CONTRIBUTION A L'ETUDE DU ROLE DE CKIP-1 DANS LA DIFFERENCIATION MUSCULAIRE REGULEE PAR PI3-K – IDENTIFICATION DES ARN MESSAGERS CORRESPONDANT AUX FORMES DE LA PROTEINE CKIP-1

Bernard Génétique

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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par CAUSSANEL Sabine Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes CONTRIBUTION A L'ETUDE DU ROLE DE CKIP-1 DANS LA DIFFERENCIATION MUSCULAIRE REGULEE PAR PI3-K – IDENTIFICATION DES ARN MESSAGERS CORRESPONDANT AUX FORMES DE LA PROTEINE CKIP-1 soutenu le 17 Novembre 2003 devant le jury suivant : EXBRAYAT Jean-Marie - Président VAYSSIERE Jean-Luc – Examinateur GOILLOT Evelyne – Examinateur DE KERCHOVE Alban - Examinateur Laboratoire de : Directeur : MIGNOTTE Bernard Génétique Moléculaire et Physiologique- CNRS UPRES- A8087 – Université Versailles/Saint- Quentin - mignotte@génétique.uvsq.fr Laboratoire de : Directeur : BRUN Gilbert Biologie des Régulations Cellulaires – UMR 5161 CNRS- Ecole Normale Supérieure de Lyon - CAUSSANEL Sabine – 17 Novembre 2003 – Pr.MIGNOTTE Bernard CONTRIBUTION À L'ÉTUDE DU RÔLE DE CKIP-1 DANS LA DIFFERENCIATION MUSCULAIRE RÉGULÉE PAR PI3-K - IDENTIFICATION DES ARN MESSAGERS CORRESPONDANT AUX DEUX FORMES DE LA PROTÉINE CKIP-1 EPHE Banque de Monographies SVT 1

• mécanisme d'épissage alternatif………………………………………………


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• sites multiples d'initiation de la transcription


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• Publié par: profil-nechor-2012
• Publié le: 01 novembre 2003
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Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE     ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES   Sciences de la Vie et de la Terre     MEMOIRE     présenté par   CAUSSANEL Sabine             Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes   CONTRIBUTION A L’ETUDE DU ROLE DE CKIP-1 DANS LA DIFFERENCIATION MUSCULAIRE REGULEE PAR PI3-K – IDENTIFICATION DES ARN MESSAGERS CORRESPONDANT AUX FORMES DE LA PROTEINE CKIP-1         soutenu le 17 Novembre 2003 devant le jury suivant :     EXBRAYAT Jean-Marie - Président VAYSSIERE Jean-Luc – Examinateur GOILLOT Evelyne – Examinateur DE KERCHOVE Alban - Examinateur

      Laboratoire de : Directeur : MIGNOTTE Bernard Génétique Moléculaire et Physiologique- CNRS UPRES- A8087 – Université Versailles/Saint- Quentin - mignotte@génétique.uvsq.fr   Laboratoire de : Directeur : BRUN Gilbert Biologie des Régulations Cellulaires – UMR 5161 CNRS- Ecole Normale Supérieure de Lyon - [e-mail] CAUSSANEL Sabine – 17 Novembre 2003 – Pr.MIGNOTTE Bernard   CONTRIBUTION À L’ÉTUDE DU RÔLE DE CKIP-1 DANS LA DIFFERENCIATION MUSCULAIRE RÉGULÉE PAR PI3-K - IDENTIFICATION DES ARN MESSAGERS CORRESPONDANT AUX DEUX FORMES DE LA PROTÉINE CKIP-1

    Au cours de l’étude du rôle de CKIP-1 dans la différenciation musculaire régulée par PI3-K dans la lignée de myoblastes C2C12, nous avons mis en évidence une nouvelle forme de la protéine CKIP-1. Cette forme a un poids moléculaire de 28kDa tandis que la protéine entière CKIP-1 a un poids moléculaire de 55kDa. Nous avons réalisé différents mutants de CKIP-1 et observé que cette forme courte semble correspondre à une protéine CKIP-1 initiée au niveau du deuxième ATG et par conséquent dépourvue de son domaine pleckstrine. Ce domaine est essentiel à la stimulation de la myogenèse par CKIP-1. Nous avons caractérisé les ARNm correspondant à ces deux formes en utilisant deux approches expérimentales différentes : la technique des ARN circulaires et la protection à la RNAse. Nous avons identifié trois populations de transcrits différents ayant des sites multiples d’initiation de la transcription. Deux d’entre elles ont des sites d’initiation de la transcription situés en aval du premier codon ATG initiateur.de la traduction et sont donc susceptibles de donner naissance à la forme courte de CKIP-1 initiée au deuxième ATG. L’analyse de la représentation de ces différentes populations de transcits suggère une représentation égale des deux protéines dans les cellules C2C12. Ceci a été confirmé en western blot. Ces résultats nous ont permis de déterminer deux régions pouvant jouer le rôle de régions promotrices. L’analyse de la séquence de ces régions a révélé des régions riches en GC pouvant correspondre à des régions promotrices de type GC riche dépourvue de boîtes d’initiation de la transcription comme la boîte TATA ou la boîte CAAT. De plus, cette région possède de nombreux sites Sp-1 qui sont connus pour guider l’initiation de la transcription de gènes ayant des promoteurs dépourvus de boite TATA. En accord avec nos résultats, ce type de régions promotrices est fréquemment associé à de multiples sites d’initiation.   Mot-Clefs : muscle, différenciation, CKIP-1, promoteurs, ARN messager, protéines. SOMMAIRE   SOMMAIRE.... …………………………………………………………………………………...3   LISTE DES ABRÉVIATIONS.... ………………………………………………………………...5   INTRODUCTION... …………………………………………………………………………… … 7 I- Régulation de la Transcription ……………………………………………………………...8 1- Structure d’un gène……........ …………………………………………………………………..8 2- Eléments régulateurs de la transcription dans le promoteur minimal………....... ……………...9 2-1- Promoteur avec boîte TATA (ou boîte Goldberg-Hogness) …………………...... ….9 2-1-1- Mise en place du complexe de pré-initiation de la transcription..... ……….9 2-1-2- Les différentes boîtes pouvant être associée à la boîte TATA .. …………10 2-1-3- Autres éléments initiateurs de la transcription pouvant être associés à la boîte TATA.. ………………………………………………………………..11 2-1-4- Conclusion …….... ……………………………………………………….12 2-2- Promoteur dépourvu de boîte TATA.... ……………………………………………12  2-2-1- Boîte GC ……….…………………………………………………………12  2-2-2- Rôle de l’Inr en absence de boîte TATA …….…………………………...13  2-2-3- L’élément DPE (Downstream Promoter Element) …….…………………14  2-2-4- L’élément BRE (IIB Recognition Element) ……….……………………..14  2-2-5- Conclusion …………………………………………………………….….15 3- Eléments régulateurs de la transcription dans le promoteur distal…….... ……………………15 II- Maturation des ARN pré-messagers………………………………………………………16 1- La coiffe…………………………………………………………………………………… .............. 16

2- La queue polyA……………………………………………………………………….... …….17 3- L’excision-épissage des introns……………………………………………….... …………….17 3-1- mécanisme d’excision-épissage constitutif………...... ………………………………….17 3-2- mécanisme d’épissage alternatif………………………………………………..... ……..18 3-3- Importance de l’épissage alternatif dans la myogenèse………………....... ……………..19 3-3-1- Le facteur de trancription MEF2 et l’intégrine b1………....... ……………19  3-3-2- Anomalie de l’épissage et pathologie musculaire……………………....…21  3-3-2-1- Le gène MTMR1 (myotubularin-related 1) ……………….……21 3-3-2-2- Les gènes IR (Insulin Receptor) et CIC-1 (chloride channel)..... .22 4- Promoteurs alternatifs…….... ………………………………………………………………...23 Utilisation du promoteur spécifique du muscle (pM) de l’Aldolase A………....... ……….23 III- Régions Régulatrices de l’ARN messager …….………………………………………...24 1- Interactions entre la coiffe, la séquence codante et la queue polyA…………………..... …….24 2- Régulation par la coiffe et la queue polyA………..... ………………………………………...26 3- Régulations par la région 5’UTR…..... ………………………………………………………..26 3-1- IRES (Internal Ribosomal Entry Site)...... ………………………………………………27 3-2- uORF (upstream Open Reading Frame)...... ……………………………………………28 3-3- Présence de Structures Secondaires…...... ………………………………………………30 4- Régulations par la région 3’UTR…..... ………………………………………………………..30 4-1- CPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element).... ……………………………………...31 4-2- ARE (AU Rich Element).... ……………………………………………………………31 4-3- Présence de Structures Secondaires...... …………………………………………………32 5- Conclusion ………………...... ………………………………………………………………..33  

  LISTE DES ABREVIATIONS   +1 : site d’initiation de la transcription ou site de démarrage de la transcription 3’UTR : 3’ UnTranslated Region 5’UTR : 5’ UnTranslated Region A : adénine ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire Apaf-1 : Apoptosis protease activating factor-1 ARE : AU Rich Element ARN : Acide RiboNucléique ARNr : Acide RiboNucléique ribosomal ARNm : Acide RiboNucléique messager ARNt : Acide RiboNucléique de transfert ATG : codon d’initiation de la traduction

AUF1 : AU Factor 1 BRE : IIB Recognition Element C : Cytosine CBC : Cap Binding Complex CBP : Cap Binding Protein CF : Cleavage Factor CGRP : Calcitonin Gene Related Peptide CIC-1 : chloride channel-1 CPE : Cytoplasmic Polyadenylation Element CPEB : CPE Binding protein CPSF : Cleavage Polyadenylation Specificity Factor CstF : Cleavage stimulating Factor CTF: CCAAT binding Transcription Factor CUG-BP: CUG-Binding Protein DM : Dystrophie Myotonique DPE : Downstream Promoter Element   eIF4-(F, E, A, G) : eukaryotic translation Initiation Factor 4-(F, E, A, G) G : Guanine GMP : Guanosine Mono-Phosphate IGF : Insulin Growth Factor IGFBP-2 : Insulin-like Growth Factor-Binding Protein-2 IgM : Immunoglobuline M IR : Insulin Receptor IRE : Iron Responsive Element IRES : Internal Ribosomal Entry Site IRP (1 ou 2) : Iron Responsive Protein (1 ou 2) MC : Créatine Kinase Musculaire K MEF2 : Myocyte-specific Enhancer-binding Factor 2 MRF : Myogenic Regulatory Factor MSE : Muscle-specific Splicing Enhancers MTMR1 : myotubularin-related 1 NLS : Nuclear Import Signal PABP (I ou II): PolyA Binding Protein (I ou II) PAP : PolyA Polymérase PI3-K : PhosphatidylInositol 3-Kinase PtdIns: PhosphatidylInositol R : purine (A, G) snRNA: small nuclear RNA T : Thymidine TAFs : TBP Associated Factors

TBP : TATA Binding Protein TFII (A, B, D, E, F, H, J) : Transcriptional Factor II (A, B, D, E, F, H, J) TfR : Transferrine U : Uridine XIAP : X-linked Inhibitor Apoptosis Protein XLMTM : Myopathie Myotubulaire liée à l’X Y : pyrimidine (C, U, T)

INTRODUCTION   L’étude de l’expression des gènes nécessite de connaître toutes les zones de régulations possibles au niveau des gènes et par conséquent des ARN messagers. Il est surprenant de voir qu’un organisme contenant un nombre de gène défini comporte autant de régulations au niveau moléculaire et cellulaire. En effet, si l’on prend le cas de l’Homme qui n’a, d’après le séquençage du génome, que 35 000 gènes, on comprend difficilement comment on peut arriver à une complexité moléculaire aussi grande. Cependant, il a été montré au cours du temps, qu’un même gène pouvait donner naissance à différents transcrits qui eux-mêmes pouvaient être à l’origine de la synthèse de plusieurs protéines différentes en fonction des conditions physiologiques et environnementales. Ceci sous-entend que cette complexité se situe en aval des gènes c’est-à-dire au niveau des étapes de la transcription et de la traduction. Effectivement, lors de la transcription d’un même gène, on peut aboutir à plusieurs messagers ; néanmoins la complexité s’accroît encore chez les Eucaryotes puisque l’on est confronté à une étape de maturation des messagers. Ainsi chaque pré-messager peut être initié à partir de plusieurs promoteurs et/ou subir différents épissages alternatifs. Ces étapes peuvent varier en fonction du type cellulaire ou tissulaire, des conditions physiologiques ou environnementales, ce qui augmente encore la complexité moléculaire. Cette diversité se poursuit lors de l’étape de traduction. Chaque messager à la possibilité de donner naissance à plusieurs protéines. La plupart du temps, l’initiation de la traduction se fait à partir d’un codon AUG. Or, il ne faut toutefois pas exclure les initiations exceptionnelles se faisant à partir de séquences permettant l’entrée des ribosomes de manière indépendante au codon AUG comme, par exemple les IRES. Ces deux phénomènes génèrent plusieurs isoformes protéiques à partir d’un même transcrit. Toutes ces diversités vont moduler la stabilité, la localisation et l’efficacité de la traduction des messagers. En résumé, la régulation d’un gène est contrôlée au niveau de: - la chromatine par des phénomènes de méthylation. - la transcription par sa région promotrice qui lui permet de fixer des facteurs de transcription modulant son expression. - la maturation des pré-messagers par la mise en place de la coiffe et de la queue polyA ainsi que les mécanismes d’épissage alternatif. - les initiations variables de la traduction - les différentes régulations des régions UTR (5’et 3’ UnTranslated Region) - les étapes post-traductionnelles.

Dans la première partie de cette introduction, nous rappellerons brièvement les différentes étapes de la régulation de la transcription en utilisant des exemples précis concernant des gènes impliqués dans le développement et la pathologie du tissu musculaire. Lors de notre étude du gène CKIP-1, nous avons été confrontés à certains de ces processus de régulation de l’expression d’un gène. Ces résultats seront présentés et discutés après une présentation des mécanismes moléculaires de la différenciation musculaire dans lesquels CKIP-1 est impliqué.   I – Régulation de la Transcription   La transcription aboutit à la synthèse de l’ARN messager (ARNm) à partir du brin négatif de la molécule d’ADN. Cette étape a lieu dans le noyau des cellules eucaryotes.   1-      Structure d’un gène   Un gène est généralement composé de quatre parties bien distinctes :   - La première partie correspond aupromoteur. Ce promoteur est composé d’un promoteur proximal (ou minimal) et d’un promoteur distal. Le promoteur proximal correspond à l’ensemble des éléments régulateurs permettant la fixation indirecte de l’ARN polymérase II. Les éléments régulateurs sont situés en amont du site d’initiation de la transcription et sont indispensables à sa reconnaissance. Le promoteur distal, quant à lui, possède des séquences reconnues par différents facteurs de transcription qui agiront comme destrans-activateurs ou destrans-répresseurs selon les signaux reçus par la cellule.   - La seconde partie correspond à la région 5’ UTR. Elle est bornée par le site d’initiation de la transcription (+1) et le codon d’initiation de la traduction (ATG).    - La troisième partie correspond à une séquence codante discontinue. Cette séquence contient des exons qui possèdent l’information génétique et codent pour la protéine ainsi que des introns qui s’intercalent entre les différents exons. Ces séquences seront transcrites mais pas traduites. Elles peuvent posséder des éléments régulateurs de la transcription (enhancers ou silencers).   - La dernière partie du gène correspond à une région 3’ transcrite mais non traduite                (3’UTR) qui se situe en aval de la séquence codante précédemment décrite. Cette partie contient la séquence génomique 5’AATAAA3’ appelée signal de polyadénylation qui sera interpretée par l’ARN polymérase comme un signal de fin de la transcription   2-   Eléments régulateurs de la transcription dans le promoteur minimal      

Parmi les plus fréquemment utilisés, on retrouve la boîte TATA présente dans la majorité des gènes. Cependant, certains promoteurs contiennent d’autres éléments permettant l’initiation de la transcription comme la boîte TATA : l’Inr, le DPE et le BRE. Dans certains promoteurs, aucun de ces sites remarquables n’est retrouvé.   2-1- Promoteurs avec boîte TATA (ou boîte Goldberg-Hogness)   La séquence de laboîte TATAest riche en A et T et son motif consensus est : 5’TATAAA3’. Cette boîte TATA est située à –30 nucléotides en amont du site d’initiation de la transcription. Ce motif TATA permet la fixation de l’ARN polymérase II sur l’ADN par l’intermédiaire de la protéine TBP (TATA Binding protein). Cette protéine appartient avec les TAFs (TBP Associated Factors) au complexe multiprotéique de pré-initiation de la transcription TFIID.    2-1-1- Mise en place du complexe de pré initiation de la transcription -   Lors de l’initiation de la transcription, le complexe multiprotéique TFIID (Transcriptional Factor II D) se fixe par l’intermédiaire de la protéine TBP (TATA-binding protein) sur la boîte TATA, constituée d’une séquence riche en T et A et située 30 nucléotides en amont du premier nucléotide qui sera transcrit. La fixation de ce complexe multiprotéique permet la reconnaissance du site de démarrage de la transcription par l’ARN polymérase II. Le complexe I, constitué de TFIID sur la boîte TATA, s’associe à TFIIB et génère le complexe II. L’addition de TFIIF à ce complexe permet l’entrée de l’ARN polymérase II en aval de la région TATA et permet la formation du complexe III. Ce nouveau complexe ainsi formé va permettre l’association de TFIIE et TFIIH pour faire le complexe V. Ces derniers auraient pour rôle de dénaturer la double hélice d’ADN au site d’initiation de la transcription grâce à leur activité hélicase. Cependant, des études récentes ont montré que l’entrée de TFIIH dans le cycle de transcription dépend de l’association du complexe III avec TFIIE et donc implique la présence d’un complexe intermédiaire (complexe IV) [1]. Ces études nous permettent juste de dire qu’une coopération entre TFIIE, TFIIH et le complexe de pré-initiation (complexe III) est indispensable pour former le complexe V. Ce dernier quand il est associé à TFIIJ forme le complexe VI. TFIIA, quant à lui, semble pouvoir s’associer avec tous les complexes intermédiaires de pré- initiation. Des études ont montré que seule la présence du complexe I est nécessaire à l’association de TFIIA. TFIIA se lie donc de manière dépendante à TFIID en amont de la région TATA. Son effet semble être indirect sur la transcription et son rôle consiste probablement à induire un changement de conformation d’un état inactif de TFIID à un état actif.   2-1-2- Les différentes boîtes pouvant être associées à la boîte TATA   La boîte CCAAT la position -80 trouve en amont de la boîte TATA, entre la position –120 et se nucléotides du site de démarrage de la transcription. La modification de cette boîte a permis de montrer qu’elle est indispensable pour accentuer la vitesse de transcription des gènes la contenant.

Cette boîte peut se trouver sur le brin sens comme sur le brin antisens. Dans ce dernier cas, elle est alors sous sa forme complémentaire sur le brin sens, c’est-à-dire : 5’ATTGG3’. Sa séquence permet d’interagir avec un facteurtrans-régulateur appelé CTF (CCAAT binding Transcription Factor) isolé de cellules de mammifères.   La boîte GCest formée d’éléments riches en bases G et C. Si elle est présente, elle est localisée en principe entre la boîte TATA et la boîte CCAAT. Le motif riche en GC est généralement unique en présence d’une boîte TATA. Sa séquence permet la fixation du facteur de transcription Sp-1. Cependant la protéine Sp-1 ne se lie pas forcément de manière égale à toutes les boîtes GC [2]. En effet, ces séquences seraient sensibles à la méthylation au niveau de leur cytosine.       2-1-3- Autres éléments initiateurs de la transcription pouvant être associés à la boîte TATA   Certains promoteurs ayant une boîte TATA peuvent également posséder d’autres éléments initiateurs de la transcription   L’élément initiateur   Inr transcriptionun motif qui chevauche le site d’initiation de lacorrespond à et dont la séquence consensus est la suivante : 5’YYAN(T/A)YY3’ chez les mammifères.         1 + N = nucléotides Y = pyrimidine   Des études ont montré que l’Inr semble ne pas être important ni pour la localisation du sitede démarrage de la transcription ni pour la direction de la transcription. Deux hypothèses ont été avancées. Dans la première, si l’affinité de liaison ADN-protéines est forte, l’Inr pourrait augmenter l’intensité du promoteur dans le cas d’une boîte TATA bien localisée et jouer le rôle d’activateur. Dans la seconde hypothèse, l’Inr serait reconnu comme un simple élément de la machinerie transcriptionnelle. Ainsi comme la boîte TATA facilite un haut niveau de transcription, l’Inr en aval de cette dernière conduirait à un très fort niveau basal de transcription [3]   L’élément BRE (IIB Recognition Element) La séquence consensus du BRE est 5’(G/C)(G/C)(G/A)CGCC3’. Elle est immédiatement suivie du 5’T de la séquence consensus 5’TATAA3’ constituant la boîte TATA [4]. Elle est reconnue par le facteur de transcription TFIIB par son motif hélice-boucle-hélice de liaison à l’ADN. Plus la séquence consensus est conservéein vitro, plus le facteur TFIIB se fixe à celle-ci pour permettre l’assemblage du complexe de pré-initiation et donc l’initiation de la transcription. Des études ont

montré que l’interaction TFIIB-BRE pourrait jouer un rôle dans : - la détermination de l’activité globale transcriptionnelle du promoteur, - l’ordre d’assemblage du complexe de pré-initiation à un promoteur, - l’étape limitante dans l’initiation de la transcription d’un promoteur, - la sensibilité d’un promoteur envers des activateurs transcriptionnels  spécifiques. BRE semble également être capable de déterminer la direction amont/aval de l’assemblage du complexe de pré-initiation ainsi que de l’initiation de la transcription en présence de l’interaction TBP-boîte TATA.               2 1-4- Conclusion               -   En conclusion, l’initiation de la transcription pour un promoteur avec une boîte TATA peut se faire par : (1) la boîte TATA seule, localisée en position –30 par rapport au site de démarrage de la transcription et reconnue par la TBP.   (2) la boîte TATA en combinaison avec d’autres éléments : - l’élément initiateur Inr, localisé près de la position –1. - l’élément BRE (IIB Recognition Element), localisé en position –7 de la boîte TATA et reconnu par TFIIB. Toutefois, on ne peut pas écarter la possibilité que des séquences régulatrices présentes dans les promoteurs distaux puissent réguler spécifiquement la transcription par interaction avec la boîte TATA ou les éléments Inr ou BRE présents dans le promoteur proximal.   2-2- Promoteur dépourvu de boîte TATA     La boîte TATA n’est pas indispensable car la majorité des gènes constitutifs ou domestiques (housekeeping genes) n’en possèdent pas. Des études ont montré que des délétions ou des mutations de la boîte TATA n’abolissent pas totalement la transcription. Les deux effets observés sont : une diminution du taux de transcription et une perte de la fidélité du site d’initiation.   2-2-1- La boîte GC   En l’absence de boîte TATA, la séquence de type 5’GGGCGG3’, située de manière variable, et connue sous le nom deboîte GCsemble pouvoir la remplacer. Le motif riche en GC est généralement répété plusieurs fois. Le facteurtrans-régulateur le plus connu pour se fixer dessus est la protéine Sp- 1. Ce facteur de transcription est un activateur ubiquitaire. Il est requis pour l’expression constitutive et inductible d’un grand nombre de gènes. Les études qui ont permis de mettre en évidence le rôle de Sp-1 ont été réalisé dans le virus SV40. Les auteurs ont montré que Sp1 lie sélectivement une

séquence riche en GC, présente en 6 répétitions d’hexanucléotides dans le promoteur proximal du virus SV40 [5]. Depuis, d’autres études ont montré qu’une grande variété de promoteurs cellulaires et viraux contenaient des boîtes GC et qu’elles pouvaient être activées par Sp-1in vitro. Ces boîtes GC sont souvent retrouvées près de sites de liaisons à d’autres facteurs de transcription, suggérant que ces facteurs pourraient agir en coopération pour moduler la transcription. C’est le cas du promoteur à l’IGFBP-2 (Insulin-like Growth Factor-Binding Protein-2) [2] du rat qui tout en étant dépourvu de boîte TATA ainsi que de boîte CCAAT, possède cependant une région riche en GC dans sa partie proximale. Cette région contient quatre boîtes GC, dont trois sont très proches les unes des autres. Elles peuvent être toutes des sites potentiels de fixation du facteur de transcription Sp-1. Une étude a démontré que la fixation de Sp-1 aux trois plus proches boîtes GC était essentielle pour l’activité promotrice. Cependant, la fixation de facteurs de transcription à leur site consensus situés en amont est nécessaire pour l’expression du gène. Bien que des études aient démontré que Sp-1 est nécessaire pour atteindre un niveau basal de la machinerie transcriptionnelle et qu’il semble indispensable pour obtenir une activité maximale des promoteurs chez les mammifères, on ignore toujours si cette transcription est activement régulée dans les cellules de mammifères ou si elle est simplement influencée par la quantité de protéine Sp-1 contenue dans le noyau [6, 7].   2-2-2- Rôle de l’Inr en absence de boîte TATA   L’élément initiateur,Inr, en absence de boîte TATA, aurait pour rôle de guider l’ARN polymérase II vers un site de démarrage de la transcription et peut donc permettre l’initiation de la transcription à partir d’un site unique. L’Inr pourrait également influencer la direction de la transcription en absence de boîte TATA [3]. L’initiation de la transcription par l’intermédiaire d’une séquence Inr fait intervenir le facteur TFIID [8].   Les promoteurs dépourvus de boîte TATA n’ont pas tous un élément initiateur mais ils possèdent d’autres éléments activateurs capables de permettre l’initiation de la transcription :   2-2-3- L’élément DPE (Downstream Promoter Element)   LeDPEest un site de reconnaissance de TFIID fréquemment trouvé dans les promoteurs dépourvus de boîte TATA. En effet, parmi les 205 éléments régulateurs de la transcription chezDrosophila melanogaster, il a été estimé : que 29% des promoteurs contiennent une boîte TATA (sans DPE), 26% contiennent un élément DPE (sans boîte TATA), 14% contiennent les motifs DPE et TATA et 31% ne contiennent ni l’un ni l’autre. La séquence DPE est conservée deDrosophila melanogasterà l’Homme et semble être aussi commune que la boîte TATA. Sa séquence consensus est localisée entre la position +28 et +32: 5’(A/G)G(A/T)(C/T)(G/A/C)3’ [5]. Par rapport au site d’initiation de la transcription. Des études ont montré une coopération entre les

motifs Inr et DPE. Ainsi, une mutation dans le motif Inr ou dans le motif DPE entraîne une forte diminution de l’activité du promoteur. Il en est de même dans le cas d’une insertion ou d’une délétion de nucléotides dans ces deux motifs. Ces observations indiquent que la transcription basale dépendante de DPE implique une liaison coopérative de TFIID (et plus précisément de certaines TAFs) avec les motifs DPE et Inr [9]. De plus, il a été montré que si l’on inactive le motif TATA d’un promoteur, son activité transcriptionnelle est totalement restaurée si l’on ajoute à ce dernier la séquence DPE dans sa position originelle (à +28 nucléotides du site de démarrage de la transcription) [10].   2-2-4- L’élément BRE (IIB Recognition Element)   Le motifBRE, quant à lui, joue un rôle important en absence de boîte TATA car il interagit avec TFIIB. En effet, des études ont montré que cette interaction pourrait avoir un rôle dominant dans l’assemblage du complexe de pré-initiation de la transcription mais aussi dans l’initiation de la transcription d’un promoteur dépourvu de boîte TATA. De plus, lors d’une recherche dans des bases de données de promoteurs eucaryotes, le motif BRE apparaît à une fréquence significative dans des promoteurs sans boîte TATA [4].                        2-2-5- Conclusion            En conclusion, l’initiation de la transcription pour un promoteur dépourvu de boîte TATA peut se faire par : - la ou les boîtes GC reconnue(s) par le facteur de transcription ubiquitaire Sp-1. - l’élément initiateur Inr combiné ou non avec l’élément DPE. - l’élément BRE, localisé en position –37 Tous les promoteurs n’étant pas isolés, il est difficile d’estimer la représentation des différents motifs dans les promoteurs proximaux. Cependant, il est maintenant clairement établi que le promoteur proximal ne dirige pas seulement le démarrage de la transcription. Il joue également un rôle crucial dans la régulation de la transcription en collaboration avec le promoteur distal.   3-      Eléments régulateurs de la transcription dans le promoteur distal   Le promoteur distal présente des séquences régulatrices spécifiques de chaque gène. Ces motifs spécifiques sont reconnus spécifiquement par des facteurs de transcription. Ces facteurs recrutent, par des interactions protéines-protéines avec d’autres facteurs de transcription et/ou des co-facteurs, la machinerie basale de la transcription et ainsi régulent la transcription Les séquencescisqui permettent la fixation de facteur-régulatrices du gène trans-régulateurs ont des effets sur la vitesse de la transcription. En effet, le taux de transcription du gène peut être