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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
N° d?ordre : 2350 THESE présentée pour l?obtention du titre de DOCTEUR DE L?INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE Ecole doctorale : S.E.V.A.B. Filière : Qualité et Sécurité des Aliments TITRE CARACTERISATION FONCTIONNELLE D'UN FACTEUR D'ELONGATION MITOCHONDRIAL LeEF-Ts mt CHEZ LA TOMATE. APPROCHES PAR TRANSGENESE ET PROTEOMIQUE par César Luis GIRARDI Soutenue le 26 Juin 2006 devant le jury composé de : M. Mondheur BOUZAYEN Président M. Guy ALBAGNAC Rapporteur M. Pravendra NATH Rapporteur M. Jean-Claude PECH Directeur de thèse M. Alain LATCHE Membre M. Michel ROSSIGNOL Membre M Anne BERNADAC Membre invité Laboratoire Génomique et Biotechnologie des Fruits, UMR INRA/INP-ENSAT N° 990 id25417312 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! -

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N? d?ordre : 2350

THESE


prØsentØe pour l?obtention du titre de

DOCTEUR DE L?INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE

Ecole doctorale : S.E.V.A.B.
FiliŁre : QualitØ et SØcuritØ des Aliments

TITRE
CARACTERISATION FONCTIONNELLE D’UN FACTEUR D’ELONGATION
MITOCHONDRIAL LeEF-Ts CHEZ LA TOMATE. mt
APPROCHES PAR TRANSGENESE ET PROTEOMIQUE

par

CØsar Luis GIRARDI


Soutenue le 26 Juin 2006
devant le jury composØ de :


M. Mondheur BOUZAYEN PrØsident
M. Guy ALBAGNAC Rapporteur
M. Pravendra NATH Rapporteur
M. Jean-Claude PECH Directeur de thŁse
M. Alain LATCHE Membre
M. Michel ROSSIGNOL Membre
M Anne BERNADAC Membre invitØ

Laboratoire GØnomique et Biotechnologie des Fruits, UMR INRA/INP-ENSAT N? 990
- 2 -
REMERCIEMENTS
Merci au Laboratoire GØnomique et Biotechnologie des Fruits en nome de son directeur
Mondheur BOUZAYEN pour m?avoir accueilli pendant ces 4 ans de travail.

Je tiens ? remercier et exprimer ma profonde reconnaissance ? Jean-Claude PECH pour
diriger cette thŁse et pour m?avoir fait confiance tout au long de mes Øtudes.

Je voudrais Øgalement remercier Anne BERNADAC et Alain LATCHE pour m’avoir
encadrØ et pour le temps, la disponibilitØ, l?Ønergie avec qui l?apprentissage Øtait
agrØable.

Toute ma gratitude ? Michel ROSSIGNOL pour l?intØrŒt qu?il a portØ ? mon travail et
pour m?avoir soutenu dans Øtudes de spectromØtrie de masse, sans oublie GisŁle
BORDERIES et Carole PICHEREAUX pour ses conseils techniques et scientifiques et
Mohamed ZOUINE pour la parti bioinformatique.

Je remercie Pierre MAURY pour ses conseils et sa disponibilitØ.

Je tiens aussi ? remercier Kalina BERMUDES pour son aide avec qui j?ai passØ
d?agrØables moments dans la paillasse du laboratoire.

Ce travail Øtant le fruit de nombreuses collaborations et contributions et pour ?a
j?exprime mes remerciements ? toutes les personnes et l’ensemble des membres du
laboratoire.

Je remercie les diffØrents membres du jury et Guy ALBAGNAC et Pravendra NATH
pour avoir acceptØ de juger ce travail en tant que rapporteurs.

Je voudrais remercier la CAPES pour m?avoir accordØ une bourse d?Øtude et la Embrapa
Uva e Vinho pour m?avoir dispensØ de mes activitØs professionnel de recherche en
permettant de rØalisØ avec tranquillitØ mon doctorat.

Cette thŁse est dØdiØe ? ma femme et tous les membres de ma famille qui Øtait
toujours ? mon c?tØ et pour leur soutien qui a contribuØ ? la rØussite de ce travail, et
m?ont permis de garder le moral dans les moments difficiles.


- 3 -
SOMMAIRE
RESUME EN FRANCAIS ................................................................................................................................... 3
RESUME EN ANGLAIS...................................................................................................................................... 4
RESUME EN PORTUGAIS ................................................................................................................................ 5
BREVE PRESENTATION GENERALE ET OBJECTIFS.............................................................................. 8
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................................... 11
1-BIOSYNTHESE ET ROLE DE L?ETHYLENE......................................................................................................... 12
1-1- Facteurs externes influant sur la synthŁse d?ØthylŁne et sur maturation............................................. 14
1-2 Les mØcanismes dØpendants de l?ØthylŁne au cours de la maturation des fruits................................... 14
2- MECANISMES DE LA CRISE RESPIRATOIRE..................................................................................................... 15
3- FONCTIONNEMENT ET ROLE DES MITOCHONDRIES ........................................................................................ 16
4 - LE GENOME MITOCHONDRIAL ET SON EXPRESSION....................................................................................... 18
5- L?IMPORTATION DES PROTEINES DANS LES MITOCHONDRIES ........................................................................ 20
6- ROLE DE LEEF-TS ET MECANISMES DE SYNTHESE DES PROTEINES CHEZ LES MITOCHONDRIES.................. 21 MT
7- LES STRESS OXYDATIFS ET LE ROLE DE LA MITOCHONDRIE........................................................................... 22
8- PROTEOMIQUE DE LA MITOCHONDRIE........................................................................................................... 24
CHAPITRE I....................................................................................................................................................... 27
THE MITOCHONDRIAL ELONGATION FACTOR LEEF-TS IS REGULATED DURING TOMATO MT
FRUIT RIPENING AND UPON WOUNDING AND ETHYLENE TREATMENT .................................... 27
ABSTRACT ........................................................................................................................................................ 27
1. INTRODUCTION........................................................................................................................................ 28
2. MATERIALS AND METHODS ........................................................................................................................... 29
2.1. Plant material....................................................................................................................................... 29
2.2. Ethylene and MCP treatment, wounding and temperature shocks...................................................... 29
2.3. Phylogenic tree..................................................................................................................................... 29
2.4. RNA isolation, RT-PCR and real-time PCR ......................................................................................... 29
2.5. CO and ethylene production measurements........................................................................................ 30 2
2.6. Generation of sense and antisense LeEF-Ts plants ........................................................................... 30 mt
3. RESULTS........................................................................................................................................................ 31
3.1. Tomato LeEF-Ts is encoded by a single copy gene ........................................................................... 31 mt
3.2 LeEF-Ts gene is expressed at higher levels in fruit and is regulated during fruit ripening................ 31 mt
3.3. LeEF-Ts gene expression is stimulated in fruit by ethylene, wounding and temperature shocks....... 34 mt
3.4. Physiological characterisation of sense and antisense LeEF-Ts plants ............................................ 36 mt
4. DISCUSSION AND CONCLUSION...................................................................................................................... 39
REFERENCES ..................................................................................................................................................... 41
CHAPITRE II ..................................................................................................................................................... 44
EFFETS DE LA SUR OU SOUS-EXPRESSION DU GENE LEEF-TS SUR LA REPONSE AUX MT
STRESS OXYDATIFS DES PLANTES DE TOMATE .................................................................................. 44
1. INTRODUCTION........................................................................................................................................ 44
2- MAT?RIEL ET M?THODES ..................................................................................................................... 46
2.1 - MatØriel vØgØtal .................................................................................................................................. 46
2.2 - Application des stress.......................................................................................................................... 46
2.2.1- Traitement avec Paraquat ............................................................................................................................... 46
2.2.2 - Traitement SØcheresse................................................................................................................................... 47
2.2.3 - Traitement ? la Chaleur ................................................................................................................................. 47
2.3 ? Dosage des activitØs enzymatiques..................................................................................................... 47
2.3.1 - Extraction et dosage des protØines................................................................................................................. 47
2.3.2 - Dosage de l?activitØ de la Superoxide Dismutase (SOD - CE 1.15.1.1) ........................................................ 48
2.3.3 - Dosage de l?activitØ de la Catalase (CAT - CE 1.11.1.6) .............................................................................. 49
2.3.4 - Dosage de l?activitØ de la Guaiacol Peroxydase (G-POX - CE 1.11.1.7) ...................................................... 50
2.3.5 - Dosage de l?activitØ de la Glutathione rØductase (GR - CE 1.6.4.2).............................................................. 50
3 - RESULTATS .............................................................................................................................................. 51
3.1- Expression du gŁne LeEF-Ts dans les plantes transgØniques ........................................................... 51 mt
3.2- Expression du gŁne LeEF-Ts en rØponse ? des stress abiotiques...................................................... 52 mt
- 4 -
3.3- PhØnotypes des plantes de tomates sous ou sur-exprimant le gŁne LeEF-Ts en rØponse ? des stress mt
abiotiques. ................................................................................................................................................... 53
3.4- Effets du paraquat sur le dØveloppement de cals de tomates WT, S et AS. .......................................... 54
3.5- Effets du paraquat sur l?activitØ de quatre enzymes intervenant dans les processus anti-oxydatifs chez
des plantes tØmoins (WT) ØvaluØe ? des durØes variables aprŁs traitement................................................ 55
3.6- ActivitØ de la catalase dans les plantes WT, AS et S en rØponse ? diffØrents stress. ............................ 57
3.7- ActivitØ de la superoxyde dismutase dans les plantes WT, AS et S en rØponse ? diffØrents stress. ...... 58
3.8- ActivitØ de la Glutathion rØductase dans les plantes WT, AS et S en rØponse ? diffØrents stress......... 59
3.9- ActivitØ de la Gua?col pØroxydase dans les plantes WT, AS et S en rØponse ? diffØrents stress. ......... 60
4- DISCUSSION ET CONCLUSION .............................................................................................................. 61
4.1- Expression du gŁne LeEF-Ts ............................................................................................................. 61 mt
4.2- ActivitØs des enzymes en rØponse aux stress ........................................................................................ 61
4.3 ? RØponse aux stress des plantes transformØes pour LeEF-Ts ........................................................... 63 mt
CHAPITRE III.................................................................................................................................................... 65
EFFETS DE LA SOUS ET SUR EXPRESSION DE LEEF-TS SUR LE PROTEOME MT
MITOCHONDRIAL DE CALS DE TOMATES ............................................................................................. 65
1. INTRODUCTION........................................................................................................................................ 65
2 - MATERIEL ET METHODES..................................................................................................................... 66
2.1- Cultures de cals.................................................................................................................................... 66
2.2 - Marquage isotopique diffØrentiel des protØines .................................................................................. 66
2.3 - Isolement et purification des mitochondries........................................................................................ 66
2.4 - Mesure de l?activitØ Cytochrome C Oxydase (CcO - EC 1.9.3.1)....................................................... 68
2.5 - DØtermination de la puretØ des mitochondries.................................................................................... 69
2.5.1- Alcool deshydrogenase (ADH - EC 1.1.1.1) .................................................................................................. 69
2.5.2 - Alcaline Pyrophosphatase (alkPP - EC 3.6.1.1) ............................................................................................ 70
2.5.3 ? Catalase : ...................................................................................................................................................... 70
2.6 - ?lectrophorŁse monodimensionnelle en conditions dØnaturantes (SDS/PAGE)................................. 71
2.7 - Coloration et dØcoloration des gels. ................................................................................................... 71
2.8 - Analyse d?image.................................................................................................................................. 72
2.9 - Excision et lavage des zones de gel..................................................................................................... 72
2.10 - Digestion trypsique, extraction des peptides et prØparation des Øchantillons pour l?analyse en
spectromØtrie de masse................................................................................................................................ 72
2.11 - Analyses par spectromØtrie de masse................................................................................................ 73
2.12 - Identification des protØines par spectromØtrie de masse MALDI-TOF ............................................ 73
2.13 - Identification des protØines par spectromØtrie de masse en tandem LC/MS/MS. ............................. 74
2.14 - Quantification relative des protØines par spectromŁtrie de masse en tandem LC-MS/MS aprŁs
15marquage mØtabolique ? l?azote N. .......................................................................................................... 74
2.15 ? SØquen? age du proteome total mitochondrial .................................................................................. 75
3 - RESULTATS .............................................................................................................................................. 77
3.1 ? Purification des mitochondries........................................................................................................... 77
3.2 ? Effet de la transgØnŁse sur les modification des profils protØiques.................................................... 77
3.2 ? Effet de la transgØnŁse sur les modification des profils protØiques.................................................... 78
3.2.1 - Etude des profils de sØparation par SDS-PAGE de protØines de mitochondries issues de cals WT, AS et S
colorØes au bleu de Coomassie R250. ...................................................................................................................... 78
3.2.2 - Etude des profils de sØparation par SDS-PAGE de protØines de mitochondries issues de cals WT, AS et S
colorØes au bleu colloidal G250. .............................................................................................................................. 78
3.2.3 - Quantification relative des protØines par spectromŁtrie de masse en tandem LC-MS/MS aprŁs marquage
15mØtabolique ? l?azote N. ........................................................................................................................................ 81
3.3 - Analyse globale du protØome mitochondrial....................................................................................... 84
3.3.1 - Identification des protØines mitochondriales de la tomate............................................................................. 84
3.3.2 - Comparaison avec d'autres orthologues mitochondriaux............................................................................... 84
3.3.3 -PrØdictions bioinformatiques de l’adressage subcellulaire.............................................................................. 85
4 ? DISCUSSION ET CONCLUSIONS..................................................................................................................... 87
DISCUSSION GENERALE............................................................................................................................... 88
REFERENCES.................................................................................................................................................... 91
Resume en Fran?ais 5
RESUME EN FRANCAIS
Cette thŁse est relative ? l?Øtude fonctionnelle d?un gŁne codant pour un facteur
d?Ølongation Le-EF-Ts chez la tomate. Ce gŁne participe au processus de synthŁse des mt
protØines dans la mitochondrie et prØsente une forte expression au cours de la maturation par
comparaison avec d?autres organes. Nous dØmontrons qu?il est fortement exprimØ pendant les
premiers stades de la maturation en parallŁle avec la crise respiratoire climactØrique et que
son expression est stimulØe par l?ØthylŁne, la blessure et de hautes tempØratures. Cependant,
les mutants de tomate insensibles ? l?ØthylŁne prØsentent une expression assez ØlevØe
indiquant la prØsence d?un rØgulation indØpendante de l?ØthylŁne. Des fruits transgØniques ont
ØtØ gØnØrØs dans lesquels LeEF-Ts a ØtØ sur- et sous-exprimØ de fa? on constitutive. mt
Cependant, l?altØration de l?expression du gŁne par transformation gØnØtique avec des
constructions sens et antisens de LeEF-Ts n?affecte pas la respiration et la production mt
d?ØthylŁne pendant la maturation et aprŁs blessure. De plus, l?expression du gŁne de
l?alternative oxydase qui est connue pour jouer un r? le important dans la respiration
climactØrique n?est pa affectØe. Toutes ces donnØes indiquent que malgrØ sa forte rØgulation
Le-EF-Ts n?est pas limitant de l?activitØ respiratoire mitochondriale. mt
L?expression du gŁne LeEF-Ts est stimulØe sous l?effet de stress oxydatifs mt
induits dans les parties vØgØtatives par la sŁcheresse et le paraquat. La sensibilitØ aux stress
oxydatifs ØvaluØe chez les feuilles par la prØsence de nØcrose et dans des cals par la croissance
cellulaire est rØduite chez les plantes antisens. Parmi les enzymes connues pour intervenir
dans la dØtoxication des espŁces rØactives d?oxygŁne, superoxide dismutase (SOD), catalases
(CAT), peroxydases (PX) et glutathion rØductases (GR), nous avons montrØ que la GR et les
PX ont une activitØ accrue chez les lignØes antisens permettant d?expliquer, au moins en
partie, leur meilleure tolØrance aux stress.
Le r? le de la protØine LeEF-Ts dans la synthŁse des protØines mt
mitochondriales a ØtØ ØtudiØ par une analyse du protØome mitochondrial de lignØes antisens et
sens pour le gŁne LeEF-Ts . La comparaison des protØomes des lignØes transformØes et mt
sauvage ØtØ abordØe ? l?aide d?une technique de double marquage 14N/15N appliquØe ? des
tissus de tomates cultivØs in vitro. Il appara?t que les lignØes sens sur-expriment fortement la
protØine alors que les lignØes antisens la sous-expriment faiblement. Une protØine de type
«heat-shock» accompagne les variations de LeEF-Ts suggØrant un r? le possible de mt
chaperonne. Par ailleurs, l?analyse globale du protØome mitochondrial fournit des donnØes
gØnØrales nouvelles sur un ensemble de prŁs de 500 protØines mitochondriales de tomate. Resume en Anglais 6
RESUME EN ANGLAIS
This thesis is related to the fonctionnal study of a gene encoding an elongation factor
LeEF-Ts in tomato. This gene participates in the protein synthesis process in mitochondria mt
and shows strong expression in ripening fruit as compared to other organs. We demonstrate
that it is strongly up-regulated during the first stages of the ripening process in parallel with
the climacteric rise in respiration and that its expression is stimulated by ethylene, wounding
and high temperature. However, ethylene-insensitive mutants exhibit rather high expression
indicating the presence of an important ethylene-independent regulation. Transgenic fruit
have been generated in which LeEF-Ts has been constitutively up and down-regulated. mt
However, altering the expression of the gene by genetic transformation with antisense and
sense LeEF-Ts constructs did not affect the pattern of respiration and ethylene production mt
during ripening and upon wounding. In addition, expression of the alternate oxidase gene
which is known to play an important role in respiratory climacteric was not affected. All these
data indicate that LeEF-Ts , despite its strong regulation, is not limiting of the mitochondrial mt
respiratory activity.
The expression of the LeEF-Ts gene is stimulated by oxidative stresses induced in mt
the vegetative parts of the plant by drought and paraquat. Sensitivity to stresses evaluated in
leaves by the presence of necrosis and in calluses by cellular growth was reduced in antisense
plants. Among the enzymes known for playing a role in the detoxication of reactive oxygen
species, superoxide dismutase (SOD), catalases (CAT), peroxydases (PX) and glutathion
reductases (GR), we have shown that GR and PX exhibit higher activity in antisense lines,
thus explaining, at least partly, a better tolerance to stress.
The role of the LeEF-Ts protein in the synthesis of mitochondrial proteins has been mt
studied through the analysis of the mitochondrial proteome of LeEF-Ts sense and antisense mt
lines. The comparison of the proteomes of the wild type and transformed lines ahas been
made using dual 14N/15N labelling applied to tissues cultured in vitro. It appeared that the
sense lines greatly over-express the protein while the antisense lines under-express lightly.
An heat-shock protein tightly follows the variations of the LeEF-Ts protein suggesting a mt
possible role of chaperon. A global analysis of the mitochondrial proteome has been
performed that provides new information on a set of around 500 mitochondrial proteins of
tomato. Resume en Portugais 7
RESUME EN PORTUGAIS
Esta tese Ø relacionada ao estudo funcional de um gene que codifica um fator de
elonga? ªo LeEF-Ts em tomate. Este gene participa no processo de s?ntese de prote?na em mt
mitoc? ndrias e apresenta uma forte expressªo durante o processo de matura? ªo quando
comparado a outros ? rgªos. N? s demonstramos que o mesmo se exprime fortemente durante
as primeiras fases do processo matura? ªo em paralelo com a crise respirat? ria climatØrica e
que sua expressªo Ø estimulada pelo etileno, ferimento e altas temperaturas. PorØm, os
mutantes de tomate insens?veis ao etileno, exibem uma expressªo normal. Frutos transgŒnicos
foram gerados, nos quais o LeEF-Ts foi aumentado ou inibido de uma forma constitutiva. mt
PorØm, a altera? ªo da expressªo do gene atravØs da transforma? ªo genØtica com constru? ıes
sentido e antisense do gene LeEF-Ts nªo afeta o padrªo de respira? ªo e produ? ªo de etileno mt
durante a matura? ªo e ap? s o ferimento. AlØm disso, a expressªo do gene da alternativa
oxidase, que Ø conhecida por apresentar um papel importante no climatØrio respirat? rio, nªo
foi afetada. Todos estes dados indicam que apesar de sua forte regula? ªo, o LeEF-Ts nªo Ø mt
limitante da atividade respirat? ria mitocondrial.
A expressªo do gene de LeEF-Ts Ø estimulada pelo efeito do estresse oxidativo mt
induzido nas partes vegetativas da planta pela seca e o paraquat. A sensibilidade ao estresse
oxidativo avaliado em folhas pela presen? a de necrose e em calos atravØs de crescimento
celular, foi reduzido em plantas antisentido. Entre as enzimas conhecidas por apresentar um
papel na detoxifica? ªo de espØcies reativas de oxigŒnio, super? xido dismutase (SOD),
catalases (CAT), peroxidase (PX) e glutation redutase (GR), n? s demostramos que a GR e PX
exibem atividade mais alta em linhas antisentido, explicando assim, pelo menos em parte, sua
melhor toler? ncia ao estresse.
O papel da prote?na de LeEF-Ts na s?ntese de prote?nas mitocondriais foi estudado mt
pela anÆlise do prote? ma mitocondrial em linhas antisentido e sentido do gene LeEF-Ts . A mt
compara? ªo dos prote? mas de linhas transformadas e selvagem foi tratado com a ajuda de
uma tØcnica de dupla marcagem 14N/15N aplicadas ? tecidos de tomate cultivados in vitro. A
linha sentido super expressa fortemente a prote?na, enquanto que as linhas antisentidos
diminuem ligeiramente. Uma prote?na do tipo ? heat-shock? segue as varia? ıes da prote?na
LeEF-Ts , sugerindo um poss?vel papel chaperona. Uma anÆlise global do prote? ma mt
mitocondrial foi executada, fornecendo novas informa? ıes sobre um conjunto de ao redor 500
prote?nas mitocondriais de tomate.
Breve Presentation Generale et Objectifs - 8 -
BREVE PRESENTATION GENERALE ET OBJECTIFS
De nombreuses Øtudes ont ØtØ consacrØes ? la dØtermination de la nature de la crise
climactØrique respiratoire et ? la comprØhension du r? le des mitochondries qui sont le siŁge de
la respiration. Une augmentation du flux de carbone via la glycolyse a ØtØ dØmontrØ pendant
la crise respiratoire associØe ? une importante augmentation d?ATP (Barker and Solomos,
1962). L?accroissement de la glycolyse est supposØ liØ ? l?activation de la
phosphofructokinase et de la pyrophosphate:fructose-6-phosphate phosphotranfØrase (Bennett
et al., 1987). Cependant la dØmonstration que l?activation de ces deux enzymes est
directement responsable de la crise climactØrique n?a jamais ØtØ apportØe. La crise respiratoire
a ØtØ Øgalement attribuØe ? l?accroissement de l?activitØ d?un oxydase alternative insensible au
cyanure (AOX) et au dØcouplage du transport des Ølectrons de la phosphorylation oxydative
de l?ATP (Solomos, 1977). Les gŁnes codant pour l?AOX (McIntosh, 1994) et une protØine de
dØcouplage (Laloi et al., 1997) ont ØtØ isolØs et l?expression de certains membres de ces
familles de gŁnes augmente au cours de la maturation. NØanmoins, l?implication directe de
ces gŁnes (protØines) dans la crise respiratoire n?a pas encore ØtØ dØmontrØe. De plus, il existe
une contradiction entre l?accroissement d?ATP et l?augmentation de l?activitØ des systŁmes
dits «dissipateurs d?Ønergie» que sont l?AOX et la protØine de dØcouplage qui, au contraire,
sont dØcouplØs des phosphorylations oxydatives et libŁrent uniquement de la chaleur.
Il est connu que la crise respiratoire est sous la dØpendance de l?ØthylŁne (Abeles,
1992). D?ailleurs, la suppression de la synthŁse d?ØthylŁne conduit ? une suppression de la
crise respiratoire chez le melon (Bower et al. 2002 ). La respiration induite par l?ØthylŁne a
ØtØ associØe ? la stimulation de la synthŁse de protØines codØes par le gØnome nuclØaire et
ciblØes vers la mitochondrie telles que l?AOX et la protØine de dØcouplage (Cruz-Hernandez
and Gomez-Lim, 1995; Considine et al., 2001). Puisque la mitochondrie est une organelle qui
ne synthØtise (Diolez et al., 1986) ni ne per? oit (Chen et al., 2002) l?ØthylŁne, la stimulation
de la respiration est donc dØpendante de l?importation de protØines et non de la stimulation de
sa propre machinerie.
Lors d?un criblage destinØ ? isoler des gŁnes rØpondant ? l?ØthylŁne dans des fruits de
tomate (Lycopersicon esculentum) un mRNA a ØtØ isolØ au laboratoire par ? differential
display? , appelØ initialement ER49 puis LeEF-Ts qui montre une homologie de sØquence mt,
avec les facteurs d?Ølongation de type Ts (EF-Ts) ? la fois de procaryotes et de mitochondries
d?eucaryotes (Zegzouti et al., 1999). BØnichou et al., (2003) ont montrØ que la protØine codØe
par ce gŁne est impliquØe dans l?Øchange de nuclØotides avec le facteur Tu (EF-Tu) en

Breve Presentation Generale et Objectifs - 9 -
rØgØnØrant le GDP en GTP et est capable des diriger la synthŁse de peptides in vitro. Le
fonctionnement de l?ensemble de la machinerie peut Œtre expliquØ de la fa? on suivante. Le
facteur d?Ølongation factor Tu (EF-Tu) facilite la liaison de l?aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) au
ribosome pendant le cycle de l?Ølongation de la biosynthŁse des protØines (Ravel et al., 1969).
AprŁs la liaison du aa-tRNA au site A du ribosome, EF-Tu catalyse l?hydrolyse du GTP, et
l?EF-Tu:GDP est libØrØ du ribosome. EF-Ts catalyse l?Øchange de nuclØotide en rØalisant la
formation de EF-Tu:GTP ? partir de EF-Tu:GDP (Miller and Weissbach, 1970). L?Øchange du
nuclØotide de guanine se fait via la formation d?un intermØdiaire correspondant au complexe
EF-Tu:Ts complex. Ensuite, le GTP remplace EF-Ts dans le complexe et le complexe EF-
Tu:GTP lie le aa-tRNA permettant un autre cycle de liaison au ribosome. Un schØma de cette
rØaction est prØsentØ dans la figure 1.
La dØcouverte du gŁne LeEF-Ts la dØmonstration de l?activitØ de la protØine mt,
correspondante et le fait que son expression soit stimulØe par l?ØthylŁne nous a conduit ?
rechercher son r? le fonctionnel chez la tomate. C?est pourquoi nous avons entrepris tout
d?abord une Øtude prØcise de son expression spatio-temporelle dans diffØrents organes de la
tomate en attachant une attention particuliŁre au fruit au cours de la maturation et aux effets
de l?ØthylŁne exogŁne et de stress abiotiques. Nous avons recherchØ les effets de la sur- et de
la sous-expression de ce gŁne sur l?activitØ respiratoire des fruits (Chapitre I). Nous avons
ensuite ØtudiØ les effets de stress abiotiques sur la physiologie des parties vØgØtatives de
plants de tomates affectØs par transgØnŁse dans l?expression de LeEF-Ts . Cette Øtude nous a mt
amenØ ? Øvaluer l?activitØ de plusieurs enzymes (Superoxyde dismutase, catalase, ga?acol
pØroxydase, glutation reductase) sous l?effet de divers stress abiotiques (Chapitre II). Enfin
nous avons entrepris une Øtude des modifications induites au niveau du protØome
mitochondrial, ce qui a exigØ l?obtention de mitochondries hautement purifiØes, l?application
de mØthodes de protØomique diffØrentielle utilisant le double marquage N14/N15 et
l?exploitation des rØsultats de protØomique par des mØthodes de bio-informatique (Chapitre
III).

Breve Presentation Generale et Objectifs - 10 -
Figure 1: Schematic representation of the function of EF-Ts (Ts) protein in promoting mt
the exchange of GDP to GTP for the activation of the EF-Tu (Tu) elongation factor. mt