Therapeutic application of dominant negative {PDGF-β-Receptor [PDGB-beta- Receptor] in liver fibrosis [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Erawan Borkham-Kamphorst

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• Publié par: rheinisch-westfalischen_technischen_hochschule_-rwth-_aachen
• Publié le: 01 janvier 2004
• Nombre de lectures: 7
• Langue: English
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Extrait

THERAPEUTIC APPLICATION
OF DOMINANT-NEGATIVE PDGF β-RECEPTOR
IN LIVER FIBROSIS
Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften
der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades
einer Doktorin der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Erawan Borkham-Kamphorst, M.Sc.
aus
Udornthani, Thailand
Berichter:
Universitätsprofessor Dr. med., Prof.h.c.(RCH) Axel M. Gressner sprofessor Dr. rer. nat. Fritz M. Kreuzaler
Tag der mündlichen Prüfung: 10. November 2004
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar. Parts of the contents of this thesis were prior published in:
[1] Borkham-Kamphorst, E., Stoll, D., Gressner, A. M., Weiskirchen, R. (2004): Inhibitory
effect of soluble PDGF β-receptor in culture-activated hepatic stellate cells. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 317, 451-462.
[2] Borkham-Kamphorst, E., Herrmann, J., Stoll, D., Treptau, J., Gressner, A. M.,
Weiskirchen, R. (2004): Dominant-negative soluble PDGF- β receptor inhibits hepatic
stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84, 766-777.
I IIAbstract
Upon liver injury hepatic stellate cells (HSC) undergo phenotype transformation with
acquisition of myofibroblast-like features characterized by increased cell proliferation, motility,
contractility and extra cellular matrix production. HSC activation is regulated by several cytokines
and growth factors including platelet derived growth factor B-chain (PDGF-BB) which exerts
cellular effects by binding to PDGF receptors (PDGFR) and further inducing receptor
dimerization and tyrosine-autophosphorylation, thus initiating various signaling pathways,
amongst which MAPK and PI3K as principals.
These PDGF signaling pathways may provide a potential therapeutic target to modulate
the fibrotic response in liver. We therefore generated a dominant-negative soluble PDGFR
consisting of PDGFR β extracellular domains connected to the IgG-Fc part of human
immoglobulin, and used adenovirus type 5 mediated gene transfer into Cos-7 cells and HSC.
This Ad5-CMV-sPDGFR β construct produced a secreted chimeric protein with two cystein
residues at the hinge region of the IgG-Fc part, culminating in predimerized soluble receptors.
This PDGFR β secreted efficiently into the conditioned media of both Cos-7 cells and HSC and
binds PDGF-BB. The secreted protein from Cos-7 cells was purified and applied to test its
inhibitory effects on PDGF signaling in HSC. The soluble PDGFR β did inhibit autophosphorilation
of endogenous membrane-bound receptors upon PDGF stimulation and completely blocked p44
and p42 (ERK1 and ERK2) phosphorylation. PDGF activation of ERK triggers proliferative
responses in HSC, further underlining that our sPDGFR β inhibits HSC proliferation and DNA
synthesis along with inhibition of PDGF-induced PI3K/Akt activation, thus leading to reduced
collagen type I( αl) gene expression.
Adenovirus-mediated sPDGFR β gene transfer in HSC in vitro proved highly effective.
Infected HSC produced the soluble receptor to scavenge available PDGF-BB and inhibit HSC
proliferation. Ad5-CMV-sPDGFR β infected HSC did inhibit also autocrine looping on PDGF
mRNA production resulting in decreased expression of thrombospondin-1, a latent TGF- β
activator, leading to decreased fibrogenesis as proven by reduced levels of collagen type I( αl)
mRNA compared to the control cultures.We then used a bile duct ligation (BDL) rat model to
examine the effects of sPDGFR β on hepatic fibrogenesis. It is known that expression of
PDGFR β-subunit does increase during experimental liver injury. In our model both approaches,
adenovirus mediated sPDGFR β gene transfer and direct application of sPDGFR β as purified
protein, significantly attenuated ongoing fibrosis in BDL rats as evidenced by reduced expression
of α-SMA and collagen type I( αI).
In conclusion, our experiments did demonstrate the potent antifibrogenetic effects of
sPDGFR β, a PDGF antagonist, in experimentally induced liver fibrosis.
III IVKurzzusammenfassung
Leberverletzungen führen zu einer Aktivierung hepatischer Sternzellen (HSC) und einer
phänotypischen Umwandlung dieser Zellen zu kontraktilen Myofibroblasten. Diese zeichnen sich
durch eine erhöhte Motilität, Kontraktilität und Produktion extrazellulärer Matrix aus. Diese
zelluläre Aktivierung wird reguliert durch verschiedene Zytokine und Wachstumfaktoren,
einschließlich des Platelet-derived growth factors (PDGF-BB). Dieser Wachstumsfaktor bindet an
spezifische Rezeptoren (PDGFR), die dimerisieren und an spezifischen Tyrosinresten
autophosphoryliert werden. In deren Folge werden spezifische Signalwege, unter anderem die
MAPK- und des PI3K-Signalwege aktiviert.
Diese durch PDGF-vermittelten Signalwege stellen ein mögliches therapeutisches Ziel
dar, um das Fibrosegeschehen in der Leber zu modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde ein
dominant-negativer, löslicher Rezeptor kloniert, in dem die extrazellulare Dömäne des PDGF-
Rezeptors (PDGFRβ) mit dem IgG-Fc Teil eines menschlichen Immoglobulins fusioniert wurde.
Durch adenoviral vermittelten Gentransfer wurde dieses Konstrukt in Cos-7 und HSC
eingebracht und seine Expression untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass durch Infektion
mit dem entsprechenden Adenovirus (Ad5-CMV-sPDGFRβ) das chimäres Protein produziert und
in das Kulturmedium ausgeschieden wird. In diesem Protein sind jeweils zwei einzelne
Aminosäurenketten über die Cysteinreste des IgG-Fc Teils miteinander verbunden. Das
sekretierte Protein wurde gereinigt und es konnte nachgewiesen werden, dass der lösliche
PDGFR den Liganden (PDGF) binden und die Autophosphorylierung des endogenen Rezeptors
inhibieren kann. Ebenso konnte nachgewiesen werden, dass der durch PDGF aktivierte
ERK1/ERK2 Signalweg blockiert werden kann. Ebenso führte die Applikation des artifiziellen
Rezeptors zu einer Proliferationshemmung und einer verringerten Kollagenexpression. Auch der
autokrine Expressionsloop des PDGFs und die Expression von Thrombospondin, einem
wichtigen Aktivator des latenten TGF-β, konnte durch Infektion mit Ad5-CMV-sPDGFRβ
verringert werden.
Der lösliche Rezeptor war zudem in der Lage, die Expression typischer Fibrosemarker,
wie zum Beispiel α-SMA und Kollagen I(αI), in dem Gallengangsligatur-Modell der Ratte zu
senken. Dabei war es unerheblich, ob der lösliche Rezeptor durch adenovirale Expression
eingebracht oder das gereinigte Protein eingesetzt wurde.
Zusammenfassend zeigten diese Experimente das starke antifibrotische Potential dieses
PDGF-Antagonisten in verschiedenen Modellen der experimentell induzierten Leberfibrose.

V

VITable of contents
1 INTRODUCTION .................................................................................................. 1
1.1 Hepatic fibrogenesis ........................................................................................ 2
1.2 HSC activation 2
1.3 Resolution of liver fibrosis .............................................................................. 3
1.4 PDGF and signal transduction in HSC ........................................................... 4
1.4.1 Ligands and receptors ................................................................................. 4
1.4.2 Intracellular signal transduction ................................................................... 5
1.4.3 PDGF antagonists ....................................................................................... 7
1.5 Adenovirus mediated gene transfer in liver fibrosis..................................... 7
2 MATERIALS ....................................................................................................... 11
2.1 Products.......................................................................................................... 11
2.2 Chemicals 12
2.3 Enzymes 15
2.4 Antibodies 16
2.5 Primers ............................................................................................................ 17
2.6 Reagent systems and radioactive nucleotides ........................................... 18
2.7 Other biomolecular reagents ........................................................................ 19
2.8 Cell and bacterial culture media ................................................................... 20
2.9 Biological Materials........................................................................................ 21
2.9.1 Bacteria...................................................................................................... 21
2.9.2 Cells........................................................................................................... 21
2.9.3 Plasmids .................................................................................................... 21
2.10 Solutions and buffers .................................................................................... 22
VII2.11 Animal models................................................................................................ 32
3 METHODS .......................................................................................................... 33
3.1