Anaerobic benzene degradation by iron- and sulfate-reducing enrichment cultures [Elektronische Ressource] / Nidal Mohammed Fahmi Hassan Abu Laban

Nidal.Abu

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 41
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

Anaerobic benzene degradation by iron-
and sulfate-reducing enrichment
cultures

Nidal Mohammed Fahmi Hassan Abu Laban

Dissertation


Technische Universität München

Lehrstuhl für Grundwasserökologie



Anaerobic benzene degradation by iron- and sulfate-
reducing enrichment cultures



Nidal Mohammed Fahmi Hassan Abu Laban




Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan
für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur
Erlangung des akademischen Grades eines


Doktors der Naturwissenschaften


genehmigten Dissertation.


Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. S. Scherer
Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. R. Meckenstock
2. Univ.-Prof. Dr. W. Liebl

Die Dissertation wurde am 26.10.2009 bei der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 19.01.2010 angenommen.

















Dedication

To the memory of my mother, to my wife



















II


Anaerober Abbau von Benzol durch Eisen- und Sulfat-reduzierende
Anreicherungskulturen

Nidal Abu Laban

Zusammenfassung

Trotz seiner hohen chemischen Stabilität kann Benzol unter anaeroben Bedingungen unter
Verwendung verschiedener Elektronenakzeptoren biologisch abgebaut werden.
Allerdings ist unser Wissen über die initiale Aktivierungsreaktion und (über) die für den
Abbau verantwortlichen Prokaryoten bisher sehr begrenzt. In der vorliegenden Studie wurden
Bakterienkulturen angereichert, die unter sulfat-reduzierenden Bedingungen Benzol zu
Kohlenstoffdioxid oxidieren.
Die bakterielle Gemeinschaft wurde anhand von T-RFLP, 16S rRNA-Gensequenzen und
Fluoreszenz in situ Hybridisierung analysiert. Der dominierende Phylotyp (95 %) gehört zu
der Gram-positiven Bakteriengattung Pelotomaculum, womit gezeigt werden konnte, dass
Gram-positive, sulfat-reduzierende Bakterien am anaeroben Benzolabbau beteiligt sind.
Um erste Einblicke in den anfänglichen Aktivierungsmechanismus zu bekommen, wurde an
einer sulfat-reduzierenden Kultur die Substratspezifität getestet. Fernerhin wurden Co-
Metabolimus-Tests durchgeführt und nach möglichen Metaboliten gesucht.
Phenol, Toluol und Benzoat konnten von der Benzol-abbauenden Kultur nicht als alternative
Kohlenstoffquellen verwendet werden. In der Anwesenheit von Phenol kam es bei
Abbauexperimenten von Co-Metaboliten-Abbauexperimenten zu verlangsamten Benzol-
Abbauraten, während Toluol keinen Einfluss auf den Benzol-Metabolismus zeigte. Phenol, 2-
Hydroxybenzoat, 4-Hydroxybenzoat und Benzoate konnten als Metaboliten in der
Anreicherungskultur identifiziert werden. Die abiotische Entstehung von hydroxylierten
Aromaten konnte nachgewiesen werden. Daher unterstützt der Fund von Benzoat als
Intermediat die Theorie der direkten Carboxylierung von Benzol als anfänglichen
Aktivierungsmechanismus. Allerdings können weitere Benzoat-bildende Reaktionen nicht
vollständig ausgeschlossen werden.
Zur Aufklärung des anaeroben Benzolabbaus wurde eine Metagenomanalyse der auf
Benzol als Kohlenstoffquelle gewachsenen Eisen-reduzierenden Kultur BF durchgeführt,
welche hauptsächlich aus Peptococcaceae-zugehörigen Bakterien besteht. Über 205 offene
Leserahmen (ORF) zeigten starke Sequenzhomologien zu Genen, die für
Transkriptionsregulatoren und Enzyme des anaeroben Abbaus aromatischer
Kohlenwasserstoffe codieren.
Interessanterweise wurden in verschiedenen Regionen des Genoms Gencluster identifiziert,
die für entsprechende Enzyme des Toluol- (bssCABD und bbsCABEFD), Phenol- (ppsA und
ppsBCAD), 4-Hydoxybenzoat- (pcmRST) und Benzoat-Abbaus (bamB-I) codieren, was auf
eine große metabolische Vielseitigkeit gegenüber aromatischen Verbindungen hinweist.
Des Weiteren wurden Gene entdeckt, die für ein Phenylphosphat Carboxylase-ähnliches
Protein (PpcD und PpcA) sowie für Benzoat-CoA Ligase (BamY) und 3-Oktaprenyl-4-
Hydroxybenzoat Carboxy-Lyase (UbiX) codieren und die in einer Operon-artigen Struktur
liegen (~17 Kb). Dabei zeigten die für die Phenylphosphat Carboxylase codierenden Gene
aber keine Homologien zu den zuvor beschriebenen ppc-Genen aus dem Phenol-Abbau-
Cluster und wurden im späteren Verlauf der Arbeit als putative Benzol-Abbau-Gene
charakterisiert.
III


In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal das Proteom anaerob Benzol-abbauender Kulturen
charakterisiert, wodurch die an der initialen Aktivierung von Benzol beteiligten Enzyme
identifiziert werden konnten. Das gesamte Proteom der auf Benzol, Phenol und Benzoat
gewachsenen Zellen der Eisen-reduzierenden Kultur BF wurde auf unterschiedlich
exprimierte Proteine analysiert. Anschließend wurde das Proteom mit der Genomsequenz
verglichen, um Gene zu identifizieren, die am anaeroben Benzol-Abbau beteiligt sind.
Zusätzlich wurde die N-terminale Sequenz eines 60 kDa großen Proteins identifiziert, welches
ausschließlich in Anwesenheit von Benzol exprimiert wurde. Der dadurch identifizierte ORF
138 der Kultur BF zeigte eine hohe Ähnlichkeit zu dem für die Phenylphosphat Carboxylase
codierenden Gen (ppcA) aus Aromatoleum aromatica Stamm EbN1. Darüber hinaus wurden
auch die angrenzenden ORFs 137 und 139 in der auf Benzol gewachsenen Kultur identifiziert,
die für eine Phenylphosphat Carboxylase (ppcD) und eine Benzoat-CoA Ligase (bamY)
codieren. Die hohe Ähnlichkeit der von ORF 137 und ORF 138 codierten Proteine zu
Carboxylasen unterstützt die Schlussfolgerung aus zuvor durchgeführten Metabolitanalysen
der initialen Carboxylierung von Benzol zu Benzoat. Im Anschluss findet der weitere Abbau
von Benzoat über die von ORF 139 codierte Benzoat-CoA Ligase statt. Auf Grund ihrer
Funktion wurden die von ORF 137 und ORF 138 codierten Proteine Anaerobe Benzol
Carboxylase (Abc) genannt, die von den Genen abcD und abcA codiert wird.
Interessanterweise konnten die Proteine AbcD und AbcA auch in der Benzol-gewachsenen,
Sulfat-reduzierenden Kultur BPL nachgewiesen werden.
Nachdem durch die Proteomanalyse Enzyme identifiziert werden konnten, die
wahrscheinlich die initiale Carboxylierung katalysieren, wurde im abschließenden Teil dieser
Arbeit eine zweidimensionale Kohlenstoff- und Wasserstoffisotopenanalyse der Benzol-
abbauenden Kulturen BF und BPL durchgeführt, um zu untersuchen, ob die initiale Reaktion
in den verschiedenen Kulturen ähnlich ist. Die Steigungen Λ der Dual-Plots (17 ± 1 und 20 ±
2) aus dem Kohlenstoff-Wasserstoff-Isotopenverhältnis sind statistisch in dem gleichen
Bereich, was auf einen gemeinsamen Abbaumechanismus der beiden Kulturen schließen lässt.
Auf Grund der Ergebnisse der physiologischen, Metabolom- und Proteomanalyse und der
Doppel-Isotopenanalyse der Benzol-abbauenden Kulturen BF und BPL konnte
schlussfolgernd in dieser Arbeit die direkte Carboxylierung von Benzol als gemeinsamer
Mechanismus des anaeroben Abbaus in Eisen- und Sulfat-reduzierenden Kulturen gezeigt
werden.
IV


Anaerobic benzene degradation by iron- and sulfate-reducing
enrichment cultures

Nidal Abu Laban

Abstract

Despite its high chemical stability, benzene is known to be biodegradable with various
electron acceptors under anaerobic conditions. However, our understanding of the initial
activation reaction and the responsible prokaryotes is limited. In the present study, we
enriched a bacterial culture that oxidizes benzene to carbon dioxide under sulfate-reducing
conditions. Community analysis using T-RFLP, 16S rRNA gene sequencing and fluorescence
in situ hybridization revealed 95% dominance of one phylotype that is affiliated to the Gram-
positive bacterial genus Pelotomaculum showing that sulfate-reducing Gram-positive bacteria
are involved in anaerobic benzene degradation.
In order to get indications of the initial activation mechanism, we tested the substrate
utilization, performed co-metabolism tests and screened for putative metabolites in a sulfate-
reducing culture. Phenol, toluene, and benzoate could not be utilized as alternative carbon
sources by the benzene-degrading culture. Co-metabolic degradation experiments resulted in
retarded rates of benzene degradation in the presence of phenol whereas toluene had no effect
on benzene metabolism. Phenol, 2-hydroxybenzoate, 4-hydroxybenzoate and benzoate were
identified as metabolites in the enrichment culture. However, hydroxylated aromatics were
shown to be formed abiotically. Thus, the finding of be