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Niveau: Supérieur
Ministère de l'Education Nationale et de la Recherche ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre Purification et caractérisation d'un inhibiteur intracellulaire de sérine protéinases à partir de muscle squelettique de bovin par Caroline Tassy diplôme soutenu le 1998 à Paris devant le jury suivant Dr Alain Van Wormhoudt Président Dr Yves Benyamin Rapporteur Dr Examinateur Dr Ahmed Ouali Examinateur INRA Station de recherche sur la viande Theix 63122 Saint Genes Champanelle Tel: 04-73-62-41-58 Fax:04-73-62-42-68 E-mail: Laboratoire de Motilité Cellulaire, Sciences de la Vie et de la Terre, Montpellier INTRODUCTION In vivo, les enzymes protéolytiques sont présentes dans tous les tissus et sont impliquées dans de nombreux processus, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques. Elles interviennent notamment dans le turn-over des protéines. En effet, au cours de la vie d'une cellule, pratiquement toutes les protéines sont renouvellées par dégradation et resynthèse. Leur durée de vie est cependant très différente d'une protéine à l'autre. Cette dégradation est réalisée grâce à des enzymes appelées les protéases. EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • muscle

  • données sur les inhibiteurs du tissu musculaire

  • inhibiteur

  • calpaïnes

  • protéine

  • changement structural des calpaïnes visible en électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes

  • séquence is2 de la p94


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Ministère de l'Education Nationale et de la Recherche ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre  Purification et caractérisation d’un inhibiteur intracellulaire de sérine protéinases à partir de muscle squelettique de bovin  par Caroline Tassy
diplôme soutenu le 1998 à Paris devant le jury suivant Dr Alain Van Wormhoudt Président Dr Yves Benyamin Rapporteur Dr Examinateur Dr Ahmed Ouali Examinateur  INRA Station de recherche sur la viande Theix 63122 Saint Genes Champanelle Tel: 04-73-62-41-58 Fax:04-73-62-42-68 E-mail:tassy@clermont.inra.fr Laboratoire de Motilité Cellulaire, Sciences de la Vie et de la Terre, Montpellier  INTRODUCTION In vivo de, les enzymes protéolytiques sont présentes dans tous les tissus et sont impliquées dans nombreux processus, qu’ils soient physiologiques ou pathologiques. Elles interviennent notamment dans le turn-over des protéines. En effet, au cours de la vie d’une cellule, pratiquement toutes les protéines sont renouvellées par dégradation et resynthèse. Leur durée de vie est cependant très différente d’une protéine à l’autre. Cette dégradation est réalisée grâce à des enzymes appelées les protéases.
Selon leur mode d’action, on distingue deux grands groupes de protéases: les exopeptidases, qui agissent sur les protéines au niveau de leur extrémité (soit C-terminale, soit N-terminale); et les endopeptidases ou protéinases, qui hydrolysent les protéines au milieu de la chaîne peptidique. Les protéinases ont été classées par rapport au mécanisme de leur site actif. On distingue quatre grands groupes: les sérine protéinases, les cystéine protéinases, les aspartyl protéinases et les métalloprotéinases. Deux grandes voies de protéolyse ont été identifiées: les voies lysosomale et cytoplasmique. Les protéases impliquées dans la première voie, sont essentiellement les cathepsines localisées à l’intérieur des lysosomes (Chapman et al., 1997). Les autres enzymes sont localisées dans le cytoplasme et sont représentées par les calpaïnes, protéases neutre calcium dépendantes (Sorimachi et al., 1997) et le protéasome (complexe multicatalytique) (Coux et al., 1996). Dans la cellule vivante, ces protéases sont soumises à une régulation très fine qui se situe à deux niveaux: tout d’abord au niveau de l’expression du gène et ensuite au niveau de l’activité enzymatique de la protéine par des effecteurs positifs (activateurs), ou négatifs ( inhibiteurs). Les inhibiteurs endogènes des protéases, autres que la calpastatine, inhibiteur spécifique des calpaïnes (Sorimachi et al., 1997), ont depuis longtemps été mis en évidence dans de nombreux tissus, et leur action est, pour la grande majorité, dirigée contre les sérine et les cystéine protéinases. Leur principale fonction consisterait à limiter la protéolyse non désirée. De nombreux inhibiteurs ont déjà été identifiés dans différents tissus et fluides de mammifères, mais il existe cependant peu de données sur les inhibiteurs du tissu musculaire. Compte tenu de leur rôle probablement important dans le muscle post-mortem, nous avons focalisé nos efforts sur ces inhibiteurs musculaires. Si d’importants travaux ont déjà été réalisés sur les protéases et leur rôle sur la transformation du muscle en viande, peu ont été réalisés sur ces inhibiteurs de cystéine et sérine protéinases. Plusieurs inhibiteurs ont déjà été identifiés mais seulement quelques-uns ont été purifiés et caractérisés (Kim et al., 1992; Zabari et al., 1993; Rouchon, 1995; Berri et al., 1996). L’intêret porté en particulier aux inhibiteurs est lié au fait que, s’il n’y a pas de relation directe entre le taux d’enzymes musculaires et la vitesse d’attendrissage ou de maturation, par contre il existe une bonne corrélation entre cette même caractéristique et le rapport enzymes sur inhibiteurs (Ouali et Talmant, 1990). La connaissance de ces inhibiteurs s’est révélée d’autant plus intéressante que des résultats récents ont montré le rôle primordial notamment des inhibiteurs de sérine protéinases dans le musclepost-mortem.que la quantité de ces inhibiteurs dans effet, il apparaît  En le muscle est un des paramètres les plus importants pouvant expliquer la variabilité de la tendreté de la viande (Zamora, 1997). Ces résultats démontrent donc le rôle important de ces inhibiteurs dans le muscle et nous ont amené à nous intéresser à ces protéines. Ma contribution lors de ce travail consiste donc à purifier et caractériser un inhibiteur de sérine protéinases du muscle squelettique de bovin. Avant de présenter les résultats obtenus, nous allons faire le point sur les connaissances de ces différents systèmes protéolytiques et leurs inhibiteurs.  A-Les différents systèmes protéolytiques musculaires et leurs inhibiteurs
 Très souvent, lorsque l’on parle des systèmes protéolytiques d’un tissu donné, on fait allusion aux
systèmes sensés jouer un rôle dans la protéolyse cellulaire au sens large, c’est-à-dire les systèmes impliqués principalement dans le processus de renouvellement des protéines ou turn-over protéique. Ces systèmes, souvent ubiquitaires, sont en effet les plus abondants dans l’ensemble des tissus et cellules qui ont fait l’objet d’investigations. Ils sont au nombre de trois et on les distingue généralement sur la base de leur localisation cellulaire. Parmi ceux-ci, deux sont cytosoliques et le troisième présente une compartimentation cellulaire particulière. Les deux premiers sont les calpaïnes et les protéasomes et le troisième porte le nom de système lysosomal, puisque sa localisation est limitée aux organites qui portent le même nom à savoir, les lysosomes. Dans ce chapitre général sur les systèmes protéolytiques musculaires, nous ferons bien sûr une présentation de ces systèmes mais nous parlerons également d’un autre groupe de protéases qui sont les sérine protéinases. L’existence au sein de la cellule musculaire de ces protéases a été longtemps mise en doute mais des résultats récents semblent indiquer que certaines d’entre elles pourraient jouer un rôle important dans le muscle post-mortem.  1 LE SYSTEME DES CALPAINES Les calpaïnes ont été isolées pour la première fois à partir de muscle squelettique par Busch et al. en 1972. Au sein du muscle strié, les calpaïnes seraient localisées au niveau de la strie Z (Ishiura et al., 1980; Goll et al., 1991) mais aussi au niveau du sarcolemme (Nori et al., 1993). Ce système comprend plusieurs cystéine protéinases cytosoliques actives à pH neutre et dont l’activité est dépendante du calcium. Elles sont classées en fonction des concentrations calciques requises pour leur activité. Leur activité serait régulée par le calcium mais aussi par un inhibiteur spécifique de ces endopeptidases appelé la calpastatine (voir revues de Sorimachi et al., 1997 et de Molinari et Carafoli, 1997). 1-1La µ-calpaïne et la m-calpaïne 1-1-1 Structure générale Ces deux calpaïnes sont, à l’heure actuelle, les mieux connues (Croall et DeMartino, 1991; Sorimachi et al., 1997). Ce sont des protéases hétérodimériques résultant de l’association d’une sous-unité de 80 kDa portant le site actif, dite catalytique et d’une sous-unité de 30 kDa, dite régulatrice (Inomata et al., 1986), dont le rôle n’est pas clairement défini, mais pourrait stabiliser la sous-unité catalytique (Yoshizawa et al., 1995). La sous-unité catalytique des µ et m-calpaïnes est différente et formée de quatre domaines. Le domaine I est très conservé entre les différentes calpaïnes et régulerait l’activité protéolytique. Le domaine II contient les résidus Cys, Asn et His impliqués dans le site actif. Le domaine III contient le site de fixation de la calpastatine. Le domaine IV qui présente une forte homologie de structure avec la calmoduline, est identique pour les deux calpaïnes et contient les sites de fixation du calcium. La sous-unité régulatrice est commune aux deux calpaïnes et présente deux domaines séparés par une séquence riche en proline. Le domaine IV , présente jusqu’à 50% de similarité avec le domaine IV de la grande sous-unité et contient, lui aussi, des sites de fixation pour le calcium. Le domaine V, très hydrophobe, est riche en résidus Gly et pourrait permettre une interaction avec les phospholipides membranaires.  1-1-2 Activité des calpaïnes
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