VARIACIÓN INDIVIDUAL EN LA SUSCEPTIBILIDAD DEL SEMEN PORCINO AL CONGELADO-DESCONGELADO (INTER-INDIVIDUAL BOAR SPERM SUSCEPTIBILITY TO FREEZING-THAWING PROTOCOLS)

Medrano A.

Description

Resumen
En este trabajo se estudió la variabilidad en la supervivencia del semen porcino de diferentes individuos al congelado-descongelado. En primer lugar, se empleó un sistema estandarizado de congelación ( pellets en CO2) para comprobar la existencia de individuos cuyo semen es relativamente resistente (llamados good frezers) o muy susceptible ( bad freezers) al proceso de congelación-descongelación. En segundo lugar, se evaluó el efecto de la tasa de congelación en la criosobrevivencia espermática entre individuos y entre eyaculados, por medio de criomicroscopía. Los resultados indican que la susceptibilidad entre individuos parece ser más importante que la tasa de congelación en la criosobrevivencia espermática. Se observó además, por medio de criomicroscopía con tinciones fluorescentes, que la membrana plasmática del espermatozoide se mantiene intacta durante el congelado pero al descongelado se manifiesta la ruptura de esta estructura. Diferencias en la composición química de la membrana espermática podrían explicar la variabilidad individual al congelado-descongelado.
Abstract
Pig sperm cryopreservation is still not used routinely because of the sensitivity of pig spermatozoa to cold shock, and because cryosurvival is affected by between individual variation. Individual variation has been recognised by the farm industry in the sense that males are classified aseither good or bad freezers. This is an interesting aspect of cryobiology which provides a model to study the source of that variation. To address that issue a series of experiments was undertaken. In order to identify good and bad freezers, spermatozoa from 16 boars housed at an A.I centre were frozen using a standard technique. Spermatozoa from four boars had higher post-thawing values of motility and membrane integrity than the rest. In the next experiment three cooling rates (15, 30, 60°C/min) from -5°C to -50°C were tested on the sperm survival of ten ejaculates from five boars. Fluorescent probes, as membrane integrity reporters, were employed in combination with cryomicroscopy to detect the critical steps of the process. This approach allows observation of the spermatozoa during the freeze-thawing process and estimation of the proportion suffering membrane damage, and the moment when it happens. Two groups of samples were identified by Cluster Analysis: (1) resistents and (2) susceptibles, irrespective of cooling rate. Also, it was observed that, during freezing membrane integrity was maintained but at rewarming damage was manifested. In future experiments thermal properties of the sperm membranes from individuals regarded as good and bad freezers will be analyzed employing plasma membrane markers.

Sujets

• Pellet
• Fluorophore
• Cluster analysis

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• Publié par: erevistas
• Publié le: 01 janvier 1998
• Nombre de lectures: 22
• Langue: Español

Extrait

COMUNICACIÓN
VARIACIÓN INDIVIDUAL EN LA SUSCEPTIBILIDAD
DEL SEMEN PORCINO AL CONGELADO DESCONGELADO
INTER INDIVIDUAL BOAR SPERM SUSCEPTIBILITY
TO FREEZING THAWING PROTOCOLS
Medrano, A. y W.V. Holt
Institute of Zoology. The Zoological Society of London. Regent's Park. London NW1 4RY. Reino Unido.
PALABRAS CLAVE ADICIONALES ADDITIONAL KEYWORDS
Criomicroscopía. Tinciones fluorescentes. Cryomicroscopy. Fluorescent probes. Pellet
Pellets. Análisis por clusters. freezing. Cluster Analysis.
RESUMEN SUMMARY
En este trabajo se estudió la variabilidad en Pig sperm cryopreservation is still not used
la supervivencia del semen porcino de diferentes routinely because of the sensitivity of pig
individuos al congelado descongelado. spermatozoa to cold shock, and because
En primer lugar, se empleó un sistema estan cryosurvival is affected by between individual
darizado de congelación (pellets en CO) para variation. Individual variation has been recognised
2
comprobar la existencia de individuos cuyo se by the farm industry in the sense that males are
men es relativamente resistente (llamados good classified aseither good or bad freezers. This is
frezers) o muy susceptible (bad freezers) al an interesting aspect of cryobiology which
proceso de congelación descongelación. provides a model to study the source of that
En segundo lugar, se evaluó el efecto de la variation. To address that issue a series of
tasa de congelación en la criosobrevivencia experiments was undertaken. In order to identify
espermática entre individuos y entre eyacula good and bad freezers, spermatozoa from 16
dos, por medio de criomicroscopía. boars housed at an A.I centre were frozen using
Los resultados indican que la susceptibilidad a standard technique. Spermatozoa from four
entre individuos parece ser más importante que boars had higher post thawing values of motility
la tasa de congelación en la criosobrevivencia and membrane integrity than the rest. In the next
espermática. experiment three cooling rates (15, 30, 60°C/min)
Se observó además, por medio de criomicro from 5°C to 50°C were tested on the sperm
scopía con tinciones fluorescentes, que la mem survival of ten ejaculates from five boars.
brana plasmática del espermatozoide se mantie Fluorescent probes, as membrane integrity
ne intacta durante el congelado pero al descon reporters, were employed in combination with
gelado se manifiesta la ruptura de esta estructu cryomicroscopy to detect the critical steps of the
ra. Diferencias en la composición química de la process. This approach allows observation of
membrana espermática podrían explicar la varia the spermatozoa during the freeze thawing
bilidad individual al congelado descongelado. process and estimation of the proportion suffering
Arch. Zootec. 47: 319 327. 1998.MEDRANO Y HOLT
membrane damage, and the moment when it congelado modifica la dinámica de la
happens. Two groups of samples were identified formación de hielo y el compartimiento
by Cluster Analysis: (1) resistents and (2) sus (intra o extracelular) donde este se
ceptibles, irrespective of cooling rate. Also, it forma. Cabe añadir que la formación
was observed that, during freezing membrane intracelular de hielo debe evitarse para
integrity was maintained but at rewarming damage reducir el daño celular. El sistema de
was manifested. In future experiments thermal envasado del semen es importante
properties of the sperm membranes from porque permite o interfiere con la efi
individuals regarded as good and bad freezers ciente disipación del calor.
will be analyzed employing plasma membrane Desde el punto de vista de la inves
markers. tigación, la criomicroscopía represen
ta una herramienta muy útil para estu
diar las condiciones a las que los es
INTRODUCCIÓN permatozoides son sometidos durante
la congelación y la descongelación.
La inseminación artificial (I.A.)
Este sistema permite controlar la tem
empleando semen congelado descon
peratura de manera muy precisa y
gelado no es una práctica común en la
observar a los espermatozoides duran
crianza de cerdos a nivel comercial
te el proceso. El uso combinado de la
debido a que la fertilidad obtenida es criomicroscopía y tinciones fluores
baja generalmente (Johnson 1985). La centes para evaluar la integridad de la
causa de esta baja fertilidad es una membrana puede contribuir al conoci
combinación de efectos detrimentales miento de las causas que ocasionan la
en la fisiología y morfología de los pobre criosobrevivencia de los esper
espermatozoides durante el proceso matozoides porcinos. Los objetivos de
de congelado descongelado. El semen este trabajo son comparar la suscepti
porcino es muy susceptible a dichos bilidad del semen entre individuos al
procedimientos, especialmente al cho congelado descongelado, empleando un
que frío (Watson y Morris, 1987). Los sistema estandarizado de congelación;
métodos estándar de congelación des además, evaluar el efecto de la tasa de
congelación empleados en otras espe congelado en la criosobre vivencia
cies no producen resultados equiva espermática de diferentes cerdos y
lentes en el semen porcino debido a ladiferentes eyaculados.
susceptibilidad de cada individuo a la
crioconservación: el semen de algunos
cerdos sobrevive a la congelación con MATERIAL Y MÉTODOS
menor daño que el de otros, indepen
dientemente de su calidad inicial. Por CONGELADO EN PELLETS
esta razón, a los primeros se les ha El semen fue obtenido manualmen
llamado good freezers, y bad freezers te de 16 cerdos alojados en un centro
a los segundos (Watson 1995). de procesamiento de semen para inse
El sistema y el protocolo de conge minación artificial (JSR Healthbred Ltd.
lación también afectan la criosobre York, Inglaterra) y congelado según el
vivencia espermática. La tasa de método de Pursel y Johnson (1975).
Archivos de zootecnia vol. 47, núm. 178 179, p. 320.VARIACIÓN INDIVIDUAL ANTE LA CONGELACIÓN EN SEMEN PORCINO
Las muestras se mantuvieron 2 mótiles se estimó de grabaciones he
horas a temperatura ambiente, poste chas en tres momentos: (1) inmediata
riormente fueron centrifugadas y el mente después del descongelado, (2)
sobrenadante fue eliminado. Los es después de la filtración en sephadex, y
permatozoides fueron diluidos con (3) después de una hora de incubación,
medio BF5 sin glicerol y enfriados len con la ayuda del programa Hobson
tamente hasta 5°C. La fracción Sperm Tracker.
glicerolada del diluente se agregó en
tonces para ajustar la concentración PREPARACIÓN DE LAS COLUMNAS DE
final de glicerol (1 p.100) y la concen SEPHADEX
6tración espermática (120 X 10 /ml). Sephadex G 100 (Pharmacia Upp
Para hacer los pellets se colocaron sala, Sweden) fue activado en una
pequeñas gotas de semen diluido (0,1 solución de citrato de sodio (2,9 p.100
0,2 ml), en pequeñas cavidades w/v) a 5°C por 16 horas. Enseguida, 2
excavadas en la superficie de un blo ml de esta mezcla fueron vertidos en
que de CO. El semen permaneció en jeringas de plástico (5 ml); el flujo fue
2
CO por 3 4 minutos, posteriormente regulado por medio de un tubo de plás
2
fue depositado en tubos de plástico y tico ajustado a la punta de la jeringa y
fue almacenado en nitrógeno líquido. una pinza. Antes de la filtración, las
El descongelado de los pellets se columnas fueron lavadas con medio
hizo mezclando estos con Beltsville Tyrodes a 39°C para remover el citra
Thawing Solution (BTS) a 41°C du to de sodio y para calentar la columna.
rante 2 3 minutos. El semen desconge
lado fue filtrado en columnas de CONGELADO EN EL CRIOMICROSCOPIO
El criomicroscopio empleado ensephadex y los espermatozoides fue
este trabajo (Planer CM 3, Sunbury ron retenidos en filtros Millipore de tal
on Thames, Inglaterra) esta compues manera que el medio BTS fue separa
do de ellos. Los espermatozoides fue to de un microscopio Zeiss Axioskop
ron recobrados lavando los filtros con con una platina diseñada para conducir
medio de Tyrode (con bicarbonato de nitrógeno gaseoso, y un sensor eléctri
sodio), posteriormente fueron incuba co que permite monitorizar y controlar
dos por una hora a 39°C en 5 p.100 la temperatura de la muestra. Además,
CO . esta equipado con un sistema de luz
2
Los marcadores fluorescentes fluorescente. Otros detalles del
criomicroscopio se han publicado pre SYBR14 (100 nM) y yoduro de propidio
viamente (Holt 1992).(12 μM) (Molecular Probes, Oregon)
Para estos experimentos se usaronfueron empleados como indicadores
de la integridad de la membrana 20 eyaculados (réplicas) provenientes
(Garner y Johnson, 1995). El número de 13 cerdos. Las muestras fueron
de células positivas a SYBR14 y a centrifugadas, el sobrenadante elimi
yoduro de propidio (PI) se estimó de nado, y los espermatozoides resuspen
cintas grabadas del microscopio con didos en medio BF5. Los marcadores
luz fluorescente.