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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Marlène L'OTELLIER Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes RECHERCHE DE NOUVEAUX COUPLES AUTOANTIGENES / AUTOANTICORPS AU COURS DE LA POLYARTHRITE RHUMATOIDE Soutenu le 2 décembre 2008 devant le jury suivant: Pr Ali BETTAIEB - Président Pr Bruno CANQUE - Rapporteur Danièle GILBERT – Examinateur - Examinateur Pr François TRON - Examinateur Laboratoire d'Immunologie Cellulaire et Immunopathologie de l'EPHE Directeur: Pr Bruno CANQUE () Centre Hayem Hopital Saint Louis 1 rue Claude Vellefaux 75010 PARIS Laboratoire d'Immunopathologie Clinique et Expérimentale – Hôpital Charles Nicolle CHU de Rouen Directeur: Pr François TRON Directeur de stage: Danièle GILBERT () 22 Boulevard Gambetta 76183 ROUEN Cedex Résumé La polyarthrite rhumatoïde (PR), le rhumatisme inflammatoire chronique le plus fréquent, se manifeste par une atteinte du tissu synovial à l'origine de la destruction ostéo-cartilagineuse et à terme par un lourd handicap fonctionnel. C'est une maladie auto-immune caractérisée par la production de nombreux autoanticorps (autoAc), certains tels que les facteurs rhumatoïdes, les Ac anti-protéines citrullinées ou encore les Ac anti-Sa, présentant un intérêt diagnostique et/ou pronostique.

  • détection des autoac dirigés

  • autoac

  • protéine

  • autoag candidats au diagnostic de la maladie

  • intérêt des analyses multiparamétriques

  • maladie auto-immune

  • virus d'epstein-barr

  • anticorps anti-ccp


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Publié le 01 décembre 2008
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Marlène L’OTELLIER marlenerebus@yahoo.fr Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
RECHERCHE DE NOUVEAUX COUPLES AUTOANTIGENES / AUTOANTICORPS AU COURS DE LA POLYARTHRITE RHUMATOIDE
Soutenu le 2 décembre 2008 devant le jury suivant: Pr Ali BETTAIEB - Président Pr Bruno CANQUE - Rapporteur Danièle GILBERT – Examinateur - Examinateur Pr François TRON - Examinateur Laboratoire d’Immunologie Cellulaire et Immunopathologie de l’EPHE Directeur: Pr Bruno CANQUE (bruno.canque@univ-paris-diderot.fr) Centre Hayem Hopital Saint Louis 1 rue Claude Vellefaux 75010 PARIS
Laboratoire d’Immunopathologie Clinique et Expérimentale – Hôpital Charles Nicolle CHU de Rouen Directeur: Pr François TRON Directeur de stage: Danièle GILBERT (daniele.gilbert@univ-rouen.fr) 22 Boulevard Gambetta 76183 ROUEN Cedex
Résumé La polyarthrite rhumatoïde (PR), le rhumatisme inflammatoire chronique le plus fréquent, se manifeste par une atteinte du tissu synovial à l’origine de la destruction ostéo-cartilagineuse et à terme par un lourd handicap fonctionnel. C'est une maladie auto-immune caractérisée par la production de nombreux autoanticorps (autoAc), certains tels que les facteurs rhumatoïdes, les Ac anti-protéines citrullinées ou encore les Ac anti-Sa, présentant un intérêt diagnostique et/ou pronostique. Un des enjeux majeurs pour améliorer la prise en charge de ces patients est la mise au
point de marqueurs permettant de prédire précocement la survenue et la sévérité de la maladie. Ce travail a pour objectif d’identifier, par une technique d’analyse protéomique ciblée, les antigènes (Ag) reconnus par des autoAc présents dans le sérum de patients atteints de PR débutante et ayant reçu ni traitement de fond ni corticothérapie. Des profils protéiques récurrents ont été (i) mis en évidence par électrophorèse monodimensionnelle réalisée à partir d'extrait cellulaire de la lignée promyélocytaire HL-60, puis (ii) étudiés en électrophorèse bidimensionnelle (E-2D) couplée à la spectrométrie de masse (SM). L'analyse des spectres ainsi obtenus a permis d'identifier 10 protéines cibles des autoAc dont 6 correspondent à des autoAg déjà décrits: hnRNPA2/B1, aldolase, a-énolase, BiP, HSP60 et calréticuline. Les protéines PGK1, STI1 et FUSE-BP 1 et 2 constitueraient, quant à elle, 4 nouveaux autoAg candidats au diagnostic de la maladie. L'analyse par SM montre que 7 d'entre elles présentent des peptides potentiellement citrullinés (aldolase, a-énolase, HSP60, calréticuline, PGK1 et FUSE-BP 1 et 2). Pour confirmer cette observation, deux méthodes ont été employées: (i) l'E-2D couplée à l'immunoempreinte à fluorescence infrarouge avec l'utilisation d'un Ac anti-citrulline et (ii) la détection des autoAc dirigés contre des peptides synthétiques dérivés de ces 7 protéines et couplés à des billes "Luminex". L'analyse par "Western Blot" a confirmé la présence de ces résidus citrullinés dans les enzymes de la glycolyse telles que l'aldolase, l'a-énolase et la PGK1, et dans les protéines HSP60 et FUSE-BP2. De plus, une réactivité vis à vis des 4 peptides dérivés de l'aldolase, l'a-énolase, la protéine HSP60 et la FUSE-BP 2 a été démontrée de façon significative, suggérant que ces 4 peptides pourraient constituer de nouveaux déterminants antigéniques au cours de la PR. Ces résultats ouvrent des perspectives pour la mise en place d'une approche multiparamétrique dédiée au diagnostic de la PR. Mots clés:Polyarthrite rhumatoïde, protéome, autoantigène, marqueurs prédictifs  
SOMMAIRE
SOMMAIRE.. 3 ABBREVIATIONS. 6 INTRODUCTION.. 8 1.      LA POLYARTHRITE RHUMATOIDE. 8 1.1.   La PR est une maladie complexe. 8 1.1.1.   L'âge. 9 1.1.2.   Les facteurs génétiques. 9 1.1.3.   Les gènes HLA de classe II de susceptibilité. 9
1.1.3.1.     La théorie de l'épitope partagé. 10 1.1.3.2.     Les autres gènes de susceptibilité. 11 1.1.4.   Les facteurs hormonaux. 11 1.1.5.   Les facteurs environnementaux. 11 1.2.   La PR est caractérisée par une atteinte du tissu synovial12 1.2.1.   Le tissu synovial normal12 1.2.2.   Le tissu synovial pathologique au cours de la PR.. 13 1.2.2.1.     L'hyperplasie synoviale. 13 1.2.2.2.     L’angiogenèse. 13 1.2.2.3.     L'infiltrat cellulaire. 14 1.3.   Les lymphocytes T et B: un rôle important dans la physiopathologie de la PR ... 14 1.3.1.   Les principaux autoanticorps de la PR.. 16 1.3.1.1.     Les Facteurs Rhumatoïdes. 17 1.3.1.2.     Les anticorps anti-protéines/peptides citrulliné(e)s. 18 1.3.1.2.1.    Les anticorps anti-filaggrine. 19 1.3.1.2.2.    Les anticorps anti-peptides cycliques citrullinés. 20 1.3.1.3.     Les anticorps anti-Sa. 21 1.3.2.   Les marqueurs diagnostiques et/ou pronostiques de la PR.. 22 1.3.2.1.     Sensibilité et spécificité. 22 1.3.2.2.     Les anticorps anti-CCP: marqueurs diagnostiques précoces de la PR.. 23 1.3.2.3.     Combinaison de marqueurs: amélioration de la valeur diagnostique. 24 1.3.2.4.      anti-CCP: marqueurs prédictifsLes facteurs rhumatoïdes et les anticorps de sévérité 24 1.3.3.   D'autres autoanticorps associés à la surexpression de certaines protéines au cours de processus physiopathologiques. 25 1.3.3.1.     Les anticorps anti-calpastatine. 25 1.3.3.2.     Les anticorps anti-GPI25 1.3.3.3.     Les anticorps anti-GRP 78/BiP. 26 1.4.   Intérêt des analyses multiparamétriques. 27 2.      PROTEOMIQUE: UN NOUVEL OUTIL AU SERVICE DES MALADIESL’ANALYSE
AUTO-IMMUNES. 28 2.1.   Le protéome. 28 2.1.1.   Principes et outils de l’analyse protéomique. 29 2.1.1.1.     La séparation des protéines. 29 2.1.1.2.     La révélation et l’analyse d’image. 30 2.1.1.3.     L'identification et la caractérisation des protéines. 30 2.1.1.3.1.    Le règne de la SM... 30 2.1.1.3.2.    La stratégie générale d'identification. 31 2.2.   Les applications de l’analyse protéomique à la PR. 32 OBJECTIFS DE L’ÉTUDE.. 34 BIBLIOGRAPHIE.. 35  
ABBREVIATIONS
 -A-Ac: Anticorps ACPA:Anti-citrullinated protein/peptide antibodies(Ac anti-protéines/peptides citrulliné(e)s) ACR:American college of rheumatology(Collège américain de rhumatologie) ADNc: ADN complémentaire AFA:Antifilaggrine autoantibodies(AutoAc anti-filaggrine) Ag: Antigène AIA:Adjuvant induced arthritis(Arthrite induite par l'adjuvant de Freund) AKA:Antikeratin autoantibodies(AutoAc anti-kératine) APF:Antiperinuclear factor(Facteur anti-périnucléaire) APRIL:A proliferation inducing ligand(Ligand de prolifération A) ARNm: ARN messager AutoAc: Autoanticorps AutoAg: Autoantigène -B-BAFF:B cell activating factor of TNF family(Facteur d'activation des LB appartenant à la famille du TNF) BCR:B cell receptor(Récepteur des cellules B) BSA:Bovin serum albumine -C-CCP:Cyclic citrullinated peptide(Peptide cyclique citrulliné) CHU: Centre hospitalo-universitaire