Cooperative behavior of motor proteins [Elektronische Ressource] / von Janina Beeg

Janina Beeg

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• Biologie

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• Publié par: universitat_potsdam
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 38
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Max-Planck Institut für Kolloid- und Grenzflächenforschung
Theorie und Bio-Systeme




Cooperative behavior of motor proteins





Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
"doctor rerum naturalium"
(Dr. rer. nat.)
in der Wissenschaftsdisziplin Analytische Biochemie







eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität Potsdam




von
Janina Beeg



Potsdam, im April 2007












































Elektronisch veröffentlicht auf dem
Publikationsserver der Universität Potsdam:
http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2007/1571/
urn:nbn:de:kobv:517-opus-15712
[http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-15712]







Zusammenfassung
Kinesin-1 (konventionelles Kinesin) ist ein Motorprotein des Zytoskeletts, das für
den schnellen intrazellulären Lastentransport auf Mikrotubuli verantwortlich ist. Das
Hauptinteresse vieler Studien lag bisher auf der Erforschung der
Transporteigenschaften von Einzelmotormolekülen. Der Transport in der Zelle
erfordert aber gewöhnlich kollektive Arbeit von mehreren Motoren.
In dieser Arbeit wurde die Bewegung von Kugeln als Modell für Zellorganellen, die
von Kinesin-1 Molekülen gezogen werden, in Anhängigkeit von der Motorendichte
auf der Kugeloberfläche und unterschiedlichen Kugeldurchmessern in vitro
untersuchten. Die Transportparameter Weglänge, Geschwindigkeit und die erzeugte
Kraft wurden gemessen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Transportgeschwindigkeit leicht abnimmt,
wohingegen die Weglänge und die erzeugten Kräfte mit steigender
Molekülkonzentration zunehmen. Die tatsächliche Anzahl der Motoren, die aktiv am
Transport der Kugeln beteiligt sind, wurde bestimmt, indem die Änderung des
hydrodynamischen Durchmessers der mit Kinesin bedeckten Kugeln mittels
dynamischer Lichtstreuung gemessen wurde. Außerdem wurden sterische Effekte
des verwendeten Transportsystems in die Berechnung einbezogen. Damit werden
Ergebnisse vergleichbar, die für unterschiedliche Kugeldurchmesser und
Motorkonzentrationen ermittelt wurden. Zusätzlich wurden die Verteilungen der
Weglängen für die kleinste Kugelgröße mit theoretisch ermittelten Verteilungen
verglichen. Letzteres ergab durchschnittliche Anzahlen der aktiv am Transport
beteiligten Motormoleküle, die mit den experimentell bestimmten Ergebnissen
übereinstimmen.


Abstract
The cytoskeletal motor protein kinesin-1 (conventional kinesin) is the fast carrier
for intracellular cargo transport along microtubules. So far most studies aimed at
investigating the transport properties of individual motor molecules. However, the
transport in cells usually involves the collective work of more than one motor.
In the present work, we have studied the movement of beads as artificial
loads/organelles pulled by several kinesin-1 motors in vitro. For a wide range of
motor coverage of the beads and different bead (cargo) sizes the transport
parameters walking distance or run length, velocity and force generation are
measured.
The results indicate that the transport parameters are influenced by the number of
motors carrying the bead. While the transport velocity slightly decreases, an
increase in the run length was measured and higher forces are determined, when
more motors are involved. The effective number of motors pulling a bead is
estimated by measuring the change in the hydrodynamic diameter of kinesin-
coated beads using dynamic light scattering. The geometrical constraints imposed
by the transport system have been taken into account. Thus, results for beads of
different size and motor-surface coverage could be compared. In addition, run
length-distributions obtained for the smallest bead size were matched to
theoretically calculated distributions. The latter yielded an average number of
pulling motors, which is in agreement with the effective motor numbers determined
experimentally.
Content
INTRODUCTION...................................................................................................................1
1.1 ORGANIZATION AND FUNCTION OF THE CYTOSKELETON.....................................1
1.2 FORCE GENERATION AND MOTILITY ..........................................................................4
1.3 THE MOTOR PROTEIN KINESIN-1...............................................................................8
1.3.1 STRUCTURE OF THE MOTOR PROTEIN KINESIN-1.................................................8
1.3.2 MECHANOCHEMISTRY OF A SINGLE KINESIN MOLECULE.....................................9
1.4 EXPERIMENTAL APPROACHES TO STUDY THE DYNAMICS IN A MANY -
MOTORS SYSTEM ...........................................................................................................11
1.5 OVERVIEW......................................................................................................................12
EXPERIMENTAL METHODS AND MATERIALS....................................................13
2.1 PROTEIN PURIFICATION AND ANALYSIS................................................................14
2.1.1 TUBULIN PURIFICATION.........................................................................................14
2.1.2 KINESIN PURIFICATION16
2.1.3 QUANTITY AND QUALITY ANALYSIS......................................................................18
2.1.3.1 Electrophoresis-Coomassie staining ...................................................18
2.1.3.2 Western blot.................................................................................................19
2.1.3.3 Lowry Method ..............................................................................................22
2.1.3.4 Microtubule-turbidity assay....................................................................22
2.1.3.5 Gliding assay................................................................................................23
2.2 OPTICAL MICROSCOPY23
2.2.1 VIDEO-ENHANCED LIGHT MICROSCOPY (VE-MICROSCOPY).............................24
2.2.1.1 VE-phase contrast microscopy (VE-Ph).............................................24
2.2.1.2 VE-differential interference contrast microscopy (VE-DIC) .......25
2.2.2 OPTICAL TRAP.........................................................................................................26
2.2.3 EXPERIMENTAL SETUP ...........................................................................................28
2.2.3.1 Experimental chamber .............................................................................28
2.2.3.2 Microtubule alignment..............................................................................29
2.2.3.3 Bead preparation and assay ..................................................................30
2.2.3.4 Data analyzes ..............................................................................................31
2.2.3.5 Viscosity and refractive index of the buffer solution ....................32
2.3 BINDING OF KINESIN TO BEADS...............................................................................32
2.3.1 ISOTHERMAL TITRATION CALORIMETRY (ITC) ...................................................33
2.3.2 DYNAMIC LIGHT SCATTERING (DLS)34
EXPERIMENTAL RESULTS AND DISCUSSION.................................................. 37
3.1 PROPERTIES OF THE KINESIN/MICROTUBULES SYSTEM................................... 38
3.1.1 PC-TUBULIN ACTIVITY.......................................................................................... 39
3.1.2 MICROTUBULE GLIDING ACTIVITY ....................................................................... 41
3.2 RUN LENGTH MEASUREMENTS ON BEADS OF DIFFERENT SIZE AND MOTOR
COVERAGE ...................................................................................................................... 43
3.2.1 CONCENTRATION DEPENDENCE OF MOTOR BEHAVIOR...................................... 44
3.2.1.1 Average run length ................................................................................... 44
3.2.1.2 Binding rate ................................................................................................. 47
3.2.1.3 Average transport velocity..................................................................... 48
3.2.1.4 Peculiarities at high motor concentration ........................................ 49
3.2.2 EFFECT OF LOAD SIZE........................................................................................... 50
3.2.2.1 Average run length 51
3.2.2.2 Average transport velocity 54
3.3 FORCE MEASUREMENTS .............................................................................................. 55
3.3.1 CHARACTERISTICS OF THE OPTICAL TWEEZERS AND CALIBRATION................ 56
3.3.2 FORCE GENERATION BY SEVERAL MOT