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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Ecole Pratique des Hautes Etudes Doctorat de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Sciences de la Vie et de la Terre PAILLOT Romain DÉVELOPPEMENT ET APPLICATION DE MÉTHODES DE MESURE ET CARACTÉRISATION DE L'IMMUNITÉ À MÉDIATION CELLULAIRE INDUITE PAR LES VIRUS RESPIRATOIRES ÉQUINS. Thèse dirigée par le Dr Geneviève CORDIER et le Dr Janet DALY Soutenue le 20 Févier 2007 Jury : M. J.L. Cadoré Mme G. Cordier M. J.C. Gluckman M. D. Hannant Mme J.H. Kydd M. J.M. Minke M. J. Slater Encadrement & Laboratoire d'accueil: Dr Janet Daly (), Dr Julia Kydd, Pr Duncan Hannant. Department of Infectious Disease, Centre for Preventive Medicine. ANIMAL HEALTH TRUST, Lanwades Park, Kentford, Newmarket. Suffolk CB8 7UU, United Kingdom. Directeur E.P.H.E.: Dr Geneviève Cordier. Laboratoire E.P.H.E ‘interactions cellulaires, rétrovirus et cancer'. IFR 128 Biosciences Lyon-Gerland UMR 754 INRA-ENVL-UCBL ‘Rétrovirus et pathologie comparée'. 50 avenue Tony Garnier, Lyon, France. EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • ehv

  • eiv

  • caractérisation de la synthèse d'ifng spécifique d'ehv

  • réponse immunitaire

  • vaccination

  • virus-specific antibody responses

  • réponse cellulaire chez le cheval


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Ecole Pratique des Hautes Etudes



Doctorat de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes

Sciences de la Vie et de la Terre





PAILLOT Romain




DÉVELOPPEMENT ET APPLICATION DE MÉTHODES DE MESURE ET
CARACTÉRISATION DE L’IMMUNITÉ À MÉDIATION CELLULAIRE INDUITE PAR
LES VIRUS RESPIRATOIRES ÉQUINS.




Thèse dirigée par le Dr Geneviève CORDIER et le Dr Janet DALY

Soutenue le 20 Févier 2007

Jury :

M. J.L. Cadoré
Mme G. Cordier
M. J.C. Gluckman
M. D. Hannant
Mme J.H. Kydd
M. J.M. Minke
M. J. Slater




Encadrement & Laboratoire d’accueil: Dr Janet Daly (Janet.Shaw@liverpool.ac.uk), Dr Julia
Kydd, Pr Duncan Hannant.
Department of Infectious Disease, Centre for Preventive Medicine. ANIMAL HEALTH TRUST, Lanwades
Park, Kentford, Newmarket. Suffolk CB8 7UU, United Kingdom.

Directeur E.P.H.E.: Dr Geneviève Cordier. genevieve.cordier@univ-lyon1.fr
Laboratoire E.P.H.E ‘interactions cellulaires, rétrovirus et cancer’. IFR 128 Biosciences Lyon-Gerland
UMR 754 INRA-ENVL-UCBL ‘Rétrovirus et pathologie comparée’. 50 avenue Tony Garnier, Lyon,
France.
EPHE Banque de Monographies SVT 1RÉSUMÉ

Titre: Développement et application de méthodes de mesure et caractérisation de l’immunité à
médiation cellulaire induite par les virus respiratoires équins.

Résumé
Le virus influenza équin (EIV) est une des principales causes de maladies respiratoires chez le cheval. Le
virus herpes équin de type 1 (EHV-1) infecte également le système respiratoire, l’infection peut se traduire
par des signes neurologiques et est à l’origine d’une majorité des avortements infectieux. La protection
induite par les vaccins conventionnels contre ces 2 virus s’appuie sur une réponse humorale. La nouvelle
génération de vaccin essaye de stimuler une réponse immunitaire humorale et cellulaire similaire à celle
induite par ces virus au cours de l’infection. Bien que les méthodes de mesure de la réponse humorale
soient en place depuis de nombreuses années, le développement de méthodes pour évaluer la réponse
immunitaire à médiation cellulaire a pris beaucoup de retard par rapport à l’avancée des stratégies
vaccinales chez le cheval. Cette étude décrit le et la caractérisation d’une méthode de
mesure de la réponse IFNg produite par les lymphocytes T. Ce nouveau marqueur a été évalué et utilisé
pour décrire la stimulation de la réponse cellulaire chez différentes populations de chevaux, après infection
par EHV-1 ou vaccination avec des vaccins conventionels ou expérimentaux à base de poxvirus
recombinants. Ce marqueur a également été adapté à l’étude de la réponse immunitaire après infection par
le virus EIV, parallèlement à l’amélioration d’une méthode de mesure de l’activité cytotoxique spécifique
d’EIV. En conclusion, la mesure de la synthèse d’IFNg est utile pour évaluer la réponse cellulaire chez le
cheval et peut être appliquée à l’évaluation de la nouvelle génération de vaccins contre EIV et EHV-1.

Title: The development and application of new assays to measure and characterise cell-mediated
immunity to equine respiratory viruses.

Abstract
Equine influenza virus (EIV) is a leading cause of respiratory disease in horses. Equine herpesvirus-1
(EHV-1) primarily infects the respiratory tract but is also known to cause neurological disease and is a
major cause of abortion. In both cases, protection afforded by conventional whole inactivated virus vaccines,
based principally on virus-specific antibody response, has limitations. The new generation of vaccines try to
mimic natural infection more closely by stimulating both humoral and cellular immune responses. Although
methods to detect and quantify virus-specific antibody responses are well established, the development of
reliable assays for the easy measurement of cell-mediated immunity (CMI), particularly virus-specific
cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses, has lagged behind vaccine development in the horse. This study
describes the development and characterisation of a method to measure virus-specific IFNg synthesising
cells. This new marker was compared with EHV-1-specific CTL activity and then applied to describe
stimulation of CMI in several horse populations after infection with EHV-1 or vaccination with either
whole inactivated EHV-1 vaccine or recombinant poxviruses encoding for an EHV-1 protein. This marker
was also successfully adapted to study the immune response to EIV. In addition, a previously reported
version of the EIV-specific bulk CTL assay was improved, characterised and applied to demonstrate the
development of CTL activity after experimental EIV infection. In conclusion, IFNg synthesis was shown to
be a useful measure of CMI in horses, which complements the CTL assay and can be applied to the new
generation of vaccines against EIV and EHV-1.

Mots clés: Immunité à médiation cellulaire, IFNg, cheval, EHV-1, EIV, infection, vaccination
Keywords: Cell-mediated immunity, IFNg, horse, EHV-1, EIV, infection, vaccination

TABLES DES MATIÈRES

RÉSUMÉ...................................................................................................................................... 2
EPHE Banque de Monographies SVT 2PRÉFACE......................................................................................
REMERCIEMENTS.......................................................................
PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS.....................................
TABLES DES MATIÈRES............................................................................................................ 3
LISTE DES ABRÉVIATIONS....................................................................................................... 8
LISTES DES TABLEAUX..............................................................
LISTES DES FIGURES.................................................................
LISTE DES ANNEXES..................................................................
CHAPITRE 1 :...............................................................................
BIBLIOGRAPHIE........................................................................................................................ 9
A INTRODUCTION GÉNÉRALE................................................................................................. 9
B IMMUNITÉ CONTRE LES VIRUS RESPIRATOIRES.................................................................. 10
B.1 Réponse immunitaire innée.......................................................................................... 10
B.2 adaptative ou spécifique................................................................. 11
B.2.1 Présentation des antigènes viraux11
B.2.2 Activation des cellules Th spécifiques de l’antigène...................................................................................... 12
B.2.3 Coordination de la réponse antivirale par les lymphocytes Th armés........................................................ 12
B.2.4 Réponse humorale à base d’anticorps.................................................................................................................. 13
B.2.5 Immunité à médiation cellulaire............................................................................................................................ 13
C VIRUS HERPES ÉQUIN DE TYPE 1 (EHV-1)............................................................................ 15
C.1 Structure du virus EHV-1............................................................................................ 15
C.2 Infection cellulaire et replication virale.......................................................................... 16
C.3 Propagation du virus et maladie................................................................................... 17
C.3.1 Infection du système respiratoire.......................................................................................................................... 17
C.3.2 Virémie cellulaire et ganglions lymphatiques du système respiratoire..................................................... 17
C.3.3 Avortement, maladie néonatale et périnatale..................................................................................................... 18
C.3.4 Signes neurologiques et autres formes de la maladie...................................................................................... 18
C.3.5 Latence.......................................................................................................................................................................... 19
C.3.6 Les souches de virus EHV-1 et la diversité des signes cliniques................................................................. 20
C.4 Epidémiologie........................................................................................................... 20
C.5 Immunité au virus EHV-1............................................................................................ 21
C.5.1 Modifications immunitaires dans le système respiratoire et réponse innée............................................. 21
C.5.2 Réponse immunitaire adaptative........................................................................................................................... 22
C.5.2.a Réponse immunitaire humorale................................................................................................................. 22
C.5.2.b Réponse à médiation cellulaire......................................................................................... 22
C.5.3 Evasion du virus et transparence à l’immunité................................................................................................. 23
C.5.4 Immunité croisée entre les virus EHV-1 et EHV-4............................................................................................ 25
D VIRUS INFLUENZA EQUIN................................................................................................. 26
D.1 Structure du virus EIV................................................................................................ 26
D.2 Infection cellulaire et réplication virale.......................................................................... 26
D.3 Sous-types de virus influenza A..................................................................................... 28
D.3.1 Sous-types de virus EIV et lignées....................................................................................................................... 28
D.3.2 Transmission inter espèces..................................................................................................................................... 29
D.4 Maladie induite par EIV.............................................................................................. 29
D.5 Epidémiologie chez le cheval........................................................................................ 30
D.6 Réponse immunitaire après une infection naturelle par le virus EIV.................................... 30
D.6.1 Immunité innée induite par EIV............................................................................................................................. 30
D.6.2 adaptative induite par EIV................................................................................................................... 31
D.6.3 Evasion immunitaire................................................................................................................................................. 32
E VACCINATION CONTRE LES VIRUS EHV-1 ET EIV.................................................................. 34
EPHE Banque de Monographies SVT 3E.1 Les éléments clés de la vaccination................................................................................ 34
E.1.1 Objectifs....................................................................................................................................................................... 34
E.1.2 Marqueurs de la protection..................................................................................................................................... 35
E.1.3 Sélection des souches virales pour la vaccination........................................................................................... 35
E.1.4 Planning de vaccination.......................................................................................................................................... 36
E.1.5 Modèles animaux pour évaluer l’efficacité des vaccins................................................................................. 36
E.1.6 Adjuvants..................................................................................................................................................................... 37
E.2 Les vaccins dits inertes............................................................................................... 37
E.2.1 Vaccins EHV-1 inertes.............................................................................................................................................. 38
E.2.1.a Vaccins à base de virus EHV-1 complets inactivés.............................................................................. 38
E.2.1.b EHV-1 sous-unitaires.................................................................................................................... 39
E.2.1.c Vaccins ADN contre EHV-1......................................................................................................................... 40
E.2.2 Vaccins EIV inertes.................................................................................................................................................... 41
E.2.2.a Vaccins à base de virus EIV complets inactivés.................................................................................... 41
E.2.2.b sous-unitaires contre la grippe équine42
E.2.2.c Vaccins ADN contre EIV............................................................................................................................... 43
E.3 Vaccins vivants.......................................................................................................... 44
E.3.1 Vaccins EHV-1 vivants............................................................................................................................................. 44
E.3.1.a Vaccins à base de virus vivants atténués................................................................................................ 44
E.3.1.b EHV-1 à base de vecteurs viraux46
E.3.2 Vaccins EIV vivants.................................................................................................................................................. 46
E.3.2.a Vaccins à base de virus EIV vivants atténués........................................................................................ 46
E.3.2.b EIV à base de poxvirus recombinant48
E.3.2.c Virus influenza vivant atténué développé par génétique inversée.................................................. 50
E.4 Importance de l’âge sur la vaccination........................................................................... 51
F CONCLUSION................................................................................................................. 52
CHAPITRE 2 :...............................................................................
MESURE DE L’IMMUNITÉ À MÉDIATION CELLULAIRE SPÉCIFIQUE DES VIRUS CHEZ LE CHEVAL
A MESURE DE LA REPONSE CELLULAIRE: METHODES EXISTANTES........
A.1 Mesure de la lympho-prolifération.............................................
A.2 Detection de l’activité des lymphocytes cytotoxiques (CTL).............
A.3 des cytokines et autres facteurs....................................
A.3.1 Expression des ARNm codant des cytokines......................................................
A.3.2 Synthèse de cytokines...............................................................................................
A.4 Présentation de l’antigène........................................................
B MATERIELS ET METHODES
B.1 Animaux................................................................................
B.2 Cellules et méthodes................................................................
B.3 Virus EHV-1..........................................................................
C RÉSULTATS...........................................................................
C.1 Sélection des marqueurs de la réponse immunitaire à médiation cellulaire
C.1.1 Identification et caractérisation d’un anticorps reconnaissant l’IFNg équin
C.1.2 Développement de l’ELISpot spécifique de l’IFNg équin...............................
C.1.3 Identification d’anticorps spécifiques d’autres marqueurs potentiels de l’immunité à médiation cellulaire
C.2 Dérivation et caractérisation de cellules dendritiques equines.........
C.2.1 Dérivation de cellules de type DC à partir de PBMC.........................................
C.2.2 Phénotype des cellules équines de type dendritique........................................
C.2.3 Problèmes rencontrés avec l’emploi de eqDC pour la mesure d’IFNg équin
C.3 Evaluation de l’IFNg comme marqueur de la réponse cellulaire spécifique d’EHV-1
+C.3.1 Quantification des cellules IFNg spécifiques d’EHV-1 par marquage ICC
+C.3.2 Phénotype IFNg après stimulation par EHV-1...........................
C.3.3 Comparaison de la synthèse d’IFNg avec l’activité CTL.................................
EPHE Banque de Monographies SVT 4C.3.4 Impact de la cryo-préservation des PBMC...........................................................
C.3.5 Mécanismes de la synthèse d’IFNg après stimulation in vitro par EHV-1..
C.3.5.a Rôles des récepteurs, facteurs solubles ou médiateurs cellulaires....
C.3.5.b Relation entre la réplication du virus EHV-1 et la synthèse d’ IFNg
C.3.5.c Phénotype des leucocytes infectés par EHV-1-Dgp2-GFP..................
C.3.5.d Impact de l’inactivation d’ EHV-1 sur la synthèse d’ IFNg par les PBMC
C.3.5.e Voies de présentation des antigènes d’EHV-1........................................
D DISCUSSION...........................................................................
D.1 Développement de méthodes de dosage de l’IFNg équin.................
D.2 Comparaison entre la synthèse d’IFNg et l’activité cytotoxique.......
D.3 Caractérisation de la d’IFNg spécifique d’EHV-1 par les PBL
D.4 Prochaines étapes...................................................................
CHAPITRE 3:................................................................................
CARACTÉRISATION DE LA SYNTHÈSE D’IFNG SPÉCIFIQUE D’EHV-1
A INTRODUCTION......................................................................
B MATERIELS ET METHODES........................................................
B.1 Animaux
B.2 Infection experimentale par EHV-1.............................................
B.3 Echantillons et méthodes..........................................................
C RÉSULTATS...........................................................................
+C.1 Réponse IFNg spécifique d’EHV-1 chez des animaux d’âges differents
C.2 Infection expérimentale de jeunes animaux...................................
C.2.1 Poulains.........................................................................................................................
C.2.2 Yearlings........................................................................................................................
C.3 Infection expérimentale de juments gravides.................................
+C.4 Comparaison du phénotype des PBL IFNg
C.5 Infection de poneys préalablement en contact avec EHV-1
C.6 Comparaison des réponses IFNg spécifiques d’EHV-1 au niveau des PBMC et des ganglions
lymphatiques
D DISCUSSION...........................................................................
D.1 Variation de la synthèse d’IFNg spécifique d’EHV-1 au cours de l’âge
D.2 Cinétique de la d’IFNg après infection expérimentale par EHV-1
D.3 Effet de la gestation sur la synthèse d’IFNg spécifique d’EHV-1.....
+D.4 Phénotype des cellules IFNg spécifiques d’EHV-1........................
CHAPITRE 4 :...............................................................................
CARACTÉRISATION DE LA SYNTHÈSE D’IFNG SPÉCIFIQUE D’EHV-1 APRÈS VACCINATION ET
INFECTION EXPÉRIMENTALE
A INTRODUCTION......................................................................
B MATERIELS ET METHODES........................................................
B.1 Echantillons et méthodes..........................................................
B.2 Protocole d’étude d’un vaccin EHV-1 inactivé..............................
B.2.1 Poulains.........................................................................................................................
B.2.2 Juments gravides.........................................................................................................
B.3 Protocole d’étude d’un vaccin NYVAC EHV-1-IE..........................
B.3.1 Vaccin NYVAC EHV-1-IE..........................................................................................
B.3.2 Animaux
B.3.3 Protocole de vaccination...........................................................................................
B.3.4 Dosages..........................................................................................................................
C RESULTATS........................................................................
C.1 Etude d’un vaccin EHV-1 inactivé..............................................
C.1.1 Poulains.........................................................................................................................
EPHE Banque de Monographies SVT 5C.1.1.a Synthèse de l’IFNg après infection par EHV-1........................................
+C.1.1.b Phénotype des cellules IFNg ......................................................................
C.1.1.c Suivi clinique et virologique après infection expérimentale par EHV-1
C.1.2 Jument gravide.............................................................................................................
C.1.2.a Synthèse de l’IFNg après vaccination et infection par EHV-1............
+C.1.2.b Phénotype des cellules IFNg
C.1.2.c Suivi clinique et virologique après infection.........................................
C.2 Etude du vaccin NYVAC-IE......................................................
C.2.1 Réponse IFNg après vaccination avec le vaccin NYVAC-IE............................
+C.2.2 Cinétique de la réponse IFNg après infection des poneys par EHV-1.........
+C.2.3 Phénotype des cellules IFNg ..................................................................................
C.2.4 Impact de l’inactivation d’EHV-1 par les rayons UV sur la synthèse d’IFNg par les PBL
C.2.5 Réponse CTL spécifique d’EHV-1..........................................................................
C.2.6 Réponse sérologique après vaccination...............................................................
C.2.7 Suivi clinique et virologique après infection expérimentale.........................
D DISCUSSION...........................................................................
D.1 Immunisation avec un vaccin EHV-1 inactivé...............................
D.1.1 Vaccination des poulains..........................................................................................
D.1.2 des juments gravides
D.2 Vaccin NYVAC-EHV-1-IE.........................................................
CHAPITRE 5:................................................................................
MESURE DE L’IMMUNITÉ À MÉDIATION CELLULAIRE SPÉCIFIQUE DU VIRUS EIV
A INTRODUCTION......................................................................
B MATÉRIELS ET MÉTHODES........................................................
B.1 Virus....................................................................................
B.2 Animaux
B.3 Cellules
B.4 Mesure de la réponse immunitaire cellulaire................................
B.5 Vaccination avec des virus canarypox recombinants......................
B.6 avec des baculovirus............................
C DÉVELOPPEMENT D’UNE MÉTHODE POUR ÉVALUER LA RÉPONSE IMMUNITAIRE CELLULAIRE SPÉCIFIQUE D’EIV
C.1 Dosage de l’activité cytotoxique.................................................
C.1.1 Utilisation de lymphoblastes comme cellules cibles.......................................
C.1.2 U de monocytes comme cellules cibles...............................................
C.1.3 Utilisation de fibroblastes comme cibles.............................................
C.1.4 Contrôle de la restriction par le CMH de l’activité cytotoxique des CTL spécifiques d’EIV
C.2 Mesure de l’IFNg....................................................................
C.2.1 Stimulation des PBMC par EIV...............................................................................
C.2.2 Mesure de la synthèse d’IFNg par les PBL après infection expérimentale par EIV in vivo
+C.2.3 Phénotype des PBL IFNg spécifiques d’EIV......................................................
D APPLICATION DU MARQUAGE ICC DE L’IFNG SPÉCIFIQUE D’EIV À DES PROTOCOLES DE VACCINATION
D.1 Vaccination avec des virus canarypox recombinants......................
D.1.1 Réponse immunitaire après vaccination...............................................................
D.1.2 Signes cliniques de la maladie et excretion virale après infection expérimentale par EIV
D.2 Vaccination avec des baculovirus recombinants............................
D.2.1 Réponse des anticorps de type SRH.......................................................................
D.2.2 Réponse IFNg spécifique d’EIV..............................................................................
E DISCUSSION...........................................................................
E.1 Dosage de l’activité cytotoxique des CTL spécifiques d’EIV............
E.2 Mesure de l’IFNg spécifique d’EIV.............................................
E.3 Vaccination contre le virus EIV.................................................
EPHE Banque de Monographies SVT 6CHAPITRE 6 :...............................................................................
SYNTHÈSE DES RÉSULTATS ET DISCUSSION GÉNÉRALE.......
CHAPITRE 7 :
MATERIÉLS & MÉTHODES.........................................................
A CULTURE CELLULAIRE.............................................................
A.1 Cellules mononucleees du sang périphérique (PBMC)...................
A.2 Fibroblastes provenant de biopsies de peau.................................
A.3 Cellules des ganglions lymphatiques..........................................
A.4 Dérivation de cellules équines de type dendritique........................
A.5 Préservation par cryogénie.......................................................
A.6 Milieux de culture...................................................................
B TRANSFECTION CELLULAIRE ET SYNTHÈSE DE CYTOKINES...............
C DOSAGE................................................................................
C.1 Dosage de l’IFNg par ELISpot..................................................
C.2 de l’activité cytotoxique spécifique d’EHV-1......................
C.3 amplification par culture des cellules T spécifiques d’EIV..............
C.4 Dosage de l’activité cytotoxique spécifique d’EIV..........................
D MARQUAGE DE SURFACE OU INTRACELLULAIRE............................
D.1 Marquage cellulaire de surface.................................................
D.2 intracellulaire (ICC)
E VIRUS EHV-1.........................................................................
E.1 Culture.................................................................................
E.2 Titration...............................................................................
F VIRUS EIV.............................................................................
F.1 Culture
F.2 Purification...........................................................................
F.3 Titration du virus infectieux sur œufs embryonnés de poule............
F.4 Dosage de l’hémagglutination (HA)...........................................
F.5 Haemolyse radiale simple (SRH: single radiale haemolysis) (Wood et al., 1983)
G ANALYSE STATISTIQUE............................................................
REFERENCES...............................................................................
ANNEXE 1.....................................................................................
ANNEXE 2
ANNEXE 3
ANNEXE 4
ANNEXE 5
ANNEXE 6
ANNEXE 7.....................................................................................

LISTE DES ABRÉVIATIONS


ADCC: antibody dependent cell-mediated cytotoxicity
AHT: Animal health trust
AHV: asinine herpesvirus
APC: antigen presenting cell
BALF: bronchoalveolar lavage fluid
EPHE Banque de Monographies SVT 7BFA: brefeldin A
BSA: bovine serum albumine
cDNA: complementary DNA
CF: complement fixing
CFU-GM: granulocyte/macrophage colony forming unit
CMI: cell mediated immunity
CMV: cytomegalovirus
Cpe: cytopathique effect
Cpm: count per minute
CTL: cytotoxique T lymphocyte
CTLp: CTL precursor
DC: dendritic cells
DIG: detergent-insoluble glycolipid
DMSO: dimethyl sulfoxide
dsRNA: double strand RNA
EAV: equine arteritis virus
EEE: eastern equine encephalitis or encephalomyelitis virus
EEL cell: equine embryological lung cells
EHV: equine herpesvirus
EIAV: infectious anemia virus
EIV: equine influenza virus
ELA: lymphocyte antigen
ELISPOT: enzyme linked immunsorbent spot assay
ER: endoplasmic reticulum
#F: foal
FCS: foetal calf serum
FSC: forward side scatter
GC: gonadotrophine chorionic
GFP: green fluorescent protein
GHV: gazelle herpesvirus
HA: haemagglutinin
hGC: hormone gonadotrophine chorionique
hr: hour
HS: horse serum
HSV: herpes simplex virus
IE: immediate-early
IFN: interferon
IL: interleukin
LAT: latent-associated transcript
M1 or M2: matrix proteins 1 or 2
Macrophage: Mf
MALT: mucosal associated lymphoid tissue
M&M: materials & methods
MHC: major histocompatibility complex
mn: minute
Monocyte: Mo
mRNA: messenger RNA
NA: neuraminidase
NALT: nasal associated lymphoid tissue
NK: natural killer cell
NP: nucleoprotein
NPC: nucleopore complex
ORF: open reading frame
OVN: overnight
PBMC: peripheral blood mononuclear cells
PBL: blood lymphocyte
PBS: phosphate buffer saline
PCR: polymerase chain reaction
#PM: pregnant mare
PRV: pseudorabies virus
EPHE Banque de Monographies SVT 8RBC: red blood cell
RER: rough endoplasmic reticulum
RPLN: retropharyngeal lymph node
Rpm: rotation per minute
SMLN: submandibulary lymph node
SI: stimulation index
SRH: single radial haemolysis
Tc: T cytotoxique
TCID: tissue culture infecting dose
TCR: T cell receptor
TGF: tumor growth factor
TK: thymidine kinase
TNF: tumor necrosing factor
T : lymphocyte T regulatorreg
SRH: single radial haemolysis
SSC: Side SCatter
SVF : sérum de veau foetal
VEE: Venezuelan equine encephalitis virus
VN: virus neutralising
WEE: western equine encephalitis virus
WNV: West Nile virus
#Y: yearling

Culture d’amplification : les termes ‘culture d’amplification’ ou ‘cellules amplifiées par culture’ correspondent à la culture
d’une suspension cellulaire en présence d’un virus ou d’un antigène afin d’induire une multiplication sélective des cellules qui
vont reconnaître et réagir à la présentation de ce virus ou antigène.
Cellules spécifiques d’un virus : cette mention regroupe les cellules présentent au sein d’une population cellulaire et qui
vont reconnaître et réagir à la présentation d’un virus ou d’un antigène. Utilisée dans le cadre de résultats, la mention
‘specifique d’un virus’ correspond à la réponse obtenue après soustraction du bruit de fond ou des réponses contrôles.
PBMC et PBL : les PBMC sont purifiés à partir du sang et sont stimulés par les suspensions virales. Le dosage ELISpot
mesure la réponse IFNg des PBMC, le marquage ICC mesure la réponse IFNg des PBL car cette population est
spécifiquement sélectionnée au sein des PBMC au cours de l’analyse par cytométrie en flux.

BIBLIOGRAPHIE

A INTRODUCTION GÉNÉRALE

Les infections respiratoires font partie des maladies les plus couramment rencontrées chez l’homme.
La plupart d’entre elles sont le résultat d’une infection virale. Chez le cheval, 7 virus sont connus
pour infecter le système respiratoire, le virus de la grippe équine (equine influenza virus ; EIV) et le
virus herpes de type 1 (equine herpes virus 1 ; EHV-1) étant parmi les plus fréquents.

Les virus EIV et EHV-1 possèdent des cycles biologiques différents qui peuvent être divisés en des
stratégies d’infection dites aiguës ou chroniques, respectivement. L’infection aiguë correspond à une
infection transitoire de l’hôte, régulée par une réponse immunitaire capable de prévenir la
dissémination systémique du virus, son maintien dans l’organisme ou une éventuelle réinfection par le
même virus. Le virus a donc besoin de trouver un nouveau porteur pendant sa période de réplication
qui est limitée afin de poursuivre son cycle infectieux. L’infection virale aiguë est couramment
associée au développement d’une pathologie chez l’hôte et implique de fréquentes mutations
permettant au virus d’échapper au système immunitaire. La transmission du virus est généralement
horizontale (d’un individu à un autre) et peut dépendre de la structure de la population hôte. La
stratégie d’infection dite chronique ou persistante est caractérisée par une réplication continuelle ou
épisodique du virus au sein de l’hôte (infection latente avec une possibilité de réactivation). Le virus
EPHE Banque de Monographies SVT 9n’est pas complètement éliminé par le système immunitaire mis en place après une période initiale de
réplication virale s’apparentant à une infection aiguë. Le virus ayant échappé à l’immunité spécifique
va s’installer localement ou se disséminer dans l’organisme pour induire une infection chronique. Les
virus persistants sont moins dépendants de l’organisation structurelle de la population hôte, la
transmission est couramment verticale (des parents à leur progéniture) ou par contact sexuel.

Les virus EHV-1 et EIV sont des bons exemples de pathogènes induisant des infections aiguës et
persistantes, respectivement. Leur structure, leur physiologie et leurs mécanismes d’infection et de
pathogénèse sont différents. Toutefois, les stratégies de vaccination actuelles contre les virus EHV-1
et EIV sont relativement similaires, bien que l’issue des infections et des vaccinations soient
disparates.

La compréhension de la réponse immunitaire spécifique d’un virus joue un rôle essentiel dans le
diagnostic de la maladie et dans l’évaluation des nouvelles stratégies de vaccination. La détection de
la réponse humorale à base d’anticorps permet d’identifier les infections récentes et d’évaluer
l’immunité de l’hôte. Bien que ces méthodes soient en place depuis de nombreuses années, le
développement de méthodes de mesure robustes et reproductibles de la réponse immunitaire à
médiation cellulaire, et plus particulièrement de la réponse des lymphocytes T spécifiques à un virus,
a pris beaucoup de retard derrière la mise en place des méthodes dites sérologiques et le
développement des vaccins.

Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse a été le développement et la caractérisation de
méthodes de mesure de l’immunité à médiation cellulaire chez le cheval. Ces méthodes ont été
utilisées pour démontrer et caractériser les réponses cellulaires induites après infection expérimentale
par les virus EHV-1 et EIV, réponses qui ont été ensuite comparées à celles stimulées par des vaccins
commerciaux ou expérimentaux.
B IMMUNITÉ CONTRE LES VIRUS RESPIRATOIRES

L’épithélium des muqueuses est la porte d’entrée dans l’organisme pour la majorité des agents
infectieux. La surface des poumons d’un cheval avoisine, selon des estimations, les 2000 m², à
comparer au 400 m² des humains. La prévention des infections est probablement facilitée
par la présence d’une forte immunité mucosale capable de stopper la migration du pathogène vers les
cellules et tissus cibles de l’infection. Les aspects généraux de l’immunité spécifique des virus,
comme elle est décrite chez l’homme, sont présentés dans cette section. Les éléments des réponses
immunitaires spécifiques des virus EHV-1 et EIV seront traîtés dans les sections décrivant ces virus.

B.1 RÉPONSE IMMUNITAIRE INNÉE

La réponse immunitaire innée est la première ligne de défense de l’organisme. Elle est importante
pour limiter la diffusion du virus au cours des premières heures qui suivent l’infection. Cette réponse
immunitaire est non spécifique du virus, elle est immédiate et intervient localement (au niveau de
l’épithélium du système respiratoire, par exemple).

L’immunité innée attaque rapidement le pathogène à l’aide de facteurs préformés (les protéines du
complément par exemple) et des cellules mononucléées résidentes. Les protéines du complément vont
former un complexe d’attaque membranaire qui peut cibler et lyser les cellules infectées par des virus
et les virus enveloppés eux même (voie alternative du complément). L’activation du complément est
considérée comme une réponse innée de type humoral, les produits de cette activation vont également
servir de facteurs chimiotactiques pour les cellules mononucléées.

EPHE Banque de Monographies SVT 10