Pour obtenir le grade de

Isabelle Schalk

Description

Niveau: Supérieur

• redaction

Thèse Pour obtenir le grade de Docteur de l'Université de Strasbourg Discipline : Chimie Présentée par : Verica VIDOVIC Institut de Chimie de Strasbourg (CNRS UMR 7177) Laboratoire de RMN et biophysique des membranes Production du peptide P-LAH4 chez E. coli et études par RMN de ses propriétés antibactérienne et de transfection d'ADN. Soutenue le 8 juillet 2011 devant la commission d'examen : Dr Isabelle SCHALK: Examinateur Pr. Catherine SARAZIN: Rapporteur externe Dr Antoine KICHLER: Rapporteur externe Pr. Burkhard BECHINGER: Directeur de thèse

• ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche


• poste d'allocataire de recherche


• fils romain


• spectroscopie rmn tridimensionnelles


• spectroscopie rmn

Sujets

• Redaction
• Sarazin
• Strasbourg
• Université de Strasbourg
• Atkinson
• Schalk
• Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche

Informations

• Publié par: profil-nechor-2012
• Publié le: 01 juillet 2011
• Nombre de lectures: 72
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 24 Mo

Extrait

Thèse

Pour obtenir le grade de

Docteur de l'Université de Strasbourg

Discipline : Chimie

Présentée par :

Verica VIDOVIC

Institut de Chimie de Strasbourg (CNRS UMR 7177)

Laboratoire de RMN et biophysique des membranes



Production du peptide P-LAH chez E. coli et 4
études par RMN de ses propriétés
antibactérienne et de transfection d’ADN.



Soutenue le 8 juillet 2011 devant la commission d'examen :

Dr Isabelle SCHALK: Examinateur

Pr. Catherine SARAZIN: Rapporteur externe

Dr Antoine KICHLER: Rapporteur externe

Pr. Burkhard BECHINGER: Directeur de thèse








Remerciements

Le travail présenté dans ce manuscrit a été réalisé au sein du laboratoire de RMN et de
biophysique des membranes (CNRS, UMR 7177) à Strasbourg. Je remercie le Pr. Burkhard
Bechinger de m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et pour la grande liberté dont j’ai
bénéficié durant ces quatre années.
Je remercie le Ministère de l’enseignement Supérieur et de la Recherche qui a financé
cette thèse en m'accordant un poste d'allocataire de recherche et de moniteur.

Isabelle Schalk, Catherine Sarazin et Antoine Kichler ont accepté d’évaluer ce travail.
Qu’ils y trouvent toute ma gratitude.
Je tiens à remercier Sebastiaan, pour m’avoir encadré durant la première année,
d’avoir été toujours disponible par la suite, et de m’avoir soutenu jusqu’au bout.
Je remercie également Philippe et Jésus pour m’avoir initié à la spectroscopie RMN
et Arnaud pour son encadrement durant les expériences de spectroscopies optiques ainsi que
pour sa bonne humeur et son humour.
Un grand merci aussi à Christopher, pour s’être intéressé à mon travail de thèse et pour
sa grande disponibilité.
Merci aussi au reste de l’équipe : Marc, Barbara, Delphine, Elise, Evgeniy, …et à toi
Caroline un grand Merci, pour avoir toujours été là pour me faciliter les tâches administratives
et notamment depuis mon départ de Strasbourg.
Mes remerciements vont aussi au Dr Andrew Atkinson qui m’a initié à la
spectroscopie RMN tridimensionnelles et qui a commencé le projet de détermination de
structure tridimensionnelle de P-LAH avec moi. 4
Pour finir, merci à toute ma famille (Mama, Tata, Antonia, Velemir i Valerija), à
Joëlle et à Daniel, pour leur soutien et tout particulièrement à mon fils Romain pour ses fous
rires et ses sourires qui ont rendu cette période de rédaction plus joyeuse !










A mon Fils Romain,






































1 Chapitre 1 : Introduction 1
1 1.1 Contexte de l’étude
1 1.1.1 La thérapie génique
1.1.1.1 Définition et principe 1
1.1.1.2 Les vecteurs non viraux de la thérapie génique 1
12 1.1.2 Les peptides antimicrobiens
1.1.2.1 Introduction 12
1.1.2.2 Les différents modèles de mécanismes d’actions des peptides 14
antibactériens

18 1.1.3 LAH4 : un peptide multifonctionnel
1.1.3.1 Caractéristiques structurales de LAH 18 4
1.1.3.2 Interactions du peptide LAH avec les membranes 20 4
1.1.3.3 Interactions avec l’ADN et transfection 22
28 1.2 Objectif et contribution du travail de thèse

2 Chapitre 2 : Théorie 29
29 2.1 Stratégie d’expression d’une protéine hétérologue chez E.
coli
30 2.1.1 Le vecteur d’expression
32 2.1.2 Régulation de l’expression de la protéine d’intérêt
35 2.1.3 Paramètres responsables du niveau d’expression de la
protéine hétérologue

2.1.3.1 La nature du gène à exprimer 35
2.1.3.2 La stabilité de l’ARNm 36
2.1.3.3 Dégradation de la protéine par les protéases 37
38 2.1.4 Localisation de la protéine exprimée
39 2.1.5 Les partenaires de fusion




2.2 La résonance magnétique nucléaire 41
41 2.2.1 Le phénomène de résonance magnétique nucléaire
2.2.1.1 Spin nucléaire et moment magnétique associé 41
2.2.1.2 Noyaux de spin I=1/2 dans un champ magnétique 42
2.2.1.3 Signal RMN 44
47 2.2.2 Les interactions nucléaires
2.2.2.1 Interaction de déplacement chimique 49
2.2.2.2 Couplage dipolaire : interaction spin-spin direct 52
2.2.2.3 Couplage scalaire : interaction spin-spin indirect 54
2.2.2.4 Interaction quadripolaire 54
54 2.2.3 Les expériences RMN du solide
2.2.3.1 Les échantillons orientés 54
2.2.3.2 Les expériences RMN statiques 58
2.2.3.3 Les expériences RMN en rotation à l’angle magique 62

3 Chapitre 3 : clonage, expression et purification du 73
peptide P-LAH 4

3.1 Introduction 73
75 3.2 Résultats préalables
76 3.3 Expression de LAH avec la GST comme partenaire de 4
fusion : effet des charges négatives sur l’expression
76 3.3.1 Introduction
76 3.3.2 Matériel et méthodes
86 3.3.3 Résultats et discussions
90 3.4 Expression de LAH avec TAF12 comme partenaire de 4
fusion



90 3.4.1 Matériel et méthodes
94 3.4.2 Résultats et discussions
103 3.5 P-LAH : agent antibactérien et transfectant d’ADN 4
103 3.5.1 Matériel et méthodes
104 3.5.2 Résultat et discussions
106 3.6 Conclusions

4 Chapitre 4 : attribution RMN et structure 109
secondaire du peptide P-LAH en milieu micellaire 4

109 4.1 Introduction
110 4.2 Matériel et méthodes
4.2.1 Méthodes 110
4.2.1.1 Attribution des résonances du squelette peptidique 111
4.2.1.2 Détermination de la structure secondaire du peptide P-LAH 117 4
120 4.2.2 Matériel
15 134.2.2.1 Marquage uniforme du peptide P-LAH en N et en C 120 4
4.2.2.2 Préparations des échantillons RMN 121
4.2.2.3 Expériences RMN 121
4.2.2.4 Expériences de dichroïsme circulaire 122
122 4.3 Résultats et discussions
4.3.1 Attribution du squelette peptidique 122
4.3.2 Identification de la structure secondaire et prédiction d’angles 128
136 4.4 Discussions










5 Chapitre 5 : Etude de l’orientation et de la 139
structure du peptide P-LAH dans les bicouches de 4
POPC par RMN du solide

139 5.1 Introduction
139 5.2 Matériel et méthodes
139 5.2.1 Préparation des échantillons RMN orientés
141 5.2.2 Acquisition des spectres RMN
142 5.3 Résultats
142 5.3.1 Structure et topologie du peptide P-LAH dans les bicouches 4
orientées de POPC à pH=5,5.

146 5.3.2 Structure et topologie du peptide P-LAH dans les bicouches 4
orientées de POPC à pH=6,9.

151 5.4 Discussions

6 Chapitre 6 : Etudes des interactions entre le 155
peptide LAH et l’ADN par expérience REDOR 4

155 6.1 Introduction
158 6.2 Matériel et méthodes
158 6.2.1 Synthèse peptidique
160 6.2.2 Préparation des complexes P-LAH4/ADN de sperme de
saumon pour la RMN du solide

15 31 161 6.2.3 Expérience N- P REDOR
164 6.3 Résultats et discussions
15 31 164 6.3.1 Mesure des distances N- P par REDOR sur le diéthyl-N-
phényl-phosphoramidate




167 6.3.2 Etude des interactions ADN/P-LAH avec le peptide marqué 4
15uniformément en N

172 6.3.3 Etude des interactions ADN-LAH avec le peptide marqué 4
spécifiquement sur une lysine à la fois

15 316.3.3.1 Contact entre les noyaux N-Lysine et les noyaux P de l’ADN 174
pour les résidus K1 du peptide LAH à pH= 5,5 4

15 316.3.3.2 Contact entre les noyaux N-Lysine et les noyaux P de l’ADN 176
pour les résidus K2 du peptide LAH à pH= 5,5 4

15 316.3.3.3 Contact entre les noyaux N-Lysine et les noyaux P de l’ADN 177
pour les résidus K24 du peptide LAH à pH= 5,5 4

15 316.3.3.4 Contact entre les noyaux N-Lysine et les noyaux P de l’ADN 179
pour les résidus K25 du peptide LAH à pH= 5,5 4

180 6.4 Discussions
180 6.4.1 Etude des interactions ADN/P-LAH avec le peptide marqué 4
15uniformément en N

181 6.4.2 Etude des interactions ADN-LAH avec le peptide marqué 4
spécifiquement sur une lysine à