Analysis of infection relevant protein domains of the adeno-associated virus serotype 8 in comparison to serotype 2 [Elektronische Ressource] / Christina Raupp, geb. Stegelmann

Bq_Craupp

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: ruprecht-karls-universitat_heidelberg
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 30
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 8 Mo

Extrait

INAUGURAL‐DISSERTATION 
 
zur 
Erlangung der Doktorwϋrde 
der 
Naturwissenschaftlich‐Mathematischen Gesamtfakultät 
der Ruprecht‐Karls‐Universität 
Heidelberg 
 
 
 
 
 
 
 
vorgelegt von 
 
Christina Raupp geb. Stegelmann, MSc Biomedical Sciences 
 
aus Jülich, Nordrhein‐Westfalen 
 
 
 
 
 
 
 
Tag der mϋndlichen Prϋfung 
 
18.06.2010 
 
 
 
  
 
 
 
Analysis of Infection Relevant Protein Domains of the 
Adeno‐Associated Virus Serotype 8 in Comparison to  2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gutachter: 
 
apl. Prof. Dr. Jϋrgen Kleinschmidt 
Prof. Dr. Lutz Gissmann 
 
 
 
 
 
















The experimental work described in this thesis was started December 2005 and finished 
September 2009. C. Raupp was chosen to be a PhD student of the International PhD Program 
July  2005.  The  study  was  supervised  by  apl.  Prof.  Dr.  Jürgen  A.  Kleinschmidt  in  the 
Department Infection and Cancer of the German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg. 
 
  
 
 
 
Parts of the presented study have been published: 
 
 
Characterization of a Recombinant Adeno‐Associated Virus Type 2 Reference Standard 
Material,  Martin  Lock,  Susan  McGorray,  Alberto  Auricchio,  Eduard  Ayuso,  E.  Jeffrey 
Beecham,Véronique Blouin‐Tavel, Maria Fátima Bosch‐Tubert, Mahuya Bose, Barry Byrne, 
TinaCaton, Jay Chiorini, Abdelwahed Chtarto, K. Reed Clark , Thomas Conlon, Christophe 
Darmon, Monica Doria, Anne Douar, Terry Flotte, Joyce, D. Francis, Mauro Giacca, Michael T. 
Korn, Irina Korytov, Xavier Leon, Barbara Leuchs, Gabrielle Kroener‐Lux, Catherine Melas, 
Hiroaki Mizukami, Philippe Moullier, Marcus Müller, Keiya Ozawa, Tina Philipsberg, Karine 
Poulard, Christina Raupp, Christel Rivière, Sigrid D. Roosendaal, R. Jude Samulski, Steven M. 
Soltys, Richard Surosky, Liliane Tenenbaum, Darby L. Thomas, Bart van Montfort, Gabor 
Veres,  J.  Fraser  Wright,  Yili  Xu,  Olga  Zelenaia,  Lorena  Zentilin  and  Richard  O  Snyder 
(submitted) 
  
Stegelmann C., Poster Presentation, Analysis of infection relevant protein domains of AAV8 
ndin comparison to AAV2, Retreat in Weil der Stadt, 2008, 2  Poster Price. 
  
Stegelmann C., Mueller O., Kleinschmidt J. A. , ANALYSIS OF INFECTION RELEVANT PROTEIN 
DOMAINS OF ADENO‐ASSOCIATED VIRUS SEROTYPE 8 IN COMPARISON TO SEROTYPE 2, XII 
Parvovirus Workshop                                   
Index‐ 
Index 


Zusammenfassung  I 
Summary  II 
Abbreviations  III 
1. Introduction  1 
1.1 Biology of Adeno‐Associated Viruses  1 
1.1.2 Virus Classification  1 
1.1.3 AAV2 Genome  3 
1.1.4 AAV2 Proteins  6 
1.1.4.1 Non‐structural Proteins  6 
1.1.4.2. Structural Proteins  7 
1.1.5 AAV2 Capsid Structure 9 
1.1.6 AAV2 Capsid Assembly and Genome Encapsidation  10 
1.1.7 AAV Life Cycle  11 
1.1.8 AAV Infection  12 
1.2 AAV as a Gene Therapy Vector  15 
1.2.1 Immune Response to AAV  16 
1.2.2 AAV Vectorology  17 
1.2.2.1 Improvements in Packaging Capacity and Transgene Expression  18 
1.2.2.2 Natural Diversity as a Source for Transcapsidation  19 
1.2.2.3 Mosaic and Chimeric Vectors  21 
1.2.2.4 Ligand Conjugation and Peptide Insertion  23 
1.2.2.5 DNA Family Shuffling and  Display Libraries  24 
1.3 AAV8, a New Primate AAV as a Gene Therapy Vector  27 
1.3.1. Capsid Structure and other Characteristics of AAV8 28 
1.3.2 Evaluation of AAV8 in Animal Models for Gene Therapy  30 
1.4 AAV Clinical Trials  31 
1.5 Aim of the Study  32 
2. Materials and Methods  34 
2.1 Materials  34 
2.1.1 Animals 34 
2.1.2 Cell Lines and Primary Cells  34 
2.1.3 Bacteria 35 
2.1.4 Viruses and AAV Vector Mutants  36 
2.1.5 Antibodies and Antisera  40 
2.1.6 Oligonucleotides  41 
2.1.6.1 Mutagenesis Primer  41 
2.1.6.2 Primer for Insertion  42 
2.1.6.3 s for Semi‐Quantitative PCR  43 
2.1.6.4 Primer/Probe Sets for Quantitative Real‐Time PCR  43 
2.1.6.5 Oligonucleotide Library Primers  44 
2.1.7 Plasmids 44 
2.1.8 DNA Probes  47 
2.1.9 Nucleotides  47 
2.1.10 Standard Marker  48 
2.1.11 Enzymes  48 
2.1.12 Kits  48 
2.1.13 Cell Culture Media and Additives  49 
2.1.14 Constituents for Bacterial Cultures  50 
2.1.15 Chemicals  50 
2.1.15.1 Special Chemicals  51 
2.1.16 Buffers and Reagents 52 
2.1.17 Equipment  53 
2.1.18 Materials  55 
2.1.19 Software  56 
2.2 Methods  57 
2.2.1 Microbiological Methods  57 
2.2.1.1 Cultivation of Bacteria  57 
2.2.1.2 Production of CaCl  Competent Bacteria  57 2
2.2.1.3  of Electrocompetent Bacteria  57 
2.2.1.4 Transformation of CaCl  Competent Bacteria  58 2
2.2.1.5  of Electrocompetent Bacteria  58 
2.2.2 Preparation, Modification and Analysis of Plasmid DNA  59 
2.2.2.1 DNA Mini‐Preparation  59 
2.2.2.2 DNA Maxi‐, Mega‐ and Giga‐ Preparation  59 
2.2.2.3 Precipitation and Purification of Plasmid DNA  60 
2.2.2.4 DNA Isolation from Cultured Cells or Animal Tissue  60 
2.2.2.5 Spectrophotometric Analysis  61 
2.2.2.6 Restriction Digest of DNA  61 
2.2.2.7 DNA Agarose‐Gel‐Electrophoresis  61 
2.2.2.8 Preparative Agarose Gel Extraction and Purification of DNA  62 
2.2.2.9 Purification of DNA Fragments after a Restriction Digest  62 
2.2.2.10 Dephosphorylation of DNA Fragments  62 
2.2.2.11 Ligation of DNA Fragments  63 
2.2.2.12 Polymerase Chain&