Réacteur enzymatiques à membranes
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Etude et optimisation d'un réacteur enzymatique à membrane

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Publié le 15 septembre 2012
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Langue Français

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Habibou S. Etude et optimisation d’un REM pour la synthèse des composés aromatiques -Mars à juillet 2010






Au terme de ce modeste travail, je présente mes sincères et vifs remerciements à ma tutrice de
stage Mme PAOLUCCI Delphine-Jeanjean, maître de conférence à L’ENSCM, qui m’à initié
à la recherche; qu’elle trouve à travers ces phrases l’expression de mes humbles et profondes
gratitudes et reconnaissances, non seulement pour son encadrement et pour toute la confiance
qu’elle m’à accordée, mais aussi pour sa disponibilité, sa patience et sa rigueur qui m’ont été
d’un bénéfice vraiment inestimable.

Mes remerciements vont également à Mme Marie pierre BELLEVILLE, maître de conférence
à l’université de Montpellier II et co-encadrante de ce travail, pour son implication, ses directives,
son assistance et ses précieux conseils clairement affichées lors de ce stage

Je tiens aussi à remercier la doctorante Sawsen Ben Ameur pour ses orientations et conseils sans
oublier d’exprimer toute ma sympathie à l’ensemble du personnel de l’IEM, plus particulièrement
l’équipe GPM avec qui j’ai partagé beaucoup de choses.










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Habibou S. Etude et optimisation d’un REM pour la synthèse des composés aromatiques -Mars à juillet 2010



I-INTRODUCTION………………………………………………………………………………3
II-PRESENTATION DE LA STRUCTURE D’ACCUEIL……………………………………4
III-ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE :…………………………………………………………….5
III.1-Les réacteurs enzymatiques:.…………………………………………...……………….........5
III.1.1-les réacteurs fermés :..……………………………………………………………………...5
III.1.2-les réacteurs continus :……………………..5
III.1.2.1-Les réacteurs lit fixe/lit fluidisé :…...…………………………………………………….5
III.1.2.2-Les réacteurs à membranes (REM) :…. ………………………………………………....6
III.1.2.2.1-Les réacteurs enzymatiques à membrane à enzymes libres (REMEL) :…….………....6
III.1.2.2.2-Les réacteurs enzymatiques à membranes « actives » (REMA) :…... …………….......6
Elaboration des Membranes actives……………………………………………………………….6
a- Méthodes classiques d’immobilisation sur supports conventionnels :……………………..…...6
b- L’immobilisation sur membrane :.…...………………………...………………………..……...8
III.2-Généralité sur les lipases :….………………………………………………………………...8
IV-MATERIELS ET METHODES :…………………………………………………………..10
IV.1-
Matériels :.....…………………………………………………………….………………......10
IV.1.1-
Enzymes :..…………………………………………………….…………………………...10
IV.1.2-Solutions chimiques et solvants :..………………………………………………..….….10
IV.1.3-Membranes :.……………………………………………………………………………...10
IV.1.4-Pilote pour le lavage et l’immobilisation :.……………………………………………....11
IV.1.5-Pilote pour l’étude de l’activité des membranes en Hydrolyse :……………………….....12
IV.2-Méthodes :..……………………………………………………………………………….13
IV.2.1-Protocole d’élaboration des membranes « actives »:
...………………………………….13
IV.2.2-Détermination de la quantité d’enzymes
immobilisées :….…..………………………..…14
IV.2.3-caractérisation des membranes actives : Réaction d’hydrolyse………………………….15
IVIV.2.4-régénération des supports céramiques…………………………………….………...15
V-RESULTATS ET DISCUSSION…………………………………………………………..16
V.1-Détermination de l’activité immobilisée des lipases au niveau des membranes :..……….…18
V.2-Etude de l’activité de nos membranes actives en hydrolyse :…..…….……………………..19
V.2.1.1-Evolution de l’activité membranaire en fonction de l’activité initiale :…...…………….19
V.2.2-Evolution de l’activité membranaire en fonction de l’activité immobilisée……………....20
CONCLUSION ET PERSPECTIVES………………………………….…………………....21
Références Bibliographiques………..…………………………………………………….……22
Annexes………………………………………….……………………………………………….23
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Habibou S. Etude et optimisation d’un REM pour la synthèse des composés aromatiques -Mars à juillet 2010





I INTRODUCTION

Durant ces dernières décennies, l’emploi des biocatalyseurs lors de synthèse de composés
organiques s’est considérablement développé, tant au niveau académique qu’industriel.
En effet les procédés biocatalysés sont une alternative attrayante aux méthodes chimiques car ils
présentent les avantages d’être moins polluants, d’avoir une meilleure connotation pour les
consommateurs et d’être plus spécifiques.
Dans ce contexte, un projet ANR appelé ENZYPRO a démarré en Décembre 2008 avec une thèse
de doctorat. Ce projet implique un laboratoire universitaire, l’Institut Européen des Membranes,
spécialiste des matériaux et procédés membranaires et notamment des réacteurs enzymatiques à
membranes et deux industriels : un concepteur et fabricant d’équipements fonctionnant en milieu
supercritique et un fabricant mondialement reconnu d’arômes et de parfums.
L’objectif de ce projet est de trouver un nouveau procédé durable permettant de remplacer la
méthode actuelle de synthèse des esters aromatiques (synthèse chimique).
Le procédé alternatif proposé est un réacteur enzymatique à membrane (REM). Le catalyseur
chimique est remplacé par des enzymes qui sont immobilisées à la surface d’une membrane
céramique. La réaction a donc lieu lorsque les substrats traversent la membrane au sein d’un
REM fonctionnant en continu.
Par ailleurs, le CO2 supercritique sera choisi comme solvant en remplacement des solvants
organiques classiques de façon à protéger l’environnement et à simplifier les étapes de séparation
produit/solvant.
Ainsi le présent stage devant se dérouler sur la période du 8 mars au 31 juillet 2010(05 mois) se
situe dans ce cadre ; Le travail expérimental relatif à ce stage comprend principalement :
 La fabrication des membranes (étanchage, lavage et immobilisation des enzymes)
 Le dosage de l’activité enzymatique (quantité d’enzyme immobilisée) et de l’activité
hydrolytique (activité enzymatique de la membrane fabriquée).
 L’étude de la réaction modèle (réaction de synthèse)
 L’étude du diamètre des pores
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 L’étude de l’effet du conditionnement
 L’étude comparative de la réaction en substrat purs et en présence de solvants.
 etc…

II PRESENTATION DE LA STRUCTURE D’ACCUEIL

L’Institut Européen des Membranes est une Unité mixte de Recherche (UMR 5635) du CNRS
dont l’organisme principal de rattachement est l’Ecole de Chimie de Montpellier et l’organisme
secondaire est L’Université Montpellier 2. Il est l’un des quatre Instituts du Pôle Chimie
Montpelliérain.
Les thèmes de recherches au sein de l’institut concernent entres autres :
 la séparation et le traitement des gaz
 les systèmes a haut rendement et/ou sélectivité en milieu liquide
 les membranes à conduction ionique
 la miniaturisation des systèmes membranaires
 les matériaux combinatoires dynamiques adaptatifs
Par contre il existe six principales équipes de recherches :
 Transport Ionique et Électroséparations
 Nano systèmes Supramoléculaires Adaptatifs
 Membranes Céramiques et Hybrides par voies Sol-Gel et Plasma
 Matériaux Avancés pour l’Analyse et la Séparation
 Interfaces et Membranes Bio inspirées
 Génie des Procédés Membranaires
Le présent stage s’est déroulé au sein de cette dernière équipe (génie des procédés membranaires)
dont les axes de recherches et les compétences associées sont :
 la séparation de gaz et réacteurs catalytiques membranaires ,
 contacteurs membranaires,
 réacteurs enzymatiques à membrane (en milieu conventionnel ou CO2 supercritique),
procédés membranaires pour la séparation affine,
 conception, optimisation et modélisation des procédés membranaires,
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 génie de l’élaboration de membranes céramiques fonctionnalisées (membranes
enzymatiques, membranes catalytiques, membranes de chromatographie)


III ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE :
III.1 Les réacteurs enzymatiques:
Ces dernières années, l’emploi de biocatalyseurs lors de synthèse organique est devenu un
procédé alternatif attractif face aux méthodes chimiques. En effet, les enzymes affichent aux
cours des réactions, de grandes régio-, chimio-, et énantiosélectivité ; de plus les réactions
catalysées par les enzymes peuvent être mises en œuvre sous des conditions opératoires douces,
telles qu’une température de travail quasi-ambiante, un pH pratiquement neutre, une pression
atmosphérique. La gamme de températures modérées de fonctionnement des enzymes (20-40°c)
réduit au minimum les réactions secondaires peu désirées, telles que le réarrangement (Loughlin,
2000).
Ces réactions enzymatiques sont menées soit dans des réacteurs fermés où le substrat et l’enzyme
sont initialement mélangés et où la réaction se déroule sans aucun apport ni soutirage, soit en
réacteurs continus avec un renouvellement du mélange et une élimination du produit formé.
III.1.1 les réacteurs fermés :
Généralement, les réactions enzymatiques sont conduites en réacteur fermé dont le principal
intérêt réside dans la simplicité de la mise en œuvre du procédé. Il suffit de mettre les enzymes
en contact avec le substrat dans une cuve agitée et de contrôler le pH et la température.
Ce type de réacteur présente cependant plusieurs inconvénients (Cheryan et Mehaia, 1986 ;
Prazeres et Cabral, 1994) : Variation des résultats, coût élevé des catalyseurs et de
l’investissement, etc…
III.1.2 les réacteurs continus :
III.1.2.1 Les réacteurs lit fixe/lit fluidisé :
Les réacteurs à lit fixe sont utilisés pour la mise en œuvre des réactions à l’échelle industrielle
principalement en raison de leur efficacité, leur faible coût et de la simplicité de leur conception.
La réaction à lieu en continue ce qui permet un meilleur contrôle du procédé, une productivité
plus élevée et l’obtention de produits plus homogènes (villermaux, 1993).
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Les réacteurs à lit fluidisé sont souvent préférés aux lits fixes car les phénomènes de colmatage et
de perte de charges à la traversée du réacteur, ou d’inhibition du catalyseur sont réduits (Bodalo
et al., 1995).


III.1.2.2 Les réacteurs à membranes (REM) :
Les réacteurs enzymatiques à membrane présentent, comme les réacteurs à lit fixe ou fluidisé, les
avantages des procédés continus. Schématiquement on peut classer les REM en deux groupes
selon le rôle joué par la membrane. En effet si la membrane est utilisée comme simple barrière
permettant la rétention des enzymes, il est alors possible de travailler avec des enzymes libres :
on parlera alors de réacteur enzymatique à membrane à enzymes libre (REMEL). Si au contraire
les enzymes sont confinées par un moyen approprié au niveau de la membrane, on parlera de
réacteur enzymatique à membrane « active » (REMA).
III.1.2.2.1 Les réacteurs enzymatiques à membrane à enzymes libres (REMEL) :
Ce type de réacteur consiste tout simplement en l’association d’un réacteur agité et d’une unité de
filtration. Le diamètre des pores de la membrane est choisi de telle sorte que cette dernière
permette la rétention totale des enzymes tout en laissant passer les produits de la réaction sous
l’effet d’un gradient de pression.
L’utilisation de membranes polymères tubulaires permet à la fois d’augmenter le rapport
surface/volume et de limiter le colmatage du fait de la contrainte de cisaillement crée par la
circulation tangentielle (Carrère et René, 1996), contrairement aux membranes organiques planes
fonctionnant en mode frontal (Butterworth et al., 1970).
III.1.2.2.2 Les réacteurs enzymatiques à membranes « actives » (REMA) :
 Elaboration des membranes actives :
Il existe différents moyens de préparer des membranes « actives » :
a. Méthodes classiques d’immobilisation sur supports conventionnels :
D’après Smiley et Stransdberg (1972), il existe 4 principales méthodes d’immobilisation :
l’immobilisation par insolubilisation, l’immobilisation par inclusion, l’immobilisation par
adsorption et enfin, l’immobilisation par liaisons covalentes.
 L’immobilisation par insolubilisation :
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Cette méthode d’immobilisation met en jeu des agrégats d’enzymes, et non pas un support. En
effet, les enzymes sont rendues insolubles par agrégation réalisée à l’aide d’agents réticulant
bifonctionnels tels que le glutaraldéhyde ou l’acide bisdiazobenzidine-2,2’ dissulfonique (Smiley
et strandberg, 1972). Elles peuvent alors être éliminées facilement du milieu réactionnel par
filtration ou centrifugation afin d’être réutilisées.

 L’immobilisation par inclusion :
Les molécules d’enzymes sont soit retenus dans le réseau tridimensionnel d’un polymère
insoluble dans l’eau, soit emprisonnées à l’intérieur de microcapsules délimitées par une structure
(membrane synthétique semi-perméable ou liposome), dont les pores sont suffisamment petits
pour empêcher la diffusion des macromolécules, mais suffisamment larges pour permettre le
passage du substrat et des produits de la réaction.
 L’immobilisation par adsorption :
Dans ce procédé, l’enzyme est retenue à la surface d’un corps adsorbant, minéral ou organique,
grâce à des liaisons de faible énergie : liaison de Van der waals, liaisons hydrogène et interactions
électrostatiques, hydrophobes et/ou hydrophiles etc… (Basri et al., 1994). Les supports
adsorbants utilisés sont très variés, tant du point de vue de leur structure chimique que du point
de vue de leurs propriétés physiques (densité, granulométrie, porosité, etc…). Cependant, seuls
les adsorbants ayant une surface spécifique suffisante peuvent avoir des intérêts pratiques.
Cette méthode présente l’avantage de ne pas modifier chimiquement l’enzyme. Mais, lors de
l’utilisation, les risques de désorption de l’enzyme sont importants. Le relargage de l’enzyme
peut se produire lors de l’addition de substrat, lors d’un changement de pH ou lors de
l’augmentation de la force ionique du tampon (> à 0.2M) (Woodward, 1985).
 L’immobilisation par liaisons covalentes :
L'immobilisation par liaison covalente a été développée dans le souci d'obtenir des liaisons très
solides entre enzymes et supports. Pour la réalisation de la liaison covalente, il faut une activation
préalable soit du support soit de l'enzyme car les groupes fonctionnels de l'enzyme ne sont
généralement pas suffisamment réactifs.
Les supports doivent être activés par l’intermédiaire de groupements réactifs possédant un
groupement électrophile tels que le carbodiimide, le bromure de cyanogène, les sels de diazonium
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(Gemeiner et al., 1994). Il est également possible d’employer de l’épichlorhydrine ou encore un
agent bifonctionnel tel que le glutaraldéhyde (Bryjak et al., 1997 ; Lozano et al., 2002).
Les principaux groupements des enzymes impliqués dans l’établissement de la liaison covalente
sont les groupements α- et ε-aminés, les groupements α-β- et γ-carboxylés mais aussi les
groupements sulfhydryles et hydroxyles (cabral et Kennedy, 1991).
Comme dans le cas de l’adsorption, les supports utilisés doivent présenter une surface spécifique
la plus grande possible. La liaison étant irréversible, l’immobilisation est plus stable mais selon
les chaînes latérales des acides aminés engagés dans l’immobilisation, les pertes d’activité seront
importantes. Un inconvénient de cette technique est le problème de régénération du support
lorsque l’enzyme est devenue inactive.
b. L’immobilisation sur membrane :
Les travaux consacrés à l’immobilisation sur membrane sont nombreux et les méthodes
d’élaboration de membranes « actives » qui s’inspirent de celles décrites ci-dessus, sont très
variées. La figure 1 schématise les différents exemples d’élaboration de membranes
enzymatiques répertoriées dans la littérature (d’après Giorno et Drioli, 2000).
La membrane sert d’unité catalytique et de séparation
Biocatalyseur inclus dans la Biocatalyseur piégé Biocatalyseur Biocatalyseur lié à
matrice de la membrane dans les pores de la gélifié à la surface la membrane
(Gel de polyacrylamide, membrane de la membrane
Immobilisation alginate, PVC,
Adsorption
covalente carraghénane,…)
(Verre, silice,
(Glutaraldéhyde,
alumine, DEAE
carbodiimide)
cellulose)
Figure 1- Exemples d’élaboration de membranes enzymatiques
III.2 Généralité sur les lipases :
Les lipases sont des enzymes capables de catalyser l'hydrolyse d'esters glycéridiques en milieu
aqueux et la synthèse d'esters en milieu non aqueux .Elles peuvent être produites industriellement
à partir de nombreux microorganismes, mais la plus part des enzymes commerciales sont
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d’origine microbienne (Sharma et al., 2001) comme la lipase B de Candida antarctica (CALB).
Elles sont de ce fait capables de catalyser un grand nombre de réactions d'intérêt industriel. Que
ce soit par inclusion, par adsorption ou par liaison covalente, l'immobilisation des lipases vise à
leur conférer une bonne stabilité, permettant une réutilisation des enzymes après une réaction et
le développement de procédés en continu. Les réactions d'hydrolyse de triglycérides constituent
l'application première des lipases immobilisées, mais leur utilisation dans divers types de
réactions de synthèse s'est également mise en place : il existe des procédés faisant intervenir des
réactions de transestérification (ester et alcool), d'interestérification (ester et ester) ou de synthèse
d'esters (réaction entre un acide et un alcool) ainsi que dans des réactions de transfert du
groupement acétyle d'un ester sur d'autres nucléophiles tels que des amines ou des thiols.
 La lipase B issue de Candida antarctica (CALB) :
Comme l’indique son nom, Candida antarctica est originellement isolée en Antarctique dans le
cadre d’un programme de recherche visant à l’isolement d’enzymes fonctionnant en conditions
extrêmes. Cette levure produit deux lipases différentes appelée lipase A et lipase B.
La lipase B est particulièrement attractive du fait de ses propriétés catalytiques pour des
transformations stéréospécifiques lors de synthèses organiques. Il s’agit d’une protéine
globulaire, pouvant être assimilée à un parallélépipède de dimension 3×4×5nm ou à une sphère
de 2.42 nm de rayon. Son poids moléculaire est de 33000 et son point isoélectrique est égal à 6
(Uppenberg et al., 1994).Elle est également très stable. Même si le pH optimal de catalyse est
égal à 7, l’activité de cette enzyme est stable dans un milieu dont le pH varie entre 3.5 et 9.5. La
température de dénaturation se situe à partir de 50°c et dépend du pH de la solution tampon
utilisée. La forme commerciale de CALB immobilisée par adsorption sur une résine
macroporeuse, Novozym 435®, est plus résistante à une élévation de température et peut être
utilisée en continu jusqu’à 60-80°C.
Les triglycérides sont les substrats préférentiels de la plupart des lipases en hydrolyse et en
synthèse ; tant en milieu aqueux ou dans différents solvants apolaires. Certaines lipases
hydrolysent indifféremment tous types de liaisons ester des triglycérides, ne faisant pas de
discrimination entre leurs positions dans la molécule.
La polyvalence réactionnelle des lipases et la diversité de leurs propriétés catalytiques leur
confèrent une place de choix pour des applications industrielles potentielles, telles que la
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confection de produits alimentaires, de détergents, de produits pharmaceutiques et cosmétiques.
L'utilisation des lipases dans ces nombreux secteurs nécessite une formulation préalable.
Aujourd’hui la mise en œuvre de lipase en milieu non conventionnel ne se limite pas à
l’utilisation de solvant organique, le CO2 supercritique d’une part et les liquides ioniques (LI)
d’autre part, apparaissent de plus en plus comme des milieux réactionnels potentiels pour mener à
bien des réactions enzymatiques. Le CO2 supercritique est caractérisé par des densités, des
viscosités, et d’autres propriétés qui sont intermédiaires entre celles de l’état gazeux et liquide.
Les liquides ioniques sont des sels organiques possédant des points de fusion inférieurs à 100°C
et souvent même inférieurs à la température ambiante. Les réactions enzymatiques et la stabilité
des catalyseurs biologiques dépendent de plusieurs paramètres dont : la nature du solvant,
l’activité de l’eau, les substrats et produits et les effets des paramètres opératoires (pH,
température,…).
IV MATERIELS ET METHODES :
IV.1 Matériels :
IV.1.1 Enzymes :
L’enzyme utilisée est la lipase B de candida antarctica (CALB) ; Novozym 435® fourni par
l’industriel, mais commercialisée par la société NOVO
IV.1.2 Solutions chimiques et solvants :
 Solution de soude : Cristaux de soude (CAS N.1310-73-2) qu’on dilue dans l’eau
distillée pour obtenir une concentration voulue ;elle est commercialisée par la
société Carlo Erba reagents.
 Solution d’acide nitrique : UN 2031 de pureté maximale, elle est commercialisée
par la Societé VWR.
 Solution d’acide oxalique : commercialisée par la société Eurolab
 Solutions tampons : deux tampons sont utilisés pour la préparation des solutions
pour l’immobilisation, les analyses et l’étude des membranes : le tampon
phosphate 100mM : à base de NaH PO et Na HPO ; pH=7.8 et le tampon 2 4 2 4
carbonate 0.2M : à base de NaHCO et Na CO ; pH=9.2 3 2 3
 Solution de gélatine : Il s’agit de la gélatine en poudre issue de poissons et
commercialisée par la société Norlandprod (30g dans 3l de tampon carbonate).
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