EPR spectroscopy of oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenases [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Miguel Florian Saggu

Miguel Saggu

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• Publié par: technische_universitat_berlin
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 17
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

EPR spectroscopy of oxygen-tolerant
[NiFe]-hydrogenases
vorgelegt von
Diplom-Chemiker
MiguelFlorianSaggu
aus Schwerte
Von der Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Thomas Friedrich
Berichter: Prof. Dr. Peter Hildebrandt
Berichter: Prof. Dr. Robert Bittl
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 09. Dezember 2009
Berlin 2010
D 83Abstract
Hydrogenases are metalloenzymes and play a pivotal role in the energy metabolism of a variety
of microorganisms. They catalyze the reversible cleavage of molecular hydrogen into two protons
and two electrons. However, one drawback is their catalytic inactivation upon exposure to oxy-
gen. [FeFe]-hydrogenases are irreversibly inactivated by oxygen, whereas [NiFe]-hydrogenases
usually are reversibly inactivated to the so-called ’ready’ and ’unready’ states. Only a few [NiFe]-
hydrogenases show a remarkable oxygen-tolerance, e.g. the [NiFe]-hydrogenases from the ’Knall-
gasbacterium’ Ralstonia eutropha H16 investigated in this work. Re H16 harbors three different
[NiFe]-hydrogenases, all of them being able to oxidize molecular hydrogen under ambient oxygen
concentrations. The goal of this work was to understand the origin of this oxygen-tolerance on a
molecular level and to study structure/function-relationships of the involved cofactors using a com-
bination of EPR and FTIR spectroscopy. EPR spectroscopy can be applied to detect all paramag-
netic species and to obtain information about their electronic and in its more advanced variant the
geometric structure, respectively. FTIR spectroscopy applied to hydrogenases specifically monitors
the stretching modes of the inorganic ligands at the Fe to follow redox changes of the [NiFe] center.
An important aspect of this thesis was to study biological systems in their native environment, e.g.
in whole cells or membrane fragments.
The membrane-bound [NiFe]-hydrogenase (MBH) from Re H16 was studied mainly in its native
environment, i.e. in membrane fragments that harbor over-produced MBH. All catalytically active
redox states of the [NiFe] center were identified. However, the ’unready’ Ni -A, observed inu
standard [NiFe]-hydrogenases could not be detected, which seems to be a common feature of all
oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenases. It was shown, that the MBH contains an additional high-
potential paramagnetic center. Concomitant electrochemical experiments revealed that the MBH
can be reactivated very fast at high potentials, which might indicate an important role of the addi-
tional high-potential center. This center could influence the catalytic cycle by providing electrons
to avoid Ni -A formation.u
The hyperfine structure of the Ni -B state (oxidized enzyme) was investigated in more detail byr
pulsed EPR methods, namely ENDOR and ESEEM spectroscopy. The results were compared with
the standard [NiFe]-hydrogenase from D. vulgaris Miyazaki F. Both hydrogenases showed a similar
spin density distribution in their [NiFe] center indicating that the spatial structures of the active sites
are identical. Two large hf-couplings arising from the b-protons of one bridging cysteine sulfur
were resolved and simulated in orientation-selective ENDOR spectra. With ESEEM spectroscopy
a nitrogen located in a histidine residue in the second coordination sphere of the Ni was detected,
which is a known property of many [NiFe]-hydrogenases. This histidine is hydrogen-bonded to the
same bridging sulfur.
Another interesting feature of oxygen-tolerant membrane-bound [NiFe]-hydrogenases is the
presence of two additional cysteine residues in the vicinity of the proximal [4Fe4S]-cluster. Muta-
1tions of these cysteines revealed that these residues are responsible for an alteration of the proximal
[4Fe4S] center, resulting in the additional paramagnetic center(s) detectable at high redox poten-
tials.
The oxygen-tolerant soluble hydrogenase (SH) from Re H16 and the closely related bidirectional
hydrogenase from Synechocystis PCC 6803 were investigated as well. The SH has been studied in
situ in its natural environment in whole cells. It was found, that under these conditions the [NiFe]
active site exhibited a standard-type coordination with one CO and two CN -ligands at the Fe,
which is in contrast to previous studies on purified SH. For comparison, the soluble hydrogenase
from the oxygenic phototrophic cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 was characterized with
EPR and FTIR spectroscopy. The active site Fe was also found to be coordinated with a standard
set of inorganic ligands, one CO and two CN . Practically all ready and catalytically active states
known from standard [NiFe]-hydrogenases were identified for this enzyme including two different
FeS clusters and a flavin-type radical. Both soluble hydrogenases reveal strong similarities with
respect to the redox states and FeS clusters. However, no paramagnetic Ni -B/Ni -A EPR-signalsr u
could be observed in both hydrogenases, which might be related to a coupling with another para-
magnetic species in close vicinity. The Synechocystis hydrogenase can be rapidly activated with
hydrogen under anaerobic conditions. Because of its spectral and catalytic properties, the SH from
Synechocystis represents a link between standard and oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenases.
The unusual oxygen-tolerance of the Ralstonia hydrogenases, at least for the MBH, is proba-
bly connected with a modified proximal FeS center of yet unknown structure. Possibly a similar
paramagnetic species exists close to the [NiFe] center also in SH and could be the reason for its
O -tolerance.2
2Zusammenfassung
Hydrogenasen sind Metalloenzyme und spielen eine entscheidende Rolle im Metabolismus einer
Vielzahl von Mikroorganismen. Diese Enzyme katalysieren die reversible Spaltung von moleku-
larem Wasserstoff in zwei Protonen und zwei Elektronen. Allerdings werden sie durch Sauer-
stoff katalytisch inaktiviert. [FeFe]-Hydrogenasen werden irreversibel inaktiviert, während [NiFe]-
Hydrogenasen normalerweise reversibel inaktiviert werden zu den so genannten ’ready’ und
’unready’ Zuständen. Einige [NiFe]-Hydrogenasen zeigen allerdings eine bemerkenswerte Sau-
erstofftoleranz, z.B. die in dieser Arbeit untersuchten [NiFe]-Hydrogenasen des ’Knallgasbakte-
riums’ Ralstonia eutropha H16. Re H16 enthält drei unterschiedliche [NiFe]-Hydrogenasen, von
denen alle in der Lage sind, molekularen Wasserstoff unter natürlichen Sauerstoffkonzentratio-
nen zu oxidieren. Ziel dieser Arbeit war es, die Ursache der Sauerstofftoleranz auf molekularer
Ebene zu verstehen und Struktur/Funktions-Beziehungen der beteiligten Kofaktoren zu studieren
unter Verwendung einer Kombination aus EPR und FTIR Spektroskopie. EPR Spektroskopie kann
angewendet werden, um alle paramagnetischen Zustände zu detektieren und Informationen über
die elektronische und damit räumliche Struktur zu erhalten. Mit FTIR Spektroskopie können die
Streckschwingungen der diatomigen Liganden am Fe beobachtet werden, um Redoxänderungen
des [NiFe] Zentrums zu verfolgen. Ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung biolo-
gischer Systeme in möglichst nativer Umgebung, z.B. in ganzen Zellen oder Membranfragmenten.
Die Membran-gebundene [NiFe]-Hydrogenase (MBH) von Re H16 wurde hauptsächlich in ihrer
natürlichen Umgebung untersucht, d.h. in Membranfragmenten, die überproduzierte MBH enthiel-
ten. Alle katalytisch aktiven Redoxzustände des [NiFe] Zentrums wurden identifiziert. Allerdings
konnte der ’unready’ Zustand Ni -A, bekannt aus Standard-[NiFe]-Hydrogenasen, nicht detek-u
tiert werden, was eine gemeinsame Eigenschaft sauerstofftoleranter [NiFe]-Hydrogenasen zu sein
scheint. Es konnte gezeigt werden, dass die MBH ein zusätzliches ’high-potential’ paramagneti-
sches Zentrum enthält. Elektrochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die MBH bei hohen
Potentialen sehr schnell reaktiviert werden kann, was auf eine wichtige Rolle des zusätzlichen Zen-
trums hinweisen könnte. Dieses Zentrum könnte den katalytischen Zyklus beeinflussen, indem es
Elektronen zur Verfügung stellt, die eine Bildung des Ni -A verhindern.u
Die Hyperfeinstruktur des Ni -B Redoxzustandes (oxidiertes Enzym) wurde detailliert mit Puls-r
EPR Methoden untersucht, hauptsächlich mit ENDOR und ESEEM Spektroskopie. Die erhaltenen
Resultate wurden verglichen mit der Standard-[NiFe]-Hydrogenase von D. vulgaris Miyazaki F.
Beide Hydrogenasen zeigten eine ähnliche Spindichte-Verteilung in ihrem [NiFe] Zentrum, was
auf eine vergleichbare Geometrie schliessen lässt. Hyperfeinkopplungen von zweib-Protonen eines
verbrückenden Cystein-Schwefels konnten aufgelöst und simuliert werden. Mittels ESEEM Spek-
troskopie konnte die Anwesenheit eines Histidin Stickstoffs in der zweiten Koordinationssphäre des
Ni nachgewiesen werden, was eine Eigenschaft vieler [NiFe]-Hydrogenasen ist. Dieses Histidin ist
über eine Wasserstoffbrücke an dasselbe verbrückende Schwefelatom koordiniert.
3Eine interessante Eigenschaft sauerstofftoleranter Membran-gebundener [NiFe]-Hydrogenasen
ist die Anwesenheit von zwei zusätzlichen Cysteinen in der Nähe des pr