Desarrollo de estrategias moleculares para el estudio de la asimilación de nitrato en algas

María Teresa Navarro Gochicoa

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Extrait

Facultad de Ciencias

Universidad de Córdoba







Desarrollo de estrategias moleculares para el estudio de la asimilación
de nitrato en algas















María Teresa Navarro Gochicoa
Córdoba, 1998


I Índice


INTRODUCCIÓN 1
Asimilación de nitrato: visión general 2
Sistemas de transporte de nitrato 5
Reducción de nitrato a nitrito 7
Reducción de nitrito 9
Mutantes de asimilación de nitrato y regulación de la ruta 11
Objetivos 18

MATERIALES y MÉTODOS 21
1. Organismos empleados. Medios y condiciones de cultivo. 22

1.1 Estirpes bacterianas. 22

1.1.1 Medios de cultivo. 22
1.1.2 Condiciones de cultivo. 22

1.2 Estirpes de hongos. 23

1.2.1 Medios de cultivo. 23
1.2.2 Condiciones de cultivo. 24

1.3 Estirpes de C. reinhardtii. 24

1.3.1 Medios de cultivo. 25
1.3.2 Condiciones de cultivo. 26
1.3.2.1 Cultivos con luz continua. 26
1.3.2.2 Cultivos sincronizados (luz/oscuridad). 26

2. Determinación de actividades enzimáticas. 26

2.1 Actividad NAD(P)H- Nitrato reductasa. 26
2.2 Actividad BVH- Nitrato reductasa. 27
2.3 Actividad MVH- Nitrito reductasa. 27
2.4 Actividad MoCo. 28

2.4.1 Tampones empleados en el ensayo nit-1. 28
2.4.2 Extractos nit-1 de Neurospora crassa. 29
2.4.3 Extractos de C. reinhardti. 29
2.4.4 Ensayo de actividad MoCo. 29

2.5 Actividad de consumo de nitrato y nitrito. 30

2.5.1 Actividad de consumo de nitrato. 30
2.5.2 o de nitrito. 30

3. Métodos analíticos. 30
3.1 Determinación del crecimiento celular y clorofila. 30
3.2 Determinación de amonio. 30
3.3 Determinación de nitrito. 31
3.4 Determinación de proteínas. 31

4. Electroforesis de proteínas. 32

4.1 SDS-PAGE. 32
4.2 Electroforesis en condiciones nativas. 32
4.3 Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida. 33
4.4 Tinción de actividad xantina deshidrogenasa. 33

5. Técnicas inmunoquímicas. Inmunodetección en filtros (western blotting). 33

5.1 Electrotransferencia de proteínas. 33
5.2 Tinción de proteínas en nitrocelulosa. 33
5.3 Inmunodetección específica de Fd-NiR. 34

6. Técnicas de clonación molecular. Manipulación de moléculas de DNA. 35

6.1 Preparación de células competentes de Escherichia coli. 35
6.2 Fraccionamiento de moléculas de DNA y purificación de fragmentos 35
de restricción.
6.3 Rellenado de extremos cohesivos de moléculas de DNA. 36
6.4 Desfosforilación de extremos de moléculas de DNA. 36
6.5 Ligación de moléculas de DNA. 37
6.6 Transformación de células competentes de E. coli. 37

7. Plásmidos utilizados. 37

7.1 Plásmidos nativos. 37
7.2 Plásmidos recombinantes. 38

8. Aislamiento de DNA plasmídico (doble cadena) de E. coli. 38

8.1 Minipreparación de DNA plasmídico mediante lisis alcalina. 39
8.2 Minipreparación de DNA plasmíediante columna. 39
8.3 Minipreparación de DNA plasmídico mediante precipitación
con PEG. 39
8.4 Maxipreparación de DNA plasmídico. 40

9. Cuantificación de ácidos nucleicos. 41

10. Marcaje radioactivo de moléculas de DNA y RNA. 41

10.1 DNA. 41
10.2 RNA. 42

11. Aislamiento de DNA genómico de C. reinhardtii. 44
11.1 Maxipreparación de DNA genómico de alta calidad. 44
III11.2 Minipreparación de DNA genómico. 44

12. Fraccionamiento, transferencia y condiciones de hibridación de DNA
genómico de C. reinhardti. 45

12.1 Fraccionamiento. 45
12.2 Transferencia. 45
12.3 Condiciones de hibridación. 46

13. Aislamiento de RNA de C. reinhardti. 47

14. Fraccionamiento, transferencia y condiciones de hibridación de RNA
de C. reinhardti.

14.1 Fraccionamiento. 48
14.2 Transferencia. 48
14.3 Condiciones de hibridación. 48

15. Método de detección de mRNA específicos. 49

16. Análisis genético de estirpes de C. reinhardtii. 50

16.1 Complementación in vivo (obtención de diploides). 50
16.2 Análisis de segregantes o