Flavoproteins in directed evolution [Elektronische Ressource] : iterative CASTing to evolve YqjM and P450BM3 / vorgelegt von Sabrina Kille

Kille, Sabrina

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• Publié par: ruhr-universitat_bochum
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 20
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

Flavoproteins in Directed Evolution



Iterative CASTing to evolve YqjM and P450 BM3









Dissertation
Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum








vorgelegt von Diplom Chemikerin
Sabrina Kille
aus Cloppenburg



Max-Planck-Institut für Kohlenforschung, Mülheim an der Ruhr
2010


































Referent: Professor Dr. M. T. Reetz
Korreferent: Professor Dr. M. Feigel


Tag der mündlichen Prüfung: 06.08.2010





















‘Die Neugier steht immer an erster Stelle eines Problems, das gelöst werden will.’

Galileo Galilei










































Parts of this thesis were published:

Bougioukou, D. J.; Kille, S.; Taglieber, A.; Reetz, M. T., directed evolution of an Enantioselective Enoate-
Reductase: Testing the Utility of Iterative Saturation Mutagenesis. Adv. Synth. Catal. 2009, 351 (18), 3287-
3305.

Sanchis, J.; Fernandez, L.; Carballeira, J. D.; Drone, J.; Gumulya, Y.; Hobenreich, H.; Kahakeaw, D.; Kille, S.;
Lohmer, R.; Peyralans, J. J.; Podtetenieff, J.; Prasad, S.; Soni, P.; Taglieber, A.; Wu, S.; Zilly, F. E.; Reetz, M. T.,
Improved PCR method for the creation of saturation mutagenesis libraries in directed evolution:
application to difficult-to-amplify templates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, 81 (2), 387-97.



Copyright of the figures belongs to the author of the thesis, if not mentioned otherwise.

Danksagung
Meinem Docktorvater danke ich für die faszinierenden und herausfordernden Projekte und die gewährte
Freiheit bei dessen Durchführung, sowie für die Unterstützung bei fachlichen und darüber
hinausgehenden Fragen und Problemen.

Ich danke Herrn Prof. Dr. M. Feigel für die Übernahme des Korreferats sowie Herrn Prof. Dr. M. Muhler für
die Abnahme der Nebenfachprüfung.

Ich danke Frau Rathofer, Frau Enk und Frau Lohmer für die administrative Unterstützung.

Danke Hermi für deine geduldigen Unterweisungen in alle möglichen technischen Geräte (GC, Tecan
Roboter usw.) und für deine Hilfsbereitschaft bei Computer- und sonstigen Problemen. Danke Petra, für
die Synthese von 1b-e und 3b. Und Danke an das Team der Kaffeerunde (Gerlinde, Piwi, Hermi, Frederik,
Horst, Andreas und Felipe).

Mein besonderer Dank geht an die beiden Chromatographie-Abteilungen im Hause, ohne deren Hilfe diese
Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Frau Rosentreter (GC) danke ich für die akribische Bestimmung
unzähliger ee-Messungen. Herrn Deege (HPLC) für die geduldige Trennung meiner Progesterone Proben.
Mein besonderer Dank gebührt Heike (HPLC) für die schnelle Messung von weit über 20.000
Steroidproben und ihrer unendlichen Geduld, wenn ich mal wieder Sonderwünsche hatte.

I also would like to thank all the current and former group members, who I got to know during my three
years in Mülheim. It was a great experience to meet and to get known to all of you and your cultures.

I would like to thank A. Taglieber and J. Sanchis for their introduction to the YqjM project and into DE in
general. Thank you Despina for your input during the cooperation on the YqjM project and your endlessly
literature knowledge.

Besonderer Dank geht an Felipe, für das an Bord holen ins P450 Projekt. Vielen Dank Felipe für die
perfekte Zusammenarbeit, die ausführlichen Diskussionen und die vielen lustigen und langen Stunden an
der Laborbank bei dessen Umsetzung.




Zu guter Letzt danke ich all meinen Freunden, meiner Familie und besonders Horst für die moralische
Unterstützung und den Glauben an mich, besonders als ich ihn dringend benötigte. Ohne eure
Unterstützung hätte es diese Arbeit nicht gegeben.
1
Table of Contents
Table of Contents
TABLE OF CONTENTS ...................................................................................................................... 1
I INTRODUCTION .............................................................................................................................. 6
1 BIOCATALYSIS ............................................................................................................................ 6
2 ENZYME DESIGN ........................................................................................................................ 7
2.1 General ..................................................................................................................................................................... 7
2.2 Rational and random genetic diversity creating techniques ............................................................... 7
2.3 Directed evolution ............................................................................................................................................... 8
2.3.1 CASTing and ISM methodology ..................................................................................................................................... 9
2.3.2 The ‘Numbers Problem’ ................................................................................................................................................. 10
2.3.3 Protein fitness landscape .............................................................................................................................................. 11
3 THE OLD YELLOW ENZYME FAMILY ................................................................................ 12
3.1 General .................................................................................................................................................................. 12
3.2 Structure ............................................................................................................................................................... 13
3.3 Catalytic mechanism of OYEs ........................................................................................................................ 14
3.3.1 The reductive half reaction and cofactor preference ....................................................................................... 15
3.3.2 The oxidative half reaction .......................................................................................................................................... 16
3.3.3 Enzyme catalyzed H-tunneling reactions .............................................................................................................. 17
4 CYTOCHROME P450 MONOOXYGENASES ...................................................................... 18
4.1 General .................................................................................................................................................................. 18
4.2 The catalytic cycle of Cytochrome P450’s ................................................................................................ 18
4.3 Structure and Organization ........................................................................................................................... 19
4.4 The CYP102A - family ....................................................................................................................................... 23
4.4.1 CYP102A1 – P450 ...................................................................................................................................................... 24 BM32
Table of Contents
5 THESIS GOALS ......................................................................................................................... 25
II RESULTS AND DISCUSSION ..................................................................................................... 26
6 DIRECTED EVOLUTION OF YQJM ...................................................................................... 26
6.1 Directed evolution strategy ........................................................................................................................... 26
6.2 Directed evolution of YqjM ............................................................................................................................ 27
6.2.1 ‘Always the best’ ............................................................................................................................................................... 27
st nd6.2.2 ‘1 and 2 best hit’ ..........................................................................................................................................