Vibrational spectroscopic and electrochemical investigations of multi-centered heme proteins in biomimetic membrane architectures [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Marcel Günther Friedrich

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• Publié par: johannes_gutenberg-universitat_mainz
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 10
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 22 Mo

Extrait

Marcel G. Friedrich
Vibrational Spectroscopic and
Electrochemical Investigations of Multi-centered Heme Proteins in
Biomimetic Membrane Architectures
Mainz 2007Vibrational Spectroscopic and Electrochemical
Investigations of Multi-centered Heme Proteins in
Biomimetic Membrane Architectures
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
”’Doktor der Naturwissenschaften”’ (Dr. rer. nat)
am Fachbereich Chemie und Pharmazie
der Johannes Gutenberg-Universit¨at Mainz
Vorgelegt von:
Marcel Gunther Friedrich¨
geboren in Dernbach
Mainz, March 2007Damit dasMogliche entsteht,¨
mussimmer wieder dasUnmogliche versucht werden.¨
Hermann Hesse
To create thePossible,
you have tocontinue trying theimpossible.
Hermann HesseDiese Doktorarbeit ist meinen Eltern gewidmet,
fu¨r ihre immerwa¨hrende Unterstu¨tzung
¨und den großartigen Ruckhalt, den sie immer
darstellten.
This doctoral thesis is dedicated to my parents,
for their marvellous and neverending support.Erklarung¨
Alle wesentlichen Tatigkeiten zur Diplomarbeit wurden am Max-Planck-Institut¨
fu¨r Polymerforschung in Mainz durchgefu¨hrt.
Ich versichere, dass ich meine Dissertation selbstst¨andig verfaßt und
keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Mainz, den 5th March 2007
Marcel FriedrichAbstract
Membrane proteins play a major role in every living cell. They are the key factors in
the cell’s metabolism and in other functions, for example in cell-cell interaction, signal
transduction, and transport of ions and nutrients. Cytochrome c oxidase (CcO), as one
of the membrane proteins of the respiratory chain, plays a significant role in the energy
transformation of higher organisms. CcO is a multi centered heme protein, utilizing re-
dox energy to actively transport protons across the mitochondrial membrane. One aim of
this dissertation is to investigate single steps in the mechanism of the ion transfer process
coupled to electron transfer, which are not fully understood. The protein-tethered bilayer
lipid membrane is a general approach to immobilize membrane proteins in an oriented
fashion on a planar electrode embedded in a biomimetic membrane. This system enables
the combination of electrochemical techniques with surface enhanced resonance Raman
(SERRS), surface enhanced reflection absorption infrared (SEIRAS), and surface plasmon
spectroscopy to study protein mediated electron and ion transport processes.
The orientation of the enzymes within the surface confined architecture can be controlled
by specific site-mutations, i.e. the insertion of a poly-histidine tag to different subunits of
the enzyme. CcO can, thus, be oriented uniformly with its natural electron pathway entry
pointing either towards or away from the electrode surface. The first orientation allows
an ultra-fast direct electron transfer(ET) into the protein, not provided by conventional
systems, which can be leveraged to study intrinsic charge transfer processes. The second
orientation permits to study the interaction with its natural electron donor cytochrome c.
Electrochemical and SERR measurements show conclusively that the redox site structure
and the activity of the surface confined enzyme are preserved. Therefore, this biomimetic
system offers a unique platform to study the kinetics of the ET processes in order to clar-
ify mechanistic properties of the enzyme. Highly sensitive and ultra fast electrochemical
techniques allow the separation of ET steps between all four redox centres including the
determination of ET rates. Furthermore, proton transfer coupled to ET could be directly
measured and discriminated from other ion transfer processes, revealing novel mechanistic
information of the proton transfer mechanism of cytochrome c oxidase. In order to study
the kinetics of the ET inside the protein, including the catalytic center, time resolved
SEIRAS and SERRS measurements were performed to gain more insight into the struc-
tural and coordination changes of the heme environment.
The electrical behaviour of tethered membrane systems and membrane intrinsic proteins
as well as related charge transfer processes were simulated by solving the respective sets
of differential equations, utilizing a software package called SPICE. This helps to under-
stand charge transfer processes across membranes and to develop models that can help to
elucidate mechanisms of complex enzymatic processes.Membranproteine spielen eine zentrale Rolle in jeder lebenden Zelle. Sie haben eine Schlus¨ -
selfunktioninvielenProzessen, wiebeispielsweiseimMetabolismusvonZellen, derZell-Zell
¨Interaktion, der Signal Ubermittlung und dem Transport von Ionen und N¨ahrstoffen.
Cytochrome c Oxidase ist eines der Membranproteine in der Atmungskette und spielt eine
wichtige Rolle bei der Energie-Transformation in hoh¨ er entwickelten Organismen. Es ist
ein Ham-Protein mit mehrere Redox Zentren, das die Energie der Redox Prozesse zum¨
aktiven Transport von Protonen u¨ber die Mitochondrienmembrane nutzt. Ein Ziel dieser
Arbeit ist die Untersuchung des Mechanismus einzelner Schritte des Protonentransfers, die
an Eletronentransferprozesse innerhalb des Proteins gekoppelt sind.
Die sogenannte ’Protein-tethered Bilayer Lipid Membrane’ ist ein universeller Ansatz zur
ImmobilisierungvonMembranproteinenaufOber߬achen, eingebettetineinervorgegebenen
Orientierung und in ein biomimetisches Membransystem. Dieses System erlaubt die kom-
binierteAnwendungvonelektrochemischenTechnikenmitoberfl¨achen-verst¨arkterresonan-
ter Raman (SERRS), oberflachen-verstarkter Reflektions-Absorptions Infrarot (SEIRAS)¨ ¨
und Ober߬achenplasmonen Spektroskopie, um Elektronen- und Ionentransferprozesse von
Proteinen zu untersuchen. Die homogen orientierte Immobilisierung der Proteine in dieser
Oberflachen-gebundenen Architektur kann durch spezifische Mutationen, d.h. die Insertion¨
eines Poly-Histidine Ankers an jeweils verschiedenen Untereinheiten des Enzyms, kontrol-
liert werden. Damit kann die Cytochrome c Oxidase entweder mit ihrer naturlichen Elek-¨
tronenakzeptorseite zur Elektrode hin oder von ihr weg orientiert werden. Die erstgenannte
Orientierung ermoglicht einen sehr schnellen Elektronentransfer (ET) zum Protein, der mit¨
herk¨ommlichen Systemen so nicht m¨oglich ist. Somit ist es m¨oglich, intrinsische Prozesse
des Proteins zu untersuchen. Die zweite Orientierung hingegen ermoglicht die Interaktion¨
des Enzyms mit dem naturlichen Elektronenubertrager, Cytochrome c, zu untersuchen.¨ ¨ ¨
Elektrochemische und SERR Messungen zeigen eindrucksvoll, dass die Strukturen der
redox-aktiven Zentren wie auch die Aktivita¨t des Systems auf der Oberflac¨ he nach dem Im-
mobilisieren erhalten bleiben. Damit stellt dieses biomimetische System eine einzigartige
Plattform da, mit deren Hilfe man die Kinetik von ET -Prozessen und die Mechanistischen
Eigenschaften von Enzymen untersuchen kann. Elektrochemische Techniken erlauben die
einzelnen ET -Schritte zwischen den vier Redox-Zentren der Oxidase aufzulosen und deren¨
Geschwindigkeitskonstantenzu bestimmen. DesWeiterenkonntederProtonentransfer, der
mit dem Elektronentransfer gekoppelt ist, direkt unabhangig gemessen werden. Damit war¨
es m¨oglich neue Informationen u¨ber den Mechanismus der Protonentranslokation der Cy-
tochrome c Oxidase zu erlangen. Um die Kinetik des ET innerhalb des Proteins bis zum
des katalytischen Zentrum zu untersuchen, wurden zeitaufgel¨aste SEIRAS und SERRS
Messungen durchgefuhrt, um einen tieferen Einblick in die zeitabhangigen Veranderungen¨ ¨ ¨
von Struktur und Koordination der Hamumgebung zu erhalten.¨
IIDas elektrische Verhalten von Oberflachenverankerten Membransystemen und der ein-¨
gelagerten Membranproteine, wie auch die damit zusammenh¨angenden Ladungstransfer-
prozesse, konnten simuliert werden. Dies war moglich durch eine numerische Losung der¨ ¨
Differentialgleichungen der genannten Prozesse mittels des Software-Paketes SPICE. Dies
ist insbesondere fu¨r das bessere Verst¨andnis dieser Prozesse hilfreich und auch um Modelle
zu entwickeln, die dabei helfen konnen die Mechanismen von komplexen enzymatischen¨
Prozessen aufzukl¨aren.
III