RIMs and RIM interacting proteins [Elektronische Ressource] : localization and function under physiological and pathophysiological conditions / vorgelegt von Tobias Mittelstaedt

Tobias Mittelstaedt

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• Biologie

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• Publié par: rheinische_friedrich-wilhelms-universitat_bonn
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 22
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 7 Mo

Extrait

RIMs and RIM interacting proteins:
localization and function under
physiological and pathophysiological
conditions
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. Nat.)
der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
Vorgelegt von

Tobias Mittelstaedt

aus Aachen
Bonn 2010 Angefertigt mit Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen
Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Diese Dissertation ist auf dem Hochschulschriftenserver der ULB
Bonn unter http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online
elektronisch publiziert.



Erscheinungsjahr: 2010
Erstgutachter: Prof. Dr. Susanne Schoch-McGovern
Zweitgutachter: Prof. Dr. Albert Haas
Zusammenfassung III
Zusammenfassung
Die Exozytose synaptischer Vesikel findet an einem spezialisierten Bereich der präsynapti-
schen Nervenendigung statt. Eine Schlüsselkomponente des Proteinnetzwerkes dieses Ak-
tive Zone genannten Bereiches sind die großen Multidomänenproteine RIM1 und RIM2. Als
Adapterproteine interagieren sie simultan mit einer Vielzahl anderer an der Aktiven Zone
angereicherter Proteine und verbinden diese unter anderem mit spannungsabhängigen Kal-
ziumionenkanälen und synaptischen Vesikelproteinen. Neben der kompletten -Variante von
RIM1 und -2 existieren im Gehirn zwei weitere, kürzere RIM Isoformen ( und ), die von
den vier Genen RIM1-4 exprimiert werden (1, 1, 2, 2, 2, 3, 4 ). Von diesen verschie-
denen RIM Isoformen war RIM1 das einzige, das zu Beginn dieses Projektes bereits detail-
liert erforscht war. Mit RIM1 defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass RIM1 zur
Induktion von Formen präsynaptischer Kurz- und Langzeitplastizität erforderlich ist. Patholo-
gische Veränderungen der Effizienz dieser synaptischen Plastizität und Reizweiterleitung
wurden in den letzten Jahren mit vielen neurologischen Erkrankungen in Verbindung ge-
bracht, und scheinen z. B. zur Entstehung von Epilepsie beizutragen.
In dieser Arbeit sollten daher (1) die gemeinsamen und sich voneinander unterscheidenden
Funktionen der verschiedenen -RIM Proteine im normalen wie auch epileptischen Gehirn,
sowie (2) die Veränderungen des präsynaptischen Proteinnetzwerkes im Verlauf der Epilep-
togenese untersucht werden.
(1) Zur Analyse der -RIM Isoformen wurden Mäuse verwendet, denen entweder das RIM2
Protein oder sowohl RIM1α als auch -2 fehlten. Während RIM2 -defiziente Mäuse keinen
physiologisch messbaren Phänotyp zeigten, erwies sich das Fehlen beider RIM- Proteine
als postnatal lethal. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich zwar intakte synaptische Struk-
2+turen ausbildeten, die spannungs- bzw. Ca -abhängige Neurotransmitterfreisetzung jedoch
stark beeinträchtigt war.
(2) Zur Charakterisierung des präsynaptischen Proteinnetzwerkes wurden zunächst neuro-
nalen Expressionsmuster an der Aktiven Zone angereicherter Proteine untersucht. Dabei
konnte ein neues Mitglied der RIM-BP Familie beschrieben werden. Mit Hilfe eines Tiermo-
dells für chronische Temporallappenepilepsie wurde dann die Expression der Proteinfamilien
in verschiedenen hippokampalen Subregionen im Verlauf der Epileptogenese auf mRNA-
und Proteinebene analysiert. Es konnte eine Vielzahl von Proteinen identifiziert werden, de-
ren Expression durch die pathologisch gesteigerte synaptische Aktivität des primären epilep-
tischen Anfalls, sowie auch im weiteren Verlauf der Epileptogenese signifikant verändert war.
Diese Arbeit trägt somit zum erweiterten Verständnis des präsynaptischen Vesikel-
fusionsapparates bei und liefert neue Erkenntnisse über die mögliche Funktion an der Akti-
ven Zone angereicherter Proteinfamilien in Reaktion auf gesteigerte synaptische Aktivität
sowie während der Entstehung chonischer Epilepsie.
α
α α
α α
α
α α
α
γ γ γ β α β α
γ β
αTable of Contents IV
Table of Contents
Zusammenfassung...........................................................................................III  
Table of Contents............................ IV  
Figures............................................................................................................. VII  
Tables............... IX  
Abbreviations.................................................................................................... X  
URLs............... XIII  
1   Introduction..1  
1.1   The Synaptic Vesicle Cycle.........................................................................1  
1.2   Architecture of the Active Zone...4  
1.3   Active zone enriched and associated protein families ................................6  
1.3.1   α-RIMs – central components of the CAZ........6  
1.3.2   Munc 13 – essential vesicle priming proteins specifically
enriched at the active zone.............................................................10  
1.3.3   The Proteins of the ELKS – Family................12  
1.3.4   Bassoon and Piccolo - presynaptic cytomatrix scaffolding
proteins...........................................................14  
1.3.5   The Liprin-α protein family..............................................................15  
1.3.6   RIM Binding Proteins at the active zone.........................................17  
1.4   The Synaptotagmin gene family17  
1.5   Synaptic Plasticity .....................................................................................20  
1.5.1   An experimental animal model of Temporal Lobe Epilepsy: A
model to study proteins involved in synaptic plasticity in vivo ........24  
2   Aims ............................................................................................................26  
2.1   The function of -RIMs...............26  
2.2   Localization of RIMs and RIM binding proteins............26  
2.2.1   α-Liprins ..........................................................................................26  
2.2.2   Synaptotagmins...............27  
2.2.3   The Rim-BP Protein family...............................27  
2.3   Effect of pathophysiological synaptic activity on the composition of the
presynaptic release machinery ...................................................................27  
3   Materials and Methods..............28  
3.1   Animal experiments...................................................................................28  
αTable of Contents V
3.1.1   Genotyping .....................................................................................28  
3.1.2   Whole body staining.......28  
3.1.3   The pilocarpine model of Temporal Lobe Epilepsy ........................29  
3.2   DNA methods............................................................................................30  
3.2.1   cDNA preparation...........................................30  
3.2.2   cDNA cloning..................30  
3.2.3   Sequence analysis .........................................30  
3.2.4   Real time RT-PCR..........31  
3.2.5   In situ Hybridization........................................34  
3.2.6   Image acquisition and processing after in situ hybridization ..........36  
3.2.7   Quantification of expression strength.............36  
3.3   Protein methods ........................................................................................37  
3.3.1   Preparation of rodent brain.............................37  
3.3.2   Hippocampal subfield microdissection ...........................................37  
3.3.3   Morphometric analysis of motoneurons..........38  
3.3.4   Fluoro-Jade B essay.......................................38  
3.3.5   Protein quantifications of the RIM knockout mice...........................38  
3.3.6   Protein fractionation........................................39  
3.3.7   Quantitative western blot of microdissected hippocampi................39  
3.3.8   Antibodies.......................................................................................40  
3.4   Miscellaneous...........................41  
4   Results ........................................................................................................42  
4.1   Localization and function of α-RIMs..........................42  
4.1.1   Differential expression of RIM1 and RIM2 isoforms .......................42  
4.1.2   Characterization of RIM2α knockout mice......................................45  
4.1.2.1   Impaired survival of RIM1α /2α double KO mice................................49  
4.1.2.2   Brain morphology and synapse structure of RIM1α/2α D KO mice....50  
4.1.2.3   Structure of the neuromuscular junction in RIM1α/2α double KO
mice.............................................