MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE

-

Documents
46 pages
Obtenez un accès à la bibliothèque pour le consulter en ligne
En savoir plus

Description

Niveau: Secondaire, Lycée
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE & DE LA TERRE MEMOIRE présenté par Suzy MARKOSSIAN pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes FABRICATION DE LIGNÉES DE CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES (CELLULES ES) DE SOURIS OPTIMISÉES POUR LA DIFFÉRENCIATION PANCRÉATIQUE B Soutenu le 25 mai 2005 devant le jury suivant : Pr Jean-Marie EXBRAYAT - Président - Dr Geneviève CORDIER - Rapporteur - Dr Frédéric FLAMANT - Examinateur - Dr Pierre SAVATIER - Examinateur - Laboratoire Interactions cellulaires, rétrovirus et cancer UMR 754 INRA-ENVL-UCBL 50 avenue Tony Garnier DIRECTEUR EPHE : Geneviève CORDIER 69366 Lyon cedex 07 e-mail : Laboratoire INSERM U371 Equipe Savatier DIRECTEUR : Henry KENNEDY 18, ave. du Doyen Lépine RESPONSABLE : Pierre SAVATIER 69675 BRON Cédex e-mail : EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • système d'expression inductible

  • cellule

  • différenciation pancréatique

  • cellule souche embryonnaire

  • gène neurod1

  • séquences loxp

  • lignée

  • expression inductible


Sujets

Informations

Publié par
Publié le 01 mai 2005
Nombre de visites sur la page 42
Langue Français

Informations légales : prix de location à la page  €. Cette information est donnée uniquement à titre indicatif conformément à la législation en vigueur.

Signaler un problème
 
MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  SCIENCES DE LA VIE & DE LA TERRE  MEMOIRE  présenté  par Suzy MARKOSSIAN  pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes    FABRICATION DE LIGNÉES DE CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES (CELLULES ES) DE SOURIS OPTIMISÉES POUR LA DIFFÉRENCIATION PANCRÉATIQUEB  
 Soutenu le 25 mai 2005 devant le jury suivant :                         Pr Jean-Marie EXBRAYAT        -Président -                         Dr Geneviève CORDIER             - Rapporteur -                         Dr Frédéric FLAMANT Examinateur - -Dr Pierre SAVATIER - Examinateur -  Laboratoire "Interactions cellulaires, rétrovirus et cancer" UMR 754 INRA-ENVL-UCBL 50 avenue Tony Garnier DIRECTEUR EPHE : Geneviève CORDIER 69366 Lyon cedex 07 e-mail : genevieve.cordier@univ-lyon1.fr  Laboratoire INSERM U371 Equipe Savatier DIRECTEUR : Henry KENNEDY 18, ave. du Doyen Lépine RESPONSABLE : Pierre SAVATIER 69675 BRON Cédex e-mail : savatier@lyon.inserm.fr   
 RESUME
  Les cellules souches embryonnaires, ou cellules ES, sont des cellules pluripotentes, ce qui signifie qu’elles sont capables de se différencier dans tous les types cellulaires constituant l’organisme adulte. Néanmoins, les méthodes développées afin d’induire et de contrôler la différenciationin vitro des b cellules ES en cellules pancréatiques sont peu efficaces. Les protocoles décrits sont essentiellement basés sur l’utilisation de facteurs de croissance ou de molécules spécifiques. Les résultats obtenus montrent que la différenciationin vitro des cellules ES en cellules pancréatiques est encore un processus inefficace, tant du point de vue de la proportion des cellules capables d’adopter un phénotype pancréatique que du point de vue de leur maturation fonctionnelle. Il nous a donc paru nécessaire de développer des méthodes originales qui permettent d’orienter davantage la différenciation des cellules ES dans le lignage pancréatique b. La stratégie expérimentale que nous avons mise en œuvre repose sur l’expression ectopique, dans les cellules ES de souris, d’une combinaison de gènes codant des facteurs de transcription impliqués dans la formation du lignage pancréatique b. Dans cet objectif, nous avons développé deux technologies complémentaires, (i) la technologie des vecteurs lentiviraux recombinants et (ii) le système d’expression inductible CRE-ERT2/loxP. Le projet décrit dans ce rapport concerne le système d’expression inductible. Nous montrons que ce système, tel que nous l’avons conçu, permet l’expression inductible et ubiquitaire d’un gène pancréatique dans les cellules ES en autorenouvellement et au cours d’un processus de différenciation. L’optimisation du système permettra l’expression inductible d’un second gène pancréatique. Nous avons tout d’abord construit une lignée de cellules ES dans laquelle l’expression du facteur de transcription pancréatique PDX1 est inductible. A cet effet, nous avons utilisé la lignée de cellules ES CGR8CRE9, établie au laboratoire et exprimant la recombinase CRE-ERT2, dont l’activité est induite par le tamoxifène. Nous avons construit et introduit dans ces cellules un vecteur d’expression inductible du gènePdx-1. Ce vecteur correspond à un vecteur de recombinaison homologue, il permet l’insertion ciblée du gènePdx-1 dans l’un des allèles du locusROSA26, locus transcrit de façon importante et ubiquitaire. L’expression du gènePdx-1 est inductible car le gène est cloné en aval d’une cassette d’arrêt de transcription encadrée de séquences loxP. La transcription du gène n’est donc possible qu’après élimination de cette cassette par la recombinase CRE-ERT2 activée par le tamoxifène. Nous avons ensuite entrepris l’obtention de lignées de cellules ES permettant l’expression inductible du facteur de transcription pancréatique NKX2.2. La structure du vecteur d’expression inductible construit est identique au précédent. En revanche, la lignée cellulaire de départ est différente. En effet, il a été possible d’obtenir une lignée permettant l’expression constitutive du gènePdx-1 technologie utilisant la en lentivirale (lignée CGR8 LvPdx-1). Nous avons donc utilisé cette nouvelle lignée afin d’y introduire le gène Nkx2.2 ciblée du vecteur d’expression inductibleNous avons obtenu plusieurs lignées présentant une intégration. du gèneNkx2.2 l’un des allèles du locus dansROSA26. La seconde étape a consisté à introduire, dans cette lignée « double »Pdx-1 etNkx2.2, un troisième gène pancréatique, le gèneNeuroD1. Afin d’introduire ce gène dans le second allèle du locusROSA26,  construit. Nous avons ensuiteun troisième vecteur d’expression inductible a été obtenu plusieurs lignées « triples »Pdx-1,Nkx2.2 etNeuroD1 la. La dernière étape a consisté à introduire recombinase CRE-ERT2dans ces lignées, puisque la lignée CGR8LvPdx-1 de départ ne l’exprime pas. A cet effet, nous avons produit et utilisé un vecteur lentiviral LvCRE-ERT2. L’analyse des lignées finales obtenues a permis de montrer le maintien de l’expression constitutive de la protéine PDX1 mais l’expression inductible des gènesNkx2.2 etNeuroD1 détectable qu’au n’est niveau transcriptionnel. Une activité réduite de la recombinase en est la cause. Par ailleurs, le gèneNeuroD1 est transcrit en absence de tamoxifène. Les futurs travaux auront pour objectif l’amélioration du système d’expression inductible afin de permettre l’expression inductible efficace de deux facteurs de transcription pancréatiques dans les cellules ES et leurs dérivés différenciés.   Mots clés : cellule ES ; expression inductible ; recombinase CRE-ERT2 tamoxifène ; locus ;ROSA26; différenciation pancréatique ; facteurs de transcription PDX1, NKX2.2 et NEUROD1.    
 SOMMAIRE  
 05
ABREVIATIONS………………………………………………….……………………..…  INTRODUCTION……………………………………………………………………..…… 08  RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES………………….………………………………….…10  1.     Origine embryonnaire et diversité cellulaire du pancréas……………………… 10 2.     Les principaux facteurs de transcription impliqués dans le développement du pancréas .…………………………………………………………………………… 10 2.1  Induction de la différenciation pancréatique…………………………………………11 2.2  Gènes impliqués dans la formation des précurseurs pancréatiques à partir  de l endoderme intestinal…………………………………………………………………… 12 2.3  Gènes impliqués dans la formation des cellules pancréatiques endocrines………16 2.4  Gènes impliqués dans la différenciation terminale des cellules endocrinesb..…18 2.5  12………………………………………………es……………………………………Synthè 3.     Les cellules souches embryonnaires ou cellules ES……………………………… 21 4.     Les données expérimentales concernant la différenciation des cellules ES en cellulesb………………………………………………21………………………………… 4.1  Approches permettant de caractériser les cellules «b-like » obtenues……………22 4.1.1      Expression de protéines caractéristiques des cellules b...………………...22 4.1.2      Contenu des cellules en insuline et sécrétion d’insuline……………….... 23 4.1.3      Greffe des cellules dans des modèles d’animaux diabétiques………….... 24 4.2  Protocoles basés sur la différenciation spontanée des cellules ES…………………24 4.3   …………………………………………27Protocoles basés sur la sélection génétique 4.4  Protocoles basés sur l’utilisation de facteurs de croissances ou de molécules spécifiques dans le milieu de différenciation………………………………………………31 4.4.1      Utilisation de molécules ou de facteurs de croissance………………....... 31 4.4.2      Utilisation de la sélection des cellules exprimant la nestine…………...... 34 4.4.3      Les données controversant l’utilisation des protocoles basés sur la sélection des cellules exprimant la nestine…………………………………….… 40 5.     La stratégie expérimentale et les méthodes développées au laboratoire…………43 5.1  transcription dans les cellules ES murinesL’expression de facteurs de  …………43 5.2   44 …………………Expression stable grâce aux vecteurs lentiviraux recombinants 5.3  Expression conditionnelle grâce à un système d’expression CRE/loxP inductible par le tamoxifène …………………………………………………………………44 5.3.1      Principe du système d’expression inductible…………………………….. 45
5.3.2      Choix des facteurs de transcription à cloner dans les vecteurs d’expression inductible……………………………………………………...….....46 5.4  Expression transitoire grâce aux vecteurs adénoviraux recombinants ………… 48
    LISTE DES ABREVIATIONS  µg, µl, µM : microgramme, microlitre, micromolaire µF, µCi : microfarad, microcurie  ADN : Acide DésoxyriboNucléique AP : alcaline phosphatase ARNm : Acide RiboNucléique messager ATP : Adénosine triphosphate  cDNA : ADN complémentaire ou séquence codante du gène CMV : cytomégalovirus  DTA : gène de la toxine diphtérique DTZ : Dithizone  EB : Embryoïd body ou corps embryoïde eGFP : Enhanced Green Fluorescent Protein ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ER : domaine de fixation au ligand du récepteur aux oestrogènes ES : Embryonic stem  FGF : Fibroblast Growth Factor FITC : Fluoresceine isothiocyanate  GFP : Green Fluorescent Protein GK : Glucokinase GLUT2 : Glucose transporter 2 GMEM : Glasgow’s Modified Eagle Medium GTEV : Gene trap expression vector  HNF : Hepatocyte Nuclear Factor HSP : Heat Shock Protein Hygro : gène de résistance à l'hygromycine