permis de surmonter les difficultés rencontrées au cours de cette thèse. Par
ailleurs,parsarigueuretsonespritcritique,ilasuapporteràcetravaillerecul
nécessaire.Pourtoutcela,jeluisuistrèsreconnaissant.

JetiensàremercierHermanVANTILBEURGHpouravoiracceptédeprésiderle
jurydemasoutenancedethèse.J’exprimemagratitudeàMarcDELARUE etIvan
MATIC qui ont accepté de juger ce travail en tant que rapporteurs, ainsi qu’à
Sophie QUEVILLON/CHERUEL et Etienne ROULEAU qui ont accepté de faire
partiedujury.Jelesremercietouspourletempsqu’ilsontconsacréàlalectureetà
lacritiquedecemanuscrit.

Parailleurs,cettethèseestloind’êtrelerésultatd’untravailisolé,jesouhaiterais
doncremerciertouteslespersonnesayantcontribuéàsonaboutissement.
Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Floriana LONDINO et Pierre
BONNESOEURquim'ontépaulétoutaulongdemathèse.Sanseux,unegrande
partie des résultats n'aurait pas vu le jour. Je remercie également le programme
"PlasticitéetInstabilitéduGénome"duCEAquilesafinancés.
Je remercie également Marcela NUNEZ et Carine TELLIER/LEBEGUE pour leur
participationaudémarrageduprojet.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Marie/Hélène LE DU pour son aide en
cristallographie ainsi que Sophie ZINN/JUSTIN pour sa contribution dans la
modélisation.

Je suis également très reconnaissant envers les personnes avec lesquelles j’ai eu le
plaisirdecollaborer.
JeremercieSergeBOITEUXetClaudineDHERINpourleurimmensecontribution
au projet, aussi bien pour les expériences de génétiques que pour leurs nombreux
conseilsetidées.
tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011
JeremerciePierreLEGRANDetAndyTHOMPSONpourm’avoiraccueilliplusieurs
moissurlaligneProxima1etpouravoirpassédenombreusesheuresàm’aiderdans
l’étudestructurale.
Je remercie Simona MIRON pour son aide précieuse et ses conseils avisés en
calorimétrieetendichroïsmecirculaire.
Enfin,jeremercieJosanA.MARQUEZetsonéquipepourlesnombreuxessaisde
cristallisationréaliséssurleurplateformeetpourlaqualitédeleurcollaboration.

Je ne saurai oublier dans ces quelques lignes toutes les personnes du laboratoire,
permanentsetdoctorants,quiontrenducestroisannéesagréables.Millemercisà
tous.

Cela va de soi, je remercie ma famille pour son irremplaçable et inconditionnel
soutien.
Enfin,sijen’avaisqu’unepersonneàremercier,ceseraitcellequipartagemavieet
quialargementcontribuéàl’aboutissementdecetravail.Alorsmillemercis,Caroline,
pourm’avoirsoutenuetsupportédanslesmomentsdifficiles,pourtapatienceettes
nombreusesattentions.


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Nomenclature
Sommaire
NOMENCLATURE 8
INTRODUCTION GENERALE 11
1. REVUE DE LITTERATURE 14
1.1 LES PROTEINES MUTL DANS LA REPARATION DES MESAPPARIEMENTS 14
1.1.1 LAVOIEDEREPARATIONDESMESAPPARIEMENTS 14
1.1.2 MUTLETSESHOMOLOGUES 46
1.2 CONTEXTE DU PROJET: ETUDE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE LA REGION C-
TERMINALE DES HOMOLOGUES EUCARYOTES DE MUTL 55
1.2.1 ETUDESTRUCTURALEETFONCTIONNELLEDELAFAMILLEMUTL 55
1.2.2 ETUDESTRUCTURALEETFONCTIONNELLEDELAFAMILLEPMS2:ACTIVITEENDONUCLEASE
DUDOMAINEC/TERMINAL 57
1.2.3 ETUDESTRUCTURALEETFONCTIONNELLEDELAFAMILLEMLH1 61
1.3 OBJECTIFS DU PROJET: CARACTERISATION BIOPHYSIQUE ET STRUCTURALE DE LA
REGION C-TERMINALE DE MUTL 63
1.3.1 CARACTERISERLESSITESD'INTERACTIONSDUDOMAINEC/TERMINALDEMUTL 63
ERE1.3.2 RESOLUTIONDELA1 STRUCTUREEUCARYOTEDUDOMAINEC/TERMINALDEMUTL 64
2. MATERIEL ET METHODES 67
2.1 EXPRESSION ET PURIFICATION DES PROTEINES 67
2.1.1 CONSTRUCTIONDESDOMAINES 67
2.1.2 EXPRESSIONETPURIFICATIONDESREGIONSC/TERMINALESDESCMLH1,HSMLH1ET
SCMLH1*SCPMS1 67
2.2 CARACTERISATION BIOPHYSIQUE DES PROTEINES PURIFIEES 72
2.2.1 CARACTERISATIONDUREPLIEMENTPARDICHROÏSMECIRCULAIRE 72
2.2.2 CARACTERISATIONDELAPOLYDISPERSITEPARDIFFUSIONDYNAMIQUEDELALUMIERE 75
2.2.3 CARACTERISATIONDESINTERACTIONSPARCALORIMETRIEATITRAGEISOTHERME 76
2.3 ETUDE DES STRUCTURES TRIDIMENSIONNELLES 79
2.3.1 MODELISATIONPARHOMOLOGIEDUDOMAINEC/TERMINALDUCOMPLEXEMLH1*PMS1 79
2.3.2 MODELISATIONDUPEPTIDEMIPDEEXO1SURLASURFACEDELAREGIONC/TERMINALEDE
MLH1 80
2.3.3 LACRISTALLOGRAPHIEAUXRAYONSXDESPROTEINES 82
3. ANALYSE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DU DOMAINE
C-TERMINAL DE MUTL 97
3.1 IDENTIFICATION ET CARACTERISATION D'UN NOUVEAU SITE D'INTERACTION DE
MLH1 97
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Nomenclature
3.1.1 IDENTIFICATIONDUSITED'INTERACTIONDESPROTEINESCONTENANTUNMOTIFMIPPAR
MUTAGENESEDIRIGEEETMODELISATIONPARHOMOLOGIE 97
3.1.2 PURIFICATIONETCARACTERISATIONBIOPHYSIQUEDELAREGIONC/TERMINALEDEMLH1 103
3.1.3 CARACTERISATIONPARCALORIMETRIEDESINTERACTIONSDEPEPTIDESCONTENANTUN
MOTIFMIPAVECLAREGIONC/TERMINALEDEMLH1 107
3.2 ANALYSE STRUCTURALE DU DOMAINE C-TERMINAL DE MUTL 118
3.2.1 ETUDESTRUCTURALEDUDOMAINEC/TERMINALDEMLH1 118
3.2.2 RESOLUTIONDELASTRUCTURECRISTALLOGRAPHIQUEDELEREGIONC/TERMINALEDU
COMPLEXEMLH1*PMS1DES. CEREVISIAE 124
3.2.3 ANALYSEDELASTRUCTURECRISTALLOGRAPHIQUEDUDOMAINEC/TERMINALDEMUTL DE
S. CEREVISIAE 152
4. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 177
ANNEXE 207
ANNEXE 1: PREPARATION DE BACTERIES CHIMIOCOMPETENTES (INOUE ET AL., 1990) 207
ANNEXE 2: COMPOSITION DU MILIEU DE CULTURE POUR LA PRODUCTION DE PROTEINE
MARQUEE AU SELENIUM 210
ANNEXE 3: PROTOCOLE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DES DOMAINES 485-769 ET
503-769 DE SCMLH1 211
ANNEXE 4: PROTOCOLE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DU DOMAINE 486-756 DE
HSMLH1 215
ANNEXE 5: SPECTRE DE DICHROISME CIRCULAIRE ET DENATURATION THERMIQUE DU
VARIANT E682A DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH1 219
ANNEXE 6: THERMOGRAMME ET ISOTHERME DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH1 ET DE
PEPTIDES DERIVES DU MOTIF MIP 220
ANNEXE 7: CARACTERISATION PAR BSI DES INTERACTIONS DE PEPTIDES CONTENANT UN
MOTIF MIP AVEC LA REGION C-TERMINALE DE MLH1 224
ANNEXE 8: CONDITIONS DE CRISTALLOGENESE DU CRIBLE DU DOMAINE C-TERMINAL DE
MLH1 (485-769) 225
ANNEXE 9: CONDITIONS DE CRISTALLOGENESE DU CRIBLE DU DOMAINE C-TERMINAL DE
MLH1 (503-769) 226
ANNEXE 10: PROTOCOLE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DES DOMAINES 485-769 DE
SCMLH1*635-873 DE SCPMS1 228
ANNEXE 11: CONDITIONS DE CRISTALLOGENESE DU CRIBLE DU DOMAINE C-TERMINAL DE
MLH1*PMS1 232
ANNEXE 12: SCRIPTS DE REMPLACEMENT MOLECULAIRE 233
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tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011 Nomenclature
ANNEXE 13: COMPARAISON DES STUCTURES SECONDAIERS PREDITES ET REELLES DES CTD
DE MLH1 ET PMS1 237
ANNEXE 14: ANALYSE DE L’INTERFACE DE DIMERISATION PAR LE SERVEUR PROTORP ;
RESIDUS DE MLH1 A LA SURFACE DE DIMERISATION 238
ANNEXE 15: ANALYSE DE L’INTERFACE DE DIMERISATION PAR LE SERVEUR PROTORP ;
RESIDUS DE PMS1 A LA SURFACE DE DIMERISATION 239
ANNEXE 16: ALIGNEMENTS DE 10 SEQUENCES DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH1 A L’AIDE
DU PROGRAMME KALIGN 240
ANNEXE 17: ALIGNEMENTS DE 10 SEQUENCES DU DOMAINE C-TERMINAL DE PMS1 ET 2
SEQUENCES DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH3 A L’AIDE DU PROGRAMME KALIGN 242

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g
g
b
b
g
g
Nomenclature
Nomenclature

ADP AdénosineDi/Phosphate
ADPnP ou AMPPNP Adenosine5'/[ , /imido]triphosphate
AID ActivationInducedcytidineDeaminase
ATP AdénosineTri/Phosphate
ATP S Adenosine5'/O/thiotriphosphate
ATR AtaxiaTelangiectasiaandRad3/relatedprotein
BER BaseExcisionRepair
CD CircularDichroïsm
CHARMM ChemistryatHARvardMolecularMechanics
Co-IP Co/ImmunoPrécipitation
CSR ClassSwitchRecombination
CTD CTerminalDomain
DLS DynamicLightScattering
DMSO DiMéthylSulfOxyde
DO600nm DensitéOptiqueà600nm
EDTA AcideEthylèneDiamineTétraacétique
ERISCAM EstimationdesRISquesdeCAncerchezlesporteursde
mutationdesgènesMMR
FANCJ FanconianemiacomplementationgroupJ
GST GlutathioneS/Transferase
HEPES Acide4/(2/hydroxyéthyl/)/1/pipérazineéthanesulfonqui e
HereditaryNonPolyposisColorectalCancerHNPCC
HTX HighThroughputCrystallisation
IDCL Interdomainconnectingloop
IDL Insertionetdélétion
IPTG Isopropyl /D/1/thiogalactopyranoside
ITC IsothermalTitrationCalorimetry
InSiGHT InternationalSocietyforGastrointestinalHereditary
Tumours
LB LysogenyBroth
Ligation/MediatedPolymeraseChainReactionLM-PCR
MBP Maltose/BindingProtein
MIP Mlh1InteractingProtein
MLH MutLHomologprotein
MMR MisMatchRepair
MNNG N/methyl/N'/nitro/N/nitrosoguanidine
MSH MutShomologprotein
MSI MicrosatelliteInstability
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MUSCLE MUltipleSequenceComparisonbyLog/Expectation
NER NucleotideExcisionRepair
NHEJ NonHomologousEndJoining
NTD Nterminaldomain
PhosphateBufferedSalinePBS
ProliferatingCellNuclearAntigenPCNA
PEG PolyEthylèneGlycol
PIP PCNAInteractingProteinbox
PMS PostMeoiticSegregationincreasedprotein
PMSF FluoruredePhénylMéthaneSulfonyle
Ppi Eaupourpréparationsinjectables
PSI-BLAST PositionSpécificitératedBLAST
PositionSpécificitératedPREDictionPSI-PRED
PWWP MotifPro/Trp/Trp/Pro
RFC ReplicationFactorC
RPA ReplicationProteinA
SAXS Small/AngleX/rayScattering
SHM SomaticHypermutation
SSB Single/strandbindingprotein
TobaccoEtchVirusproteaseTEV
AcideTriFluoroAcétiqueTFA
Tris Trishydroxyméthylaminométhane
UNG UracilN/Glycosylase
UV Unclassidiedvariants
XDS X/rayDetectorSoftware
3R Réplication,RecombinaisonetRéparation

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