Extracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa a partir de la bacteria carboxidótrofaOligotropha carboxidovorans*Extraction and purification of the enzyme carbon monoxide dehydrogenase from the carboxidotrophic bacteria Oligotropha carboxidovorans, OM 5 strain

Raúl

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Resumen
En este trabajo se reporta la extracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa a partir de la bacteria Oligotropha carboxidovorans, cepa OM 5. La bacteria creció de manera autótrofa en un medio mineral, en una atmósfera saturada con monóxido de carbono, a 30 °C con agitación constante. Para la obtención de los extractos enzimáticos crudos, los cultivos se sometieron a ruptura por sonicación, solubilización con detergente no iónico y centrifugación con el fin de eliminar los restos celulares. En el proceso de purificación, los extractos enzimáticos crudos se pasaron a través de una columna de exclusión molecular y otra de intercambio iónico.
Abstract
This paper reports the extraction and purification of the carbon monoxide dehydrogenase enzyme from the Oligotropha carboxidovorans bacteria, OM 5 strain. The bacteria grew autotrophically in a mineral medium, in carbon monoxide saturated atmosphere, at 30°C with constant agitation. In order to obtain the crude enzymatic extracts, the crops underwent a breakdown by sonication, solvolysis with non-ionic detergent and centrifugation to eliminate the cellular debris. During the purification process, the crude enzymatic extracts were passed through a molecular exclusion column as well as through an ion-exchange one.

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• Publié le: 01 janvier 2005
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Extracción y purificación de la enzima
monóxido de carbono deshidrogenasa
a partir de la bacteria carboxidótrofa
*Oligotropha carboxidovorans
Extraction and purification of the enzyme carbon monoxide
dehydrogenase from the carboxidotrophic bacteria Oligotropha
carboxidovorans, OM 5 strain
Raúl A. Cuervo
Bióloga. Profesor Tiempo Completo de la USB
Clara Hurtado Enrique Bravo
Química, magíster en Química, Bioquímico, magíster en Ciencias,
Universidad del Valle. Universidad del Valle.
Neyla Benítez Walter Torres
Bióloga, magíster en Microbiologia, Químico, doctorado en Química,
Universidad del Cauca.
Fernando Larmat
Químico, doctorado en Química, Universidad del Valle.
Grupo de investigación: Biotecnología vegetal
Universidad de San Bueanventura Cali
Resumen
En este trabajo se reporta la extracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa a
partir de la bacteria Oligotropha carboxidovorans, cepa OM 5. La bacteria creció de manera autótrofa en un
medio mineral, en una atmósfera saturada con monóxido de carbono, a 30 °C con agitación constante. Para
la obtención de los extractos enzimáticos crudos, los cultivos se sometieron a ruptura por sonicación,
solubilización con detergente no iónico y centrifugación con el fin de eliminar los restos celulares. En el
proceso de purificación, los extractos enzimáticos crudos se pasaron a través de una columna de exclusión
molecular y otra de intercambio iónico.
Palabras clave: Oligotropha carboxidovorans, extractos enzimáticos, Ecteolla celulosa, Purificación
Abstract
This paper reports the extraction and purification of the carbon monoxide dehydrogenase enzyme from
the Oligotropha carboxidovorans bacteria, OM 5 strain. The bacteria grew autotrophically in a mineral
medium, in carbon monoxide saturated atmosphere, at 30°C with constant agitation. In order to obtain the
crude enzymatic extracts, the crops underwent a breakdown by sonication, solvolysis with non-ionic
detergent and centrifugation to eliminate the cellular debris. During the purification process, the crude
enzymatic extracts were passed through a molecular exclusion column as well as through an ion-exchange
one.
Keywords: Oligotropha carboxidovorans, enzymatic extracts, Ecteola celullose, purification.
* Este informe hace parte de las investigaciones adelantadas en el grupo Biotecnología vegetal, registrado por Colciencias e
inscrito en el Centro de Investigaciones Bonaventuriana de la Universidad de San Buenaventura Cali.
Fecha de recepción: Septiembre de 2005.
Aceptación para su publicación: Noviembre de 2005.
Revista científica Guillermo de Ockham. Vol. 3, No. 2. Julio-Diciembre de 2005 • ISSN: 1794-192X 107Raúl A. Cuervo • Clara Hurtado • Enrique Bravo • Neyla Benítez • Walter Torres • Fernando Larmat
Introducción La bacteria Gram (-) Oligotropha carboxidovo-
rans (cepa OM 5), pertenece al grupo de bac-El monóxido de carbono (CO) es un gas con-
terias carboxidótrofas, que pueden usar eltaminante, venenoso, producido durante la
monóxido de carbono como única fuente decombustión incompleta de materiales orgáni-
carbono y energía mediante la inducción delcos (gas natural, petróleo, gasolina, carbón y
plásmido responsable de la expresión de lamateriales vegetales). El monóxido de carbo-
enzima monóxido de carbono deshidrogena-no inhibe la capacidad de la sangre para trans-
sa, la cual se encuentra ligada a membrana yportar oxígeno, siendo responsable de sínto-
posee la capacidad de oxidar el CO en solu-mas como resfrío, gripa, pasando por el dolor
ción acuosa.de cabeza, náuseas e incluso la muerte (DE-
En este trabajo se realizó la obtención y purifi-VLIN, 1993).
cación de la enzima monóxido de carbono
A nivel mundial hay una conciencia cada vez
deshidrogenasa, a partir de extractos celula-
mayor entre las autoridades competentes de
res de la bacteria Oligotropha carboxidovorans,
controlar los niveles de monóxido de carbono
cepa OM 5, esto con el objetivo de emplearlo
presentes en la atmósfera en el orden de par-
en el diseño de un biosensor amperométrico
tes por millón y partes por billón. Es por esto
para monóxido de carbono.
que hay un gran interés por el desarrollo de
biosensores; es decir, sensores basados en
principios de reconocimiento molecular inhe-
rente a muchas reacciones bioquímicas en la
Material y métodosque participan enzimas y anticuerpos capa-
ces de detectar concentraciones pequeñas – Organismos: Se utilizó la bacteria Oligotro-
de gas (CUNNINGHAM, et al, 1998). pha carboxidovorans, cepa OM 5, obteni-
Un sensor electroquímico enzimático es un da de la American Type Culture Collection
electrodo metálico cuya superficie contiene (ATCC No. 49405).
una enzima redox inmovilizada. Las enzimas – Medio de crecimiento: Para el crecimien-
pueden aislarse de sus fuentes (microorganis- to autotrófico de O. carboxidovorans se utili-
mos, tejidos vegetales o animales) y purificarse. zó el medio mineral ATCC No. 1789, que
contenía la siguiente composición (g/l deEn la literatura científica se encuentran nume-
agua destilada): Na HPO , 12 H O (9,0 g),rosos ejemplos de biosensores enzimáticos, 2 4 2
KH PO (1,5 g), NH Cl (1,5 g), MgSO .7generalmente para glucosa, utilizando la en- 2 4 4 4
H O (0,2 g), CaCl .2 H O (20 mg), citratozima glucosa oxidasa pura, obtenida a partir 2 2 2
férrico de amonio (1,2 mg), elementos tra-de extractos celulares de hongos como Asper-
zas (1 ml). El pH final fue de 6,8.gillus níger y Penicillium notatum, utilizando me-
diadores electrónicos como ferroceno, com- – Elementos trazas (mg/L de agua destila-
plejos de rutenio y quinonas (CALVO & da): ZnSO .7 H O (100 mg), MnCl . 4 H O4. 2 2 2
DANILOWICS, 1997). (30 mg), H BO (300 mg), CoCl . 6 H O3 3 2 2
108 Universidad de San Buenaventura, Cali-ColombiaExtracción y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa...
(200 mg), CuCl . 2 H O (10 mg), NiCl . 6 Un volumen final de 5 ml de la suspensión2 2 2
H O (20 mg), Na MoO . 2 H O (900 mg), celular tratada con lisozima fue sometida a so-2 2 4 2
nicación con las indicaciones mencionadasNa SeO (20 mg).2 3
anteriormente. La muestra fue colocada en hie-El crecimiento autotrófico fue realizado me-
lo mientras se sometía a sonicación, con eldiante la inoculación de Oligotropha carboxido-
objetivo de evitar su calentamiento. Los perío-vorans, OM 5, en el que la única fuente de
dos de sonicación fueron de dos minutos concarbono disponible para la bacteria provenía
un período de descanso de 30 segundos.del monóxido de carbono. La bacteria fue cre-
Este procedimiento se repitió cinco veces concida a partir del liofilizado original en 1 ml del
cada una de las muestras, completando unmedio de cultivo descrito anteriormente. A par-
tiempo total de sonicación de 10 minutos portir de esta muestra se realizaron cultivos su-
muestra.cesivos hasta obtener 200 ml de cultivo. El
recipiente con el medio de cultivo inoculado
Determinación de la concentración de
fue colocado en un desecador saturado con proteínas de los extractos celulares
monóxido de carbono, con agitación cons- La cuantificación de proteínas presentes en
tante a 30 ºC, durante 96 horas, tiempo nece- el extracto crudo obtenido a partir de la so-
sario para que las células alcanzaran la fase nicación fue realizado por el método espectro-
de crecimiento exponencial fotométrico de Schleif y Wensink (1981).
Medición de la actividad enzimática
de los extractos celulares
La actividad enzimática fue estimada espec-
Preparación de los
trofotométricamente mediante la reducción delextractos enzimáticos
azul de metileno en presencia de monóxido
La preparación de los extractos enzimáticos de carbono, a 30 ºC y 664 nm utilizando un
se realizó a partir de 200 ml del cultivo bac- equipo Shimadzu UV 160 A.
teriano crecido; al cual se le agregó lisozima
El ensayo de actividad enzimática fue realiza-
(2 ml por cada 25 ml de suspensión bacteria-
do de la siguiente manera: La mezcla de la
na), preparada en 0.89 g de NaCl y 100 ml de
reacción contenía 0.91 ml de buffer KH PO2 4
agua destilada.
(50 mM, pH 7), 0.05 ml de glucosa en buffer 2
Las bacterias con lisozima se colocaron en mM, 0.02 ml azul de metileno (0.25 mM), 0.01
un baño maría durante 12 horas a 40 ºC. Pos- ml de la mezcla de (1 U de glucosa oxidasa
teriormente, se completó el rompimiento ce- + 1 U de catalasa en buffer). La reacción fue
lular por sonicación en un equipo Branson iniciada con 200 mL del extracto enzimático,
Sonifier (VWR Company), con las siguientes con un contenido aproximado de 0.1 a 1.8
indicaciones: mg de proteína por ml.