Inhibiteurs de la voie Raf/MEK/ERK : synthèse de composés à structure 4-azaindolique et évaluation de leur efficacité par la mise au point de tests TR-FRET, Inhibitors of the Raf/MEK/ERK pathway : synthesis of 4-azaindole derivatives and evaluation of their efficiency through TR-FRET kinase assays

Fabienne Saab

Description

Sous la direction de Jean-Yves Mérour, Françoise Schoentgen
Thèse soutenue le 22 janvier 2010: Orléans
Afin de corriger la suractivation de la voie de signalisation Raf/MEK/ERK observée dans 30 % des cancers,nous avons choisi d’inhiber la kinase Raf-1. Les inhibiteurs potentiels de Raf-1 ont été conçus avec un cyclecentral original 4-azaindolique. Pour apporter de la diversité fonctionnelle au niveau des sommets C-2 et C-5lors de la synthèse, nous avons optimisé deux méthodes à partir du synthon 5-méthoxy-4-azaindole-Nphénylsulfonyle.La première est une réaction de lithiation du sommet C-2 suivie de la condensation dedifférents électrophiles et la deuxième est la C-arylation ou N-arylation du sommet C-5 à partir du dérivétriflate en 5 via des réactions de couplage pallado-catalysées de type Suzuki et Buchwald, respectivement.Ces deux méthodes ont permis d’aboutir à 2 séries de composés : une première série fonctionnalisée enposition N-1 et C-5 du noyau 4-azaindole et une deuxième série substituée en position C-5 et C-2.Pour tester les nouveaux inhibiteurs synthétisés et un inhibiteur naturel appelé PEBP, nous avons mis aupoint des tests d’activité in vitro sur l’ensemble de la cascade Raf/MEK/ERK et sur chacune des 3 kinases.Les tests ont été développés avec 2 méthodes de TR-FRET, Lance UltraTM et LanthascreenTM, et ont étévalidés avec des inhibiteurs commerciaux et comparés par rapport à la méthode radioactive PFBA.Au total, 30 produits finaux ont été évalués in vitro sur la kinase Raf-1. Grâce aux plateformes duCancéropôle GO, les produits ont aussi été testés sur 6 lignées de cellules cancéreuses et sur les kinasesdu cycle cellulaire DYRK1A, GSK3 et CDK5. Plusieurs molécules ont montré une activité antitumoraleencourageante de l’ordre du μM et un composé a été identifié comme inhibiteur de Raf-1 avec une valeurd’IC50 de 9,8 μM et une cytotoxicité sélective vis-à-vis des cellules du foie Huh7 (IC50 = 3 μM).
-4-azaindole
-Lithiation
-Couplages pallado-catalysés
-Tests d'activité kinases
Considering the implication of the Raf/MEK/ERK pathway deregulation in 30 % of human cancers, wedecided to synthesize potential Raf-1 inhibitors. They were synthesized using the original 4-azaindole as thecentral core. To introduce various types of substituents in C-2 and C-5, we developed two methodologiesfrom the building block N-benzenesulfonyl-5-methoxy-4-azaindole. The first one is the C-2 lithiation followedby the addition of various electrophiles. The second methodology is the C-5 C-arylation or the N-arylationusing palladium-catalysed cross-couplings from the C-5 triflate derivative through Suzuki or Buchwald crosscoupling reactions, respectively. The two methodologies ended up to the synthesis of two series ofcompounds. The first one is functionalized in N-1 and C-5 of the 4-azaindole core. The second one issubstituated in C-2 and C-5.In order to test the newly synthesized inhibitors as well as the natural inhibitor PEBP, we have developedseveral tests to measure in vitro the effect of inhibitors on the activity of the complete cascade Raf/MEK/ERKand also on the activities of each individual kinase. The assays were developed by using 2 TR-FRETmethods, Lance UltraTM and LanthascreenTM, and were validated with commercially available inhibitors andcompare to the radioactive PFBA method.Finally, 30 compounds were evaluated through in vitro Raf-1 assays. By using the facilities offered by theCanceropôle GO platforms, the compounds were also tested on six different tumor cell lines and on thekinases DYRK1A, GSK3 and CDK5. Several compounds displayed encouraging antitumoral activity and onecompound was identified as a Raf-1 inhibitor with an IC50 value of 9.8 μM and a selective cytotoxicity activitytowards liver tumor cells Huh7 (IC50 = 3 μM).
-4-azaindole
-Lithiation
-Palladium-catalysed cross-couplings
-Kinase activity assays
Source: http://www.theses.fr/2010ORLE2001/document

Informations

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Extrait

UNIVERSITÉ D’ORLÉANS


ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES ET TECHNOLOGIES

INSTITUT DE CHIMIE ORGANIQUE ET ANALYTIQUE et
CENTRE DE BIOPHYSIQUE MOLECULAIRE

THÈSE présentée par :
Fabienne SAAB

soutenue le : 22 Janvier 2010
pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université d’Orléans
Discipline : Interface Chimie-Biologie : Systèmes moléculaires à visées thérapeutiques

Inhibiteurs de la voie Raf/MEK/ERK :
Synthèse de composés à structure 4–
azaindolique et évaluation de leur efficacité
par la mise au point de tests TR-FRET

THÈSE dirigée par :
Françoise SCHOENTGEN Directeur de Recherche, CNRS Orléans et UPMC
Jean-Yves MÉROUR Professeur, Université d’Orléans
RAPPORTEURS :
Jean-Claude FLORENT Directeur de recherche, Institut Curie Paris
Ralph JOCKERS Directeur de recherche, Institut Cochin Paris
____________________________________________________________________
JURY :
Christiane GUILLOUZO Directeur de recherche, Université de Rennes 1,
Présidente du jury
Philippe BOUGNOUX Professeur PU-PH, Université de Tours
Valérie BÉNÉTEAU Maître de conférences, Université d’Orléans
Jean-Claude FLORENT Directeur de recherche, Institut Curie Paris
Ralph JOCKERS Directeur de recherche, Institut Cochin Paris
Sylvain ROUTIER Professeur, Université d’Orléans
Françoise SCHOENTGEN Directeur de Recherche, Université de Paris 6
Jean-Yves MÉROUR Professeur, Université d’Orléans
tel-00503901, version 2 - 11 Mar 2011tel-00503901, version 2 - 11 Mar 2011Remerciements

Le présent travail a été réalisé au sein de deux laboratoires ; le Centre de Biophysique
Moléculaire à Orléans (CBM, UPR 4301 CNRS) sous la direction du Directeur de recherche
Françoise Schoentgen ; et l'Institut de Chimie Organique et Analytique à l'Université
d'Orléans (ICOA, UMR-CNRS 6005), sous la direction du Professeur Jean-Yves Mérour.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude au Directeur de recherche Françoise
Schoentgen et au Professeur Jean-Yves Mérour pour la confiance dont ils ont fait preuve à
mon égard en me proposant ce sujet de recherche. Je leur adresse également mes sincères
remerciements pour leur disponibilité, leur soutien, les conseils éclairés et leur rigueur
scientifique que j’ai eu la chance de recevoir tout au long de ces trois années.
Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance au Professeur Sylvain Routier et au
Docteur Valérie Bénéteau pour l’intérêt constant qu’ils ont porté à ce travail. Leurs précieux
conseils qu’ils ont su me prodiguer, et la disponibilité dont ils ont fait preuve, m’ont
beaucoup aidée dans la conduite de ce travail.
Je tiens à exprimer ma gratitude aux Directeurs de recherche Jean-Claude Florent et
Ralph Jockers pour avoir accepté d’être rapporteurs de cette thèse et d’assurer le travail
d’évaluation qui en découle.
Mes remerciements s'adressent également au Directeur de recherche Christiane
Guillouzo, au Docteur Valérie Bénéteau, au Professeur en médecine Philippe Bougnoux et au
Professeur Sylvain Routier qui me font l’honneur de participer au jugement de ces travaux en
tant qu’examinateurs.
Je tiens également à remercier tout particulièrement les chercheurs avec lesquels nous
avons travaillé en collaboration et sans qui ce travail n’aurait pas été possible : Agnès
Delmas et Vincent Aucagne pour m’avoir si gentiment accueillie dans leur laboratoire et de
m’avoir fait bénéficier de leur expertise en synthèse peptidique ; Stéphane Bourg et Françoise
Vovelle pour leur travail effectué en modélisation moléculaire ; les équipes de Christiane
Guillouzo et Laurent Meijer pour les tests réalisés sur les lignées de cellules tumorales et sur
les kinases CDK5, GSK3, DYRK1A ; l’équipe de Martine Cadène pour les analyses de
spectrométrie de masse et l’équipe de Christian Damblon pour l’étude des interactions
peptides/PEBP par RMN.
Je remercie vivement l’Institut National du Cancer et le Cancéropôle Grand Ouest
pour le financement de cette thèse.
Je souhaiterais remercier très chaleureusement tous mes collègues de l’I.C.O.A. et du
C.B.M. qui m’ont permis de réaliser ce travail dans une ambiance très sympathique.
Je tiens également à remercier tout particulièrement ma mère et Nicolas pour le
soutien et les encouragements qu’ils m’ont apporté pendant ces trois années.
Enfin, un immense merci à ma famille et mes amis qui ont fait le déplacement pour
assister à ma soutenance.

tel-00503901, version 2 - 11 Mar 2011Abréviations :
AA: Acide aminé
aq. : Aqueux
(Hét)Ar : Hétéroaromatique
5-HT : 5-Hydroxytryptamine ou Sérotonine
Ac : Acétyle
AC : Adénylate cyclase
ADP : Adénosine diphosphate
Akt ou PKB
ALPHA : Amplified Luminescence Proximity Homogenous assay
AMM : Autorisation de mise sur le marché
AMPc : Adénosine monophosphate cyclique
Ar ou arom : Aromatique
ARN : Acide ribonucléique
ATP : Adénosine triphosphate
Bcr-Abl : Bcr, Breakpoint cluster region, Abl, Abelson
BINAP : 2,2'-bis(diphénylphosphino)-1,1'-binaphthyle
Bn ou Bzl : Benzyle
Boc : tert-Butoxycarbonyle
Bu : Butyle
BuLi: Butyllithium
Bzl ou Bn : Benzyle
CCM : Chromatographie sur couche mince
CDK : Cyclin-dependent kinase
Cpm : Coups par minute
CR : Conserved region
CRD : Cystein rich domain
CSP : Cellules souches périphériques
Da : Dalton
DBU : 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène
DCC : Dicyclohexylcarbodiimide
DCE : Dichloroéthane
DCM : Dichlorométhane


tel-00503901, version 2 - 11 Mar 2011DIPA: Diisopropylamine
DIPEA : Diisopropyléthylamine
DMA : Diméthylacétamide
DMAP : 4-Diméthylaminopyridine
DME : Diméthyléther
DMF : N,N-diméthylformamide
DMF-DEA : diméthylformamide diéthyle acétal
DMF-DMA : diméthylformamide diméthyle acétal
DMSO : Diméthylsulfoxyde
DNMT : DNA méthyltransférase
DO : Densité optique
DPPF : 1,1’-bis(diphénylphosphino)ferrocène
DTT : Dithiotréitol
DYRK1A : Dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1A
+E : Electrophile
EC : Effective concentration, concentration conduisant à 50 % d’activité 50
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid
EGFR: Epidermal growth factor receptor
EP : Ether de pétrole
Eph : Ephrine
éq. ou equiv. : Equivalent
ERK : Extracellular signal-regulated kinase
ES : Electrospray
Et : Ethyle
FAK : Focal-adhesion kinase
FDA : Food and Drug Administration
FI : Fluorescence Intensity
Fmoc : 9H-Fluorèn-9-yl-méthoxycarbonyle
FMN : Flavine mononucléotide
FP : Fluorescence Polarization
FQ : Fluorescence Quench
FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer
GAB1 : GRB2-associated binding protein 1


tel-00503901, version 2 - 11 Mar 2011GFP : Green fluorescent protein
GIST : Gastrointestinal stromal tumor
GP : Groupe protecteur
GPCR : G protein-coupled receptor
GRB2 : Growth factor receptor-bound protein 2
GSK-3 : Glycogen synthase kinase 3
GST : Glutathion-S-Transférase
GTP : Guanosine triphosphate
HAT : Histone acétyltransférase
HCC : Hepatocellular carcinoma
HDAC : Histone désacétylase
HEPES : 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
HER : Human epidermal receptor
HGF : Hepatocyte growth factor
HLA : Human leucocyte antigen
HMPA : 4-Hydroxymethylphenoxyacetic acid
HPLC : High performance liquid chromatography
HRMS : High resolution mass spectroscopy
HSP : Heat shock protein
Hz : Hertz
HOBt : 1-Hydroxy-benzotriazole
HBTU : 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate
HATU : 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate
IC50 : Concentration inhibitrice à 50 %
IGFR : Insulin-like growth factor receptor
IKK : I B kinase
IL : Interleukine
Ind : Indole
IR : Infra rouge ou Insulin Receptor
IRS : Insulin receptor substrate
IS : Ion spray
JAK : Janus kinase
JNK : Jun N-terminal kinase


k
tel-00503901, version 2 - 11 Mar 2011LDA : Lithium diisopropylamide
LiTMP : Lithium tétraméthylpipéridide
LMC : Leucémie myéloïde chronique
mAbs : Anticorps monoclonaux
M.O. : Micro-onde
MALDI : Matrix-assisted laser desorption/ionization
MAPK : Mitogen-activated protein kinase
MBP : Myelin basic