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Extracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa a partir de la bacteria carboxidótrofaOligotropha carboxidovorans*Extraction and purification of the enzyme carbon monoxide dehydrogenase from the carboxidotrophic bacteria Oligotropha carboxidovorans, OM 5 strain

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Resumen
En este trabajo se reporta la extracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa a partir de la bacteria Oligotropha carboxidovorans, cepa OM 5. La bacteria creció de manera autótrofa en un medio mineral, en una atmósfera saturada con monóxido de carbono, a 30 °C con agitación constante. Para la obtención de los extractos enzimáticos crudos, los cultivos se sometieron a ruptura por sonicación, solubilización con detergente no iónico y centrifugación con el fin de eliminar los restos celulares. En el proceso de purificación, los extractos enzimáticos crudos se pasaron a través de una columna de exclusión molecular y otra de intercambio iónico.
Abstract
This paper reports the extraction and purification of the carbon monoxide dehydrogenase enzyme from the Oligotropha carboxidovorans bacteria, OM 5 strain. The bacteria grew autotrophically in a mineral medium, in carbon monoxide saturated atmosphere, at 30°C with constant agitation. In order to obtain the crude enzymatic extracts, the crops underwent a breakdown by sonication, solvolysis with non-ionic detergent and centrifugation to eliminate the cellular debris. During the purification process, the crude enzymatic extracts were passed through a molecular exclusion column as well as through an ion-exchange one.
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Extracción y purificación de la enzima
monóxido de carbono deshidrogenasa
a partir de la bacteria carboxidótrofa
*Oligotropha carboxidovorans
Extraction and purification of the enzyme carbon monoxide
dehydrogenase from the carboxidotrophic bacteria Oligotropha
carboxidovorans, OM 5 strain
Raúl A. Cuervo
Bióloga. Profesor Tiempo Completo de la USB
Clara Hurtado Enrique Bravo
Química, magíster en Química, Bioquímico, magíster en Ciencias,
Universidad del Valle. Universidad del Valle.
Neyla Benítez Walter Torres
Bióloga, magíster en Microbiologia, Químico, doctorado en Química,
Universidad del Cauca.
Fernando Larmat
Químico, doctorado en Química, Universidad del Valle.
Grupo de investigación: Biotecnología vegetal
Universidad de San Bueanventura Cali
Resumen
En este trabajo se reporta la extracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa a
partir de la bacteria Oligotropha carboxidovorans, cepa OM 5. La bacteria creció de manera autótrofa en un
medio mineral, en una atmósfera saturada con monóxido de carbono, a 30 °C con agitación constante. Para
la obtención de los extractos enzimáticos crudos, los cultivos se sometieron a ruptura por sonicación,
solubilización con detergente no iónico y centrifugación con el fin de eliminar los restos celulares. En el
proceso de purificación, los extractos enzimáticos crudos se pasaron a través de una columna de exclusión
molecular y otra de intercambio iónico.
Palabras clave: Oligotropha carboxidovorans, extractos enzimáticos, Ecteolla celulosa, Purificación
Abstract
This paper reports the extraction and purification of the carbon monoxide dehydrogenase enzyme from
the Oligotropha carboxidovorans bacteria, OM 5 strain. The bacteria grew autotrophically in a mineral
medium, in carbon monoxide saturated atmosphere, at 30°C with constant agitation. In order to obtain the
crude enzymatic extracts, the crops underwent a breakdown by sonication, solvolysis with non-ionic
detergent and centrifugation to eliminate the cellular debris. During the purification process, the crude
enzymatic extracts were passed through a molecular exclusion column as well as through an ion-exchange
one.
Keywords: Oligotropha carboxidovorans, enzymatic extracts, Ecteola celullose, purification.
* Este informe hace parte de las investigaciones adelantadas en el grupo Biotecnología vegetal, registrado por Colciencias e
inscrito en el Centro de Investigaciones Bonaventuriana de la Universidad de San Buenaventura Cali.
Fecha de recepción: Septiembre de 2005.
Aceptación para su publicación: Noviembre de 2005.
Revista científica Guillermo de Ockham. Vol. 3, No. 2. Julio-Diciembre de 2005 • ISSN: 1794-192X 107Raúl A. Cuervo • Clara Hurtado • Enrique Bravo • Neyla Benítez • Walter Torres • Fernando Larmat
Introducción La bacteria Gram (-) Oligotropha carboxidovo-
rans (cepa OM 5), pertenece al grupo de bac-El monóxido de carbono (CO) es un gas con-
terias carboxidótrofas, que pueden usar eltaminante, venenoso, producido durante la
monóxido de carbono como única fuente decombustión incompleta de materiales orgáni-
carbono y energía mediante la inducción delcos (gas natural, petróleo, gasolina, carbón y
plásmido responsable de la expresión de lamateriales vegetales). El monóxido de carbo-
enzima monóxido de carbono deshidrogena-no inhibe la capacidad de la sangre para trans-
sa, la cual se encuentra ligada a membrana yportar oxígeno, siendo responsable de sínto-
posee la capacidad de oxidar el CO en solu-mas como resfrío, gripa, pasando por el dolor
ción acuosa.de cabeza, náuseas e incluso la muerte (DE-
En este trabajo se realizó la obtención y purifi-VLIN, 1993).
cación de la enzima monóxido de carbono
A nivel mundial hay una conciencia cada vez
deshidrogenasa, a partir de extractos celula-
mayor entre las autoridades competentes de
res de la bacteria Oligotropha carboxidovorans,
controlar los niveles de monóxido de carbono
cepa OM 5, esto con el objetivo de emplearlo
presentes en la atmósfera en el orden de par-
en el diseño de un biosensor amperométrico
tes por millón y partes por billón. Es por esto
para monóxido de carbono.
que hay un gran interés por el desarrollo de
biosensores; es decir, sensores basados en
principios de reconocimiento molecular inhe-
rente a muchas reacciones bioquímicas en la
Material y métodosque participan enzimas y anticuerpos capa-
ces de detectar concentraciones pequeñas – Organismos: Se utilizó la bacteria Oligotro-
de gas (CUNNINGHAM, et al, 1998). pha carboxidovorans, cepa OM 5, obteni-
Un sensor electroquímico enzimático es un da de la American Type Culture Collection
electrodo metálico cuya superficie contiene (ATCC No. 49405).
una enzima redox inmovilizada. Las enzimas – Medio de crecimiento: Para el crecimien-
pueden aislarse de sus fuentes (microorganis- to autotrófico de O. carboxidovorans se utili-
mos, tejidos vegetales o animales) y purificarse. zó el medio mineral ATCC No. 1789, que
contenía la siguiente composición (g/l deEn la literatura científica se encuentran nume-
agua destilada): Na HPO , 12 H O (9,0 g),rosos ejemplos de biosensores enzimáticos, 2 4 2
KH PO (1,5 g), NH Cl (1,5 g), MgSO .7generalmente para glucosa, utilizando la en- 2 4 4 4
H O (0,2 g), CaCl .2 H O (20 mg), citratozima glucosa oxidasa pura, obtenida a partir 2 2 2
férrico de amonio (1,2 mg), elementos tra-de extractos celulares de hongos como Asper-
zas (1 ml). El pH final fue de 6,8.gillus níger y Penicillium notatum, utilizando me-
diadores electrónicos como ferroceno, com- – Elementos trazas (mg/L de agua destila-
plejos de rutenio y quinonas (CALVO & da): ZnSO .7 H O (100 mg), MnCl . 4 H O4. 2 2 2
DANILOWICS, 1997). (30 mg), H BO (300 mg), CoCl . 6 H O3 3 2 2
108 Universidad de San Buenaventura, Cali-ColombiaExtracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa...
(200 mg), CuCl . 2 H O (10 mg), NiCl . 6 Un volumen final de 5 ml de la suspensión2 2 2
H O (20 mg), Na MoO . 2 H O (900 mg), celular tratada con lisozima fue sometida a so-2 2 4 2
nicación con las indicaciones mencionadasNa SeO (20 mg).2 3
anteriormente. La muestra fue colocada en hie-El crecimiento autotrófico fue realizado me-
lo mientras se sometía a sonicación, con eldiante la inoculación de Oligotropha carboxido-
objetivo de evitar su calentamiento. Los perío-vorans, OM 5, en el que la única fuente de
dos de sonicación fueron de dos minutos concarbono disponible para la bacteria provenía
un período de descanso de 30 segundos.del monóxido de carbono. La bacteria fue cre-
Este procedimiento se repitió cinco veces concida a partir del liofilizado original en 1 ml del
cada una de las muestras, completando unmedio de cultivo descrito anteriormente. A par-
tiempo total de sonicación de 10 minutos portir de esta muestra se realizaron cultivos su-
muestra.cesivos hasta obtener 200 ml de cultivo. El
recipiente con el medio de cultivo inoculado
Determinación de la concentración de
fue colocado en un desecador saturado con proteínas de los extractos celulares
monóxido de carbono, con agitación cons- La cuantificación de proteínas presentes en
tante a 30 ºC, durante 96 horas, tiempo nece- el extracto crudo obtenido a partir de la so-
sario para que las células alcanzaran la fase nicación fue realizado por el método espectro-
de crecimiento exponencial fotométrico de Schleif y Wensink (1981).
Medición de la actividad enzimática
de los extractos celulares
La actividad enzimática fue estimada espec-
Preparación de los
trofotométricamente mediante la reducción delextractos enzimáticos
azul de metileno en presencia de monóxido
La preparación de los extractos enzimáticos de carbono, a 30 ºC y 664 nm utilizando un
se realizó a partir de 200 ml del cultivo bac- equipo Shimadzu UV 160 A.
teriano crecido; al cual se le agregó lisozima
El ensayo de actividad enzimática fue realiza-
(2 ml por cada 25 ml de suspensión bacteria-
do de la siguiente manera: La mezcla de la
na), preparada en 0.89 g de NaCl y 100 ml de
reacción contenía 0.91 ml de buffer KH PO2 4
agua destilada.
(50 mM, pH 7), 0.05 ml de glucosa en buffer 2
Las bacterias con lisozima se colocaron en mM, 0.02 ml azul de metileno (0.25 mM), 0.01
un baño maría durante 12 horas a 40 ºC. Pos- ml de la mezcla de (1 U de glucosa oxidasa
teriormente, se completó el rompimiento ce- + 1 U de catalasa en buffer). La reacción fue
lular por sonicación en un equipo Branson iniciada con 200 mL del extracto enzimático,
Sonifier (VWR Company), con las siguientes con un contenido aproximado de 0.1 a 1.8
indicaciones: mg de proteína por ml.
Output control: 7, Duty Cycle: 60, Time: 10 Las mezclas de reacción, mantenidas en las
minutos. cubetas de 1 cm de diámetro, fueron cerra-
Revista científica Guillermo de Ockham. Vol. 3, No. 2. Julio-Diciembre de 2005 • ISSN: 1794-192X 109Raúl A. Cuervo • Clara Hurtado • Enrique Bravo • Neyla Benítez • Walter Torres • Fernando Larmat
das para evitar el escape del gas y el contac- El gel utilizado fue el Sephadex G-100, capaz
to de los reactantes con el oxígeno del aire y de separar proteínas que posean tamaños
posteriormente, burbujeadas durante 10 mi- entre 4.000 y 150.000. Un gramo de Sephadex
nutos con monóxido de carbono. Los ensa- G-100, fue solubilizado en 10 ml de alcohol
yos se realizaron en un tiempo total de 1.800 etílico al 10% y, posteriormente, colocado en
segundos, suficiente para que la reacción se una pipeta, obteniendo una columna de 1.3x
efectuara completamente. 10 cm de alto.
La columna de Sephadex fue lavada cuatro
Purificación de los extractos enzimáticos
crudos veces con buffer fosfato de sodio, 0.2 M, pH
7.0. Luego de lavada la columna se tapó y seEl extracto crudo fue sometido a los siguien-
dejó con el buffer durante tres días antes detes pasos de purificación:
usarla.
Solubilización con el detergente Tritón X-
100
Se tomaron 300 mL de las muestras, las cua-
Esta solubilización fue necesaria debido a que les se eluyeron separadamente en 18 ml del
la enzima estaba ligada a membrana y des- buffer fosfato de sodio, 0.2 M., pH 7, se colo-
pués de la sonicación y centrifugación la enzima caron en sendas columnas armadas a 4 ºC y
se precipitaba con los restos de celulares. a una presión atmosférica constante; se re-
La metodología utilizada consistió en agregar colectaron las fracciones en tubos de 1.5 ml
a cada 600 mL de extracto celular después a las cuales se les realizaron las pruebas de
de la sonicación, 200 mL de Tritón X-100; se actividad enzimática y concentración proteica.
homogenizó la solución. El detergente se dejó Sólo las fracciones que poseían actividad
actuar por una hora. Posteriormente, se reali- enzimática y mayor concentración de proteí-
zó una centrifugación a 10.000 rpm durante na fueron sometidas al siguiente paso de pu-
45 minutos en una centrífuga refrigerada. Se rificación con Ecteolla.
tomó el sobrenadante y el detergente rema-
Columna de Ecteolla celulosa
nente fue retirado mediante diálisis.
Se preparó un gradiente de diferentes concen-
Se midió la actividad enzimática en muestras
traciones de Ecteolla (30-80 % w/vol), una capa
que fueron solubilizadas con Tritón X-100 y
sobre la otra. La columna fue equilibrada con
muestras que no fueron solubilizadas con el
buffer fosfato 50 mM, pH 7. La elución fue rea-
detergente, con el objetivo de determinar qué
lizada con un gradiente lineal de KCl (0 a 1 M).
tan importante es este paso para el proceso
Un ml del extracto obtenido del paso anterior
de purificación de los extractos.
con Sephadex fue colocado en la capa su-
Columna de Sephadex G-100 perior de la columna y se fueron recolectando
La muestra solubilizada se pasó por una co- los resultados en fracciones de 1.5 ml. A to-
lumna de exclusión molecular (filtración por gel) das las fracciones recolectadas se les realiza-
preparada según el protocolo de Cooper & ron las pruebas de actividad enzimática y con-
Scopes (1982). centración de proteínas.
110 Universidad de San Buenaventura, Cali-ColombiaExtracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa...
Electroforesis en condiciones no mados a diferentes velocidades de barrido (5
desnaturalizantes -1- 500 mVs ) y entre el rango de -0.130 y -
En este trabajo se utilizó la electroforesis en 0.250 V. Para cada una de las mediciones
poliacrilamida en condiciones no desnaturali- electroquímicas la celda fue burbujeada con
zantes, donde no se usan SDS ni 2-mercapto- nitrógeno (N ) por 15 minutos para ser deoxi-2
etanol. Además, el voltaje usado en la corrida genada. Los experimentos para el sistema
electroforética es menor comparado al usado completo (azul de metileno + extracto enzimá-
en un gel de poliacrilamida en condiciones tico de CODH + CO) fueron realizados en
desnaturalizantes. buffer a pH 7.00, condición apropiada para la
CODH, y en medio aeróbico, anaeróbico yEl protocolo usado para la corrida electrofo-
diferentes concentraciones de sustrato (CO).rética fue descrito por Ausubel et. al. (1989),
En solución acuosa se usaron diferentes con-con modificaciones propias del laboratorio.
centraciones del mediador electrónico, al igual
Electroquímica
que cantidades variables de este, del extrac-
Para las mediciones electroquímicas se utili-
to enzimático y del sustrato, con el fin de deter-
zó un Potencistato/Galvanostato EG&G 273
minar el efecto del sustrato y/o el extracto enzi-
con software incorporado EG&G modelo 352/
mático en la electroquímica del mediador.
TM252 SoftCorr II y una celda cilíndrica de 5 ml
de volumen, con desprendimientos laterales
para la inyección de los gases con una tapa
de teflón diseñada para montar los tres elec-
Resultadostrodos que conforman el sistema de trabajo.
Como electrodo de trabajo fue utilizado un mi-
Extracción y purificación enzimáticacroelectrodo de platino de 100 mm, como
Extractos enzimáticoselectrodo de referencia fue usado un electro-
El rompimiento celular de las muestras someti-do de plata/cloruro de plata y una barra de
das a sonicación fue verificado mediante mi-acero sirvió como electrodo auxiliar. El micro-
croscopía óptica, observándose diferenciaselectrodo de platino fue pulido con una pasta
significativas en las muestras tratadas, indican-alúmina-agua (tamaño de partícula 0.3 mm)
do que la eficiencia en el rompimiento de laspara remover las impurezas de la superficie
células no era el mismo en todos los casos.electródica antes de realizar los experimen-
tos. La voltametría cíclica fue la técnica em-
Cuantificación de la concentración de
pleada en las mediciones. proteínas de los extractos enzimáticos
La caracterización de la electroquímica rever- La concentración de proteínas de los extrac-
sible del aceptor electrónico azul de metileno, tos varió dependiendo de la cantidad de célu-
0.25 - 5 mM, (preparado en buffer KH PO – las lisadas; aunque el procedimiento era el2 4
NaOH 50 mM) en pH ácido, básico y neutro mismo en cada sonicación, el número de bac-
fue establecida mediante voltamogramas to- terias rotas determinado por un conteo de cé-
Revista científica Guillermo de Ockham. Vol. 3, No. 2. Julio-Diciembre de 2005 • ISSN: 1794-192X 111Raúl A. Cuervo • Clara Hurtado • Enrique Bravo • Neyla Benítez • Walter Torres • Fernando Larmat
Figura 1lulas antes y después de la sonicación varia-
M 1 2 3 4 5ba, lográndose concentraciones proteicas
270
desde 1.21 mg/ml hasta 23.4 mg/ml.
Actividad enzimáticaActividad enzimáticaActividad enzimáticaActividad enzimáticaActividad enzimática 250
Se midieron las actividades enzimáticas ini-
230
ciales de cuatro muestras (M1, M2, M3 y M4) 170
con las que se continuó el proceso de purifica-
ción, teniendo en cuenta que estos extractos
fueran los de mayor concentración de proteí-
150
na y que mostraban buena actividad catalítica.
En adelante solo se hará referencia a la mues-
tra (M2) que presentó mayor actividad enzimá- 120
tica específica (36 microU/mg) y una concen-
Gel de electroforesis en condiciones no
desnaturalizantes con muestras en los diferentestración de 5,148 mg/ml.
pasos de purificación (M: Marcador de peso
molecular, 1: Muestra extracto crudo, 2 y 3:
Purificación del extracto enzimático muestra después de pasar por Sephadex, 4 y 5:
crudo muestra después de pasar por Ecteolla).
La muestra anteriormente mencionada se pa- el extracto crudo, mientras que en los pozos
só por una columna de Sephadex g-100, em- cuatro y cinco se observa una sola banda
pleándose para ello 120 ml del buffer de elu- correspondiente a la enzima purificada.
ción, los cuales fueron recolectados en 12
Los resultados muestran que utilizando suce-
fracciones de 1 ml cada una, después de la
sivamente las columnas de Sephadex G-100
fracción número 12 no se observaba activi-
y Ecteolla celulosa, se lograron grados de
dad enzimática, ni proteína.
purificación que oscilaron entre 2 a 100 veces
con Sephadex y 6,7 a 200 veces con EcteollaSe agruparon las fracciones que contenían
celulosa, para el caso específico de M2, seactividad enzimática y concentración de pro-
lograron grados de purificación tres veces conteínas en una sola fracción y se tomaron 300
Sephadex y 25 veces con Ecteolla celulosaml colocándola en el extremo superior de sen-
(Figura 2).da columna de Ecteolla celulosa. Al final de la
cromatografía se obtuvieron seis fracciones de De otro lado, se determinó si el proceso de
1 ml. La depuración de proteínas a través de solubilización proteica por medio del Tritón X-
los pasos de purificación se puede observar 100 estaba influyendo sobre la purificación de
en la Figura 1. la proteína, de ahí que para M2 se obtuvo una
actividad enzimática específica de 30 microU/Se puede observar como va disminuyendo el
mg antes de Tritón X-100 y 110 microU/mgnúmero de bandas a medida que aumentan
después del Tritón X-100.los pasos de purificación. En el pozo uno se
observan cinco bandas definidas correspon- Es importante indicar que si cambiaba la se-
dientes a las diversas proteínas presentes en cuencia de purificación, pasando el extracto
112 Universidad de San Buenaventura, Cali-ColombiaExtracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa...
Figura 2
M2
Comparación entre la concentración de proteínas y la actividad enzimática
específica de la muestra M2 a través de los pasos de purificación.
enzimático primero por la columna de Ecteolla corriente anódica sobre la voltametría del azul
celulosa y luego por la de Sephadex G-100, de metileno, mientras la corriente catódica
la actividad enzimática del extracto se perdía. permanece estable. La Figura 3 muestra la
diferencia entre el voltamograma para el azul
Estudios electroquímicos de metileno (¾) y con la adición del sustrato
Voltametría cíclica CO al sistema en la presencia del mediador y
Los experimentos de voltametría cíclica no CODH, dando como resultado un aumento
mostraron indicios de electroactividad directa en la corriente anódica (—).
del monóxido de carbono deshidrogenasa.
El CO tiene un efecto en la disminución de la
Figura 3

100
Discusión de resultados
80
60
40 Extracción y purificación enzimática
20
El grado de ruptura celular fue aproximada-
0
mente del 85%, determinado por medio de
-20
conteos celulares antes y después de la-40
-60 sonicación. El método de ruptura recomen-
-80 dado es la prensa francesa, usado por Meyer-0,26 -0,24 -0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12
POTENCIAL (V) vs Ag/AgCl & Schlegel (1979), el cual tiene la ventaja de
Voltamograma cíclico de azul de metileno (2.5
mM) en buffer fosfato 50 mM, pH 7, saturado con hacer estallar las células de forma uniforme,
nitrógeno, saturado con CO: (¾) solo; (—) con la
logrando mayor efectividad en la ruptura.adición de 0.36 ml de extracto enzimático.
Revista científica Guillermo de Ockham. Vol. 3, No. 2. Julio-Diciembre de 2005 • ISSN: 1794-192X 113
CORRIENTE (nA)
Raúl A. Cuervo • Clara Hurtado • Enrique Bravo • Neyla Benítez • Walter Torres • Fernando Larmat
El decrecimiento de la absorbencia del azul centrifugación a 5.000 rpm, con el único ob-
de metileno es una medida indirecta de la oxi- jetivo de precipitar los restos celulares. Ade-
dación del monóxido de carbono. La absor- más, fue necesario el tratamiento de las mues-
bancia disminuye a medida que transcurre el tras con Tritón X-100 para separar la enzima
tiempo de reacción y el color de la mezcla de de los restos celulares. Meyer y Schlegel par-
reacción cambia desde un color azul (estado tieron de un cultivo de 10 litros en un fermen-
oxidado del azul de metileno) hasta incoloro tador, mientras que en nuestro trabajo se par-
te de un cultivo de sólo 200 ml, debido a la(estado reducido del azul de metileno). La
actividad de oxidación del monóxido de car- imposibilidad de utilizar tales cantidades de
bono del extracto crudo fue baja en compa- medio de cultivo.
ración a las reportadas por Meyer & Schlegel
La actividad inicial de la enzima medida en
(1979); sin embargo, se logró un aumento
los extractos crudos, tuvo una amplia varia-
importante en la actividad enzimática especí-
ción, esto puede deberse al método de soni-
fica de los extractos después de los procedi-
cación empleado para el rompimiento celular.
mientos de purificación proteica.
Aunque el número de células sometidas al
Los resultados mostraron que la actividad es- procedimiento fue aproximadamente el mis-
pecífica de la proteína aumentó con los pa- mo en cada caso y el protocolo usado fue el
sos de purificación, al mismo tiempo que se mismo, se observó que al final de la sonicación
notó una reducción en la concentración de el número de células rotas varió ampliamen-
proteínas. La mayor tasa de purificación logra- te. A partir de gel de poliacrilamida se puede
da fue de 200 veces. Estos resultados tienen comprobar que los pozos 4 y 5 (muestra des-
diferencias con los trabajos reportados por pués de pasar por Ecteolla) sólo presentan
Meyer y Schlegel (1980), donde se realizaron una banda visible, la cual tiene un peso
más pasos de purificación: ultracentrifugación molecular aproximado a 230.000, correspon-
del sobrenadante inmediatamente después diente al de la enzima monóxido de carbono
de rotas las células, seguido por una cromato- deshidrogenasa.
grafía en gradiente de densidad de sacarosa,
En el pozo 1 se presentan varias bandas, de
diálisis para eliminar los restos de sacarosa,
las cuales se observan dos grandes y visi-
concentración con Sephadex G-25, cromato-
bles, una a 270.000 y otra a 230.000. Este gel
grafía de Ecteolla celulosa, diálisis y, finalmen-
muestra cómo disminuye el número de ban-
te, gradiente de densidad de sacarosa. To-
das a medida que aumentan los pasos de
dos estos pasos les permitieron a estos
purificación, logrando una buena purificación
investigadores obtener una purificación de
enzimática.
35.5 veces con una actividad enzimática espe-
cífica de 1.9 mg/unidades. En nuestro traba- Aunque a partir del gel de poliacrilamida se
jo, el extracto enzimático obtenido de la puede decir que los pasos de purificación fue-
ultracentrifugación no tenía actividad enzimáti- ron eficientes para lograr la remoción de pro-
ca, por lo que este paso fue reemplazado por teínas diferentes a la enzima de interés, se re-
114 Universidad de San Buenaventura, Cali-ColombiaExtracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa...
Figura 4
+Oxidación electroquímica de monóxido de carbono con el uso de azul de metileno (AM ) como un
mediador electrónico, CODH (red.) y CODH (ox.).
comienda utilizar una columna de Sephadex La Figura 3 muestra la prueba realizada con el
G-120, de esta forma sería más eficiente el sistema completo, variando la cantidad de
proceso de purificación, debido a que el ta- extracto enzimático adicionado a la celda
maño de las partículas que conforman este electroquímica. La adición del sustrato al me-
gel es mayor, aumentando el rango de sepa- dio de reacción en presencia del extracto
ración. enzimático y el mediador mostró un aumento
en la corriente anódica, que comprueba el in-Las pruebas electroquímicas se fundamen-
tercambio de electrones entre el CO y el azultan en la oxidación de CO por la enzima
de metileno, mediado por el extracto enzimá-CODH, el sustrato reducido, CO, dona un par
tico. La diferencia en el aumento de la corrientede electrones a la enzima; estos seguidamen-
anódica entre las dos pruebas es mínima (»15te son aceptados por el sustrato oxidado azul
nA) lo que muestra que independiente de lade metileno (AM ), el cual es, por lo tanto,ox
cantidad de extracto adicionado, se necesitareducido, como lo indica la siguiente ecua-
tener suficiente cantidad de enzima activa pre-ción:
sente en el mismo para que se lleve a cabo,
CODH
de manera efectiva, la catálisis enzimática que
+ CO + H O + AM CO + 2H + AM2 ox 2 red
permita un notable aumento en la corriente
Y , finalmente, reoxidado sobre la superficie del
anódica del mediador electrónico una vez este
electrodo de platino. La Figura 4 muestra el
es reoxidado en la superficie electródica.
esquema de la reacción:
El acoplamiento de la enzima CODH con el
azul de metileno y la superficie electródica
permite explorar en el diseño de un biosensor
Conclusiones
para CO, en el cual el mediador participa fácil-
mente en la reacción redox con el componen- – Se logró la purificación de la enzima monó-
te biológico ayudando en la rápida transferen- xido de carbono deshidrogenasa a partir
cia electrónica y haciendo el sistema menos de extractos celulares procedentes de la
susceptible a sustancias interferentes debido bacteria Oligotropha carboxidovorans,
a los potenciales más bajos de electrodo. cepa OM 5.
Revista científica Guillermo de Ockham. Vol. 3, No. 2. Julio-Diciembre de 2005 • ISSN: 1794-192X 115Raúl A. Cuervo • Clara Hurtado • Enrique Bravo • Neyla Benítez • Walter Torres • Fernando Larmat
– La actividad enzimática aumentó a medi- diado en el intercambio de electrones en-
da que aumentaron los pasos de purifica- tre el monóxido de carbono y el azul de
ción, esta actividad fue directamente pro- metileno en solución acuosa, lo que per-
porcional a la cantidad de proteína obteni- mite la detección del sustrato.
da después de la sonicación. Para lograr
una buena purificación proteica se debe
optimizar el proceso de rompimiento celu-
Bibliografíalar, utilizando, por ejemplo, una prensa fran-
cesa. – AUSUBEL, F. M., et. al. Short Protocols in Molecular
Biology. New York: Wiley. (1989).
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Reverté.
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116 Universidad de San Buenaventura, Cali-Colombia