Présentée l'Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé de

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
THESE Présentée à l'Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé de l'Université Louis Pasteur de Strasbourg pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG I par Philip ROBINSON Cancer du col de l'utérus: Adressage tumoral et définition de ligands peptidiques de l'oncoprotéine E6 de HPV16. Soutenue le 18 Mars 2005 devant la commission d'examen: Daniel BATY Rapporteur externe Marie-Pierre GAUB Rapporteur interne Claude KEDINGER Examinateur Christiane MOUGIN Rapporteur externe Georges ORFANOUDAKIS Directeur de thèse Gilles TRAVE Examinateur

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Publié le 01 mars 2005
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Langue Français
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THESE
Présentée à l’Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé de
l’Université Louis Pasteur de Strasbourg pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG I
par
Philip ROBINSON
Cancer du col de l’utérus: Adressage tumoral et
définition de ligands peptidiques
de l’oncoprotéine E6 de HPV16.
Soutenue le 18 Mars 2005 devant la commission d'examen:
Daniel BATY Rapporteur externe
Marie-Pierre GAUB Rapporteur interne
Claude KEDINGER Examinateur
Christiane MOUGIN
Georges ORFANOUDAKIS Directeur de thèse
Gilles TRAVE ExaminateurA Sophie
2REMERCIEMENTS
Je remercie l'Entente Cordiale Scholarships Trust, le Collège Doctoral Européen de
Strasbourg ainsi que l'Association pour la Recherche sur le Cancer pour m'avoir soutenu
financièrement durant la période de mes études doctorales au sein de l'équipe Oncoprotéines
de l'UMR7100. Je remercie particulièrement Madame Nicole Béa du Service Culturel de
l'Ambassade de France à Londres.
J'exprime ma reconnaissance à tous les membres du jury de thèse: Dr Daniel Baty, Dr
Marie-Pierre Gaub, Pr Claude Kedinger, Pr Christiane Mougin, Dr Georges Orfanoudakis et
Dr Gilles Travé, qui ont bien voulu me faire l'honneur de consacrer de leur temps à l'examen
de ce travail.
Je voudrais remercier mon directeur de thèse, Dr Georges Orfanoudakis, pour ces
conseils pendant tout mon parcours dans son laboratoire.
Merci à mes collègues Dr Murielle (dur-dur) Masson, Dr Tutik (-frutti) Ristriani et
Herr Sebastian (-c'est bien) Charbonnier avec qui j'ai eu l'honneur de partager le bureau D-
304. Merci pour les discussions et les rires que l'on a partagé, votre soutien dans les pires
moments et la collection de calendriers.
Je remercie egalement toute l'équipe Oncoprotéine ainsi que l'UMR 7100 qui m'ont
soutenu dans mes démarches. Je remercie le Dr Gilles Travé pour nos discussions sur le sujet
délicat de la structure des protéines E6 et de p53, Dr François Deryckère pour m'avoir initié
aux technologies de microscopie et de culture cellulaire, Pr Etienne Weiss pour ses conseils
dans l'utilisation du film Saran et nos discussions du samedi matin, Dr Dominique Desplancq
pour ses conseils, Dr Annie-Paul Sibler pour son aide, Dr Marc Van Regenmortel pour son
aide avec la rédaction d'article et Mr Georges Schwalbach pour les nombreuses bouteilles de
LB qui m'ont si souvent dépanné. Mme Géraldine Kœnig, Mlle Denise Stuber et Mr Philip
Tedbury, avec qui j'ai collaboré toute au long de mes études doctorales, je les remercie tout
particulièrement pour leur aide si précieuse et leur sympathie. Merci à Mlle Magali Lagrange
avec qui j'ai fait tout mon parcours de 3e cycle, merci pour ton amitié.
3Merci à mes amies de Strasbourg, Blois, Bruxelles, Rome, Glasgow, Leicester et
Londres pour me permettre de passer des super vacances dans des endroits aussi éloignés que
Strasbourg, Blois, Bruxelles, Rome, Glasgow, Leicester, et Londres! Merci Vinaï, Antoine,
Stephan, David, Maïa, Philippe, Yolane, Giuseppe, Aline, Julie, Catriona, Alice, Gavin,
Helen, Bertie, Fiona. Merci à vous pour votre soutien et votre amitié.
Merci également au Dr Eric Blair de l'université de Leeds sans qui je n'aurais peut-être
pas pu venir ici à Strasbourg faire mes études de 3e cycle. Je lui suis profondément
reconnaissant pour toute l'aide qu'il m'a fournie au fils des années.
4ABBREVIATIONS
BSA Bovine serum albumin
cDNA complementary DNA
CDK Cyclin-dependant kinase
CDR Complementarity determining regions
cfu Colony forming units
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DNA Deoxyribonucleic acid
dsDNA double stranded DNA
DT Diphtheria Toxin
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EGFP Enhanced green fluorescent protein
Fab Antigen-binding fragment
FACS Flow assisted cell sorting
FCS Fœtal calf serum
FIGO Féderation Internationale de Gynécologie et d'Obstetrique
GST Glutathione-S-transferase
HPV Human papilloma virus
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
IgG Immunoglobin, class G
KDa Kilo Dalton
Kbp Kilo base pair
M13 M13 filamentous phage
mAb monoclonal antibody
MBP Maltose-binding protein
min Minutes
mRNA Messenger RNA
NP-40 Nonidet P40
ORF open reading frame
pIII / pVIII M13 phage minor coat protein III and major coat protein VIII
PBS Phosphate-buffered saline
PCR Polymerase Chain Reaction
5PEI Polyethylenimine
PVC Polyvinyl chloride
scFv Single-chain variable region fragment
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamid gel electrophoresis
ssDNA single stranded DNA
TBS Tris-buffered saline
TMB 3-3,5,5'-tetramethylbenzidine
TNF Tumour necrosis factor
TRITC Tetramethylrhodamine isothiocyanate
tu Transducing units
UV Ultra-violet
6Amino acids
A Ala Alanine
C Cys Cysteine
D Asp Aspartic acid
E Glu Glutamic acid
F Phe Phenylalanine
G Gly Glycine
H His Histidine
I Ile Isoleucine
K Lys Lysine
L Leu Leucine
M Met Methionine
N Asn Asparagine
P Pro Proline
Q Gln Glutamine
R Arg Arginine
S Ser Serine
T Thr Threonine
V Val Valine
W Trp Tryptophane
Y Tyr Tyrosine
Cell lines
SiHa cells Derived from human squamous cell cervical carcinoma
Contain an integrated HPV 16 genome
HeLa cells Derived from human cervical epithelial cell adenocarcinoma
Contain HPV-18 sequences
CaSki cells Derived from a metastatic site (small intestine) of an epidermoid carcinoma
Saos-2 cells Derived from an osteosarcoma
p53 null
H1299 cells Derived from a metastatic site (lymph node) of a non-small cell lung carcinoma
p53 null
7TABLE OF CONTENTS
RESUME EN FRANCAIS 11
GENERAL INTRODUCTION 20
1. Cervical cancer 21
2. Cancer: the cell cycle and apoptosis 25
2.1 The cell cycle 25
2.2 Rb and the p53 family 26
2.3 Degradation of the cell cycle regulatory proteins 31
3. HPV and cancer 35
3.1 HPV life cycle in epithelial cells 35
3.1.1 Genomic arrangement and protein products of HPVs 36
3.1.1.1 Early gene products 37
3.1.1.2 Late gene products 38
3.1.2 The HPV virion and infection of epithelial cells 39
3.2 E6 and E7-mediated cellular immortalization 40
3.2.1 E7 40
3.2.1.1 The E7 protein 40
3.2.1.2 Disruption of cell cycle control and episomal maintenance 40
3.2.1.3 E7 and genomic instability 42
3.2.1.4 E7 degradation 42
3.2.2 E6 43
3.2.2.1 The E6 protein 43
3.2.2.2 Cellular partners of E6 43
3.2.2.2.1 Proteins interacting through a "charged leucine motif" 44
3.2.2.2.1.a E6-AP 44
3.2.2.2.1.b E6BP 46
3.2.2.2.1.c MCM7 46
3.2.2.2.1.d Paxillin 46
3.2.2.2.1.e TNF R1 47
3.2.2.2.2 PDZ domain proteins 48
3.2.2.2.3 Other proteins 49
3.2.2.2.3.a p300/CBP 49
3.2.2.2.3.b Tyk and IRF-3 50
3.2.2.2.3.c Bak 50
3.2.2.2.3.d E6 binding to myc, expression of hTERT and telomerase activity 50
3.2.2.3 Degradation of E6 51
3.3 E6 and E7-mediated cellular immortalization: conclusion 53
84. Introduction of the research projects 54
5. Phage display 55
5.1 Introduction 55
5.2 Biopanning and M13 phage 55
5.2.1 Biopanning, the principle of phage display selection 55
5.2.2 M13 phage display vectors 56
5.3 Applications of phage display 58
5.3.1 Protein display 58
5.3.1.1 Antibodies 58
5.3.1.2 Enzymes 59
5.3.2 Peptide display 60
5.3.2.3.1 Antibody epitopes 60
5.3.2.3.2 Enzyme ligands 62
5.3.2.3.3 Intracellular protein interactions 62
5.3.2.3.4 Tumour targeting 64
6. Other genotype-phenotype methods used for screening combinatorial libraries 66
6.1 Two-hybrid systems 66
6.2 Bacteria display 66
6.3 Ribosome and mRNA-protein display 68
RESEARCH PROJECTS 69
7. Article A: Identification using phage display of peptides promoting targeting and
internalization into HPV-transformed cell lines. 70
7.1 Scientific context 70
7.2 Introduction and rational of experimental design 71
7.3 Article A: Identification using phage display of peptides promoting targeting and internalisation into
HPV-transformed cell lines 73
7.4 Discussion 83
7.4.1 Specificity 83
7.4.2 Constraint 83
7.4.3 Valency and presentation 84
7.4.3.1 Multivalent phagemid particle presentation 84
7.4.3.2 Monovalent GFP presentation 85
7.5 Perspectives: peptide-mediated delivery of therapeutic agents 86
7.5.1 Bacterial toxins, drugs and pro-apoptotic peptides 88
7.5.1.1 Bacterial toxins and drugs 88
7.5.1.2 Pro-apoptotic peptides 88
7.5.2 Targeting vehicles (non-viral and viral vectors) 89
7.5.2.1 Liposomes 89
7.5.2.2 Synthetic polymers and proteins 90
7.5.2.3 Viruses 91
7.6 Perspectives: defining the targeted cellular receptor(s) 92
98. Diphtheria toxin 93
8.1 Introduction 93
8.2 Materials and Methods 96
8.2.1 Preparation of bacterial expression vectors 96
8.2.2 Bacterial expression and purification of recombinant diphtheria toxin 96
8.2.3 Immunofluorescence microscopy 97
8.2.4 Maturation of diphtheria toxin by furin proteolysis 97
8.3 Results 99
8.4 Discussion 99
8.5 Conclusion 102
9. Manuscript B: Distinct regions within p53 core domain control E6-dependent and E6-
independent p53 cellular degradation processes 103
9.1 Abstract 103
9.2 Introduction 104
9.3 Materials and methods 105
9.5 Results 113
9.6 Discussion 118
GENERAL CONCLUSION 123
REFERENCES 127
APPENDIX 145
Comparative properties of two peptide-antibody interactions as deduced from epitope delineation.
Laurence Choulier, Georges Orfanoudakis, Philip Robinson, Daniel Laune, Myriam Ben Khalifa,
Claude Granier, Etienne Weiss and Danièle Altschuh.
Journal of Immunological Methods 2002
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