C-EBPα [C-EBP-alpha] downregulates c-jun expression [Elektronische Ressource] : significance in myelopoiesis and AML / vorgelegt von Janki Rangatia

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Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik IIIder Ludwig Maximilians Universität MünchenC/EBP downregulates c-jun expression: Significance in myelopoiesis andAMLDissertationzum Erwerb des Doktorgrades der Humanbiologiean der Medizinischen Fakultätder Ludwig-Maximilians-Universität zu MünchenVorgelegt vonJanki Rangatia M.Scaus Ahmedabad/Indien2003Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik IIIder Ludwig Maximilians Universität MünchenC/EBP downregulates c-jun expression: Significance in myelopoiesis andAMLDissertationzum Erwerb des Doktorgrades der Humanbiologiean der Medizinischen Fakultätder Ludwig-Maximilians-Universität zu MünchenVorgelegt vonJanki Rangatia M.Scaus Ahmedabad/Indien2003Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultätder Universität MünchenBerichterstatter: Prof. Dr. W.Hiddemann2. Berichterstatter: Prof. Dr. P.B.BeckerMitberichtstatter : Prof. Dr. M.SchliwaProf. Dr. J.P. JohnsonMitbetreuung durch denpromovierten Mitarbeiter: Dr. G. BehreDekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. K. PeterTag der mündlichen Prüfung: 24.04.2003Dedicated tomy parents4Contents1. Preface ……………………………………………………………………82. Introduction ……………………………………………………………… 92.1. C/EBPa ………………………………………………………………... 92.1.1. C/EBP family ……………………………………………………92.1.2. Domains of C/EBP ………………………………………..…...102.1.3. C/EBP in hepatocytes ………………………………………….142.1.4. C/EBP in adipocytes ………………………………………….. 152.1.5. C/EBP in hematopoiesis ……………………......................…...162.1.6.

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Publié le 01 janvier 2003
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Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik III
der Ludwig Maximilians Universität München
C/EBP downregulates c-jun expression: Significance in myelopoiesis and
AML
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Humanbiologie
an der Medizinischen Fakultät
der Ludwig-Maximilians-Universität zu München
Vorgelegt von
Janki Rangatia M.Sc
aus Ahmedabad/Indien
2003Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik III
der Ludwig Maximilians Universität München
C/EBP downregulates c-jun expression: Significance in myelopoiesis and
AML
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Humanbiologie
an der Medizinischen Fakultät
der Ludwig-Maximilians-Universität zu München
Vorgelegt von
Janki Rangatia M.Sc
aus Ahmedabad/Indien
2003Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät
der Universität München
Berichterstatter: Prof. Dr. W.Hiddemann
2. Berichterstatter: Prof. Dr. P.B.Becker
Mitberichtstatter : Prof. Dr. M.Schliwa
Prof. Dr. J.P. Johnson
Mitbetreuung durch den
promovierten Mitarbeiter: Dr. G. Behre
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. K. Peter
Tag der mündlichen Prüfung: 24.04.2003Dedicated to
my parents4
Contents
1. Preface ……………………………………………………………………8
2. Introduction ……………………………………………………………… 9
2.1. C/EBPa ………………………………………………………………... 9
2.1.1. C/EBP family ……………………………………………………9
2.1.2. Domains of C/EBP ………………………………………..…...10
2.1.3. C/EBP in hepatocytes ………………………………………….14
2.1.4. C/EBP in adipocytes ………………………………………….. 15
2.1.5. C/EBP in hematopoiesis ……………………......................…...16
2.1.6. C/EBP in other systems......…………………......................….. 20
2.1.7. C/EBP in Acute Myeloid Lukemia (AML) ……………………20
2.1.8. C/EBPa and monocytes…………………………………………. 23
2.2. c-jun …………………………….………………………………………25
2.2.1. Cellular transformation ………………………..……………….. 26
2.2.2. Apoptosis and senescence ………………………………......….. 26
2.2.3. Cell cycle …………………………………………………….…. 29
2.2.4. Domains of c-jun ………………………………………….....…. 31
2.2.5. c-jun regulation and regulated genes ………………………….... 33
2.2.6. c-jun pheonotype ………………………….......………………... 40
2.2.7. in vivo function …………………………..……………………... 41
2.3. C/EBP and c-jun members interaction in hematopoiesis …………....… 44
2.4. Model for C/EBP and c-jun regulation in myeloid differentiation…..... 46
3. Methods …………………………………………………………......….. 47
3.1. Transfections ……………………………………………….......….. 47
3.2. Northern blot ……………………………………………….......….. 51
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3.3. Immunoblotting …………………………………………….......…...55
3.4. GST-pull down …………………………………………….......……59
3.5. Co-immunoprecipitation assay ………………………………....….. 61
3.6. EMSA ………………………………………………………….……64
3.7. Retroviral transduction ………………………………………....…...67
3.8. FACS analysis ……………………………………………….......….69
3.9. Real time PCR ……………………………………………….....….. 70
3.10. in vitro translation…………………………………………………. 72
3.11. DNA amplification…………………………………………………74
3.12. Whole cell lysate..…………………………………………………. 76
3.13. Cell culture...........…………………………………………………. 78
3.14. Plasmids..............………………………………………………….. 79
3.15. May-Grünwald-Giemsa staining protocol …………………………80
3.16. Mutagenesis protocol ……………………………………………... 81
3.17. Immunoflourescence......................................................................... 85
4. Results ………………………………………………………………..….. 86
4.1. Reciprocal expression of C/EBP and c-jun ………………………. 86
4.1.1. C/EBP -/- knockout model ……………………………….…. 86
4.1.2. Myeloid cell line model ……………………………………..…88
4.2. C/EBP downregulates c-jun promoter activity ……………………91
4.2.1. Adherent cell lines ………………………………………….….91
4.2.2. U937 myeloid cell line ………………………………………... 93
4.3.1. C/EBP does not recruit TSA-sensitive co-repressor complex ..…94
4.3.2. C/EBP blocks TPA induced c-jun promoter activity ………...….95
4.4. c-jun promoter mapping ……………………………………………97
4.4.1. c-jun promoter deletion constructs schematic representation .... 97
4.4.2. c-jun promoter mapping (adherent cell line) …………………..97
4.4.3. c-jun promoter mapping (U937 myeloid cell line) ………….... 99
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