Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux (Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis) dans deux races ovines, INRA 401 et Barbados Black Belly

Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux (Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis) dans deux races ovines, INRA 401 et Barbados Black Belly

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8

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1 N° d'ordre : 2346 THESE présentée pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE ÉCOLE DOCTORALE : SCIENCES ECOLOGIQUES, VETERINAIRES, AGRONOMIQUES ET BIOINGENIERIES Spécialité : Qualité et Sécurité des Aliments Par Mlle Caroline LACROUX Titre de la thèse Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux (Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis) dans deux races ovines, INRA 401 et Barbados Black Belly Soutenue le 15 Juin 2006 devant le jury composé de : M. Alain MILON Président MM. Philippe DORCHIES Directeur de thèse Jacques CABARET Rapporteur Christophe CHARTIER Rapporteur Jimmy DUNCAN Membre Philippe JACQUIET Membre

  • table des matières

  • population parasitaire chez l'hôte

  • réponse immunitaire

  • œufs de strongles dans les matières fécales

  • reponse immunitaire des ovins face aux strongles gastro


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Ajouté le 01 juin 2006
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Langue Français
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N° d’ordre : 2346







THESE


présentée

pour obtenir

LE TITRE DE DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE



ÉCOLE DOCTORALE : SCIENCES ECOLOGIQUES, VETERINAIRES, AGRONOMIQUES ET BIOINGENIERIES

Spécialité : Qualité et Sécurité des Aliments


Par Mlle Caroline LACROUX



Titre de la thèse Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux
(Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis) dans
deux races ovines, INRA 401 et Barbados Black Belly


Soutenue le 15 Juin 2006 devant le jury composé de :


M. Alain MILON Président

MM. Philippe DORCHIES Directeur de thèse
Jacques CABARET Rapporteur
Christophe CHARTIER Rapporteur
Jimmy DUNCAN Membre
Philippe JACQUIET Membre
1
REMERCIEMENTS


Et bien voilà, ce manuscrit est (quasiment) bouclé et c’est, comme toujours, au dernier
moment et dans l’urgence, qu’il faut peauffiner les dernières bricoles et en particulier
les remerciements. Au final, c’est toujours la partie la plus baclée. Mais bon, on va
essayer d’oublier personne…

A Philippe, pour ces quelques années de parasitologie, d’immunologie, de statistiques…
Ouf, on y est arrivés… Merci de mettre des points au milieu de mes phrases trop longues
et d’enlever tous les adverbes superflus. Néanmoins, toutefois et donc, enfin, merci
pour tout… La bouteille de champagne du Vet Research est encore au frigo, c’est quand
tu veux…

A Mr Dorchies, pour son enthousiasme constant et sans faille vis à vis de ce travail,
pour ses conseils judicieux, ses corrections entre la France et le Maroc…

A tout le laboratoire de parasitologie de l’ENVT : Françoise, Christelle, Jean-Paul …
Merci pour votre disponibilité, votre bonne humeur et votre aide au cours de ces
quelques années.

A Getachew, heureusement que tu sais quand il faut mettre « the » ou non avant les
mots, et merci pour ton aide dans les manips. Bon courage pour la tienne de thèse, mais
je ne me fais pas trop de souci…

A tous les membres du domaine expérimental de Bourges-La Sapinière : Jean Claude
Brunel, Yves Bourdillon, Hervé Morin, Thierry Fassier, Didier Marcon, Serge Py,
Eric Thévenot, Alain Burtin, Jérôme Bernard, Bruno Bouquet,Stéphane Gressin…

A l’équipe de parasitologie de Tours : Jacques Corté, Christine Sauvé et surtout Lucas
Gruner, pour votre aide lors de notre première grosse manip…

A Dominique François, pour une logistique parfaite d’expédition de moutons vers
Toulouse.

A Jacques Bouix, pour ses conseils avisés en matière de génétique lors des CSU de
Bourges.

A Sèv, Cécile, Pierrette et Cindy, merci de vous occuper de tout ce que je n’ai pas le
temps de faire en général, merci pour votre soutien durant cette difficile (et longue)
période de rédaction, pour les excursions vers la boulangerie entre midi et deux (plutôt
deux d’ailleurs), pour les extases devant les estampes japonnaises de caillettes colorées
au Giemsa (j’en veux un de tatouage…), pour l’écriture des cassettes (oui, je sais,
dorénavant on ne prendra que celles où ça écrit bien…). Bref, heureusement que vous
êtes là… Toutefois, je me demande encore s’il vaut mieux trois ou quatre roues !!!
2

A mon très cher et respecté « collègue de bureau », qui subit ma mauvaise humeur
fréquente et mes coups de gueule. En (maigre) contre-partie je réponds au téléphone (!),
c’est déjà ça. Trève de plaisanteries, sans vous je ne serais pas là. Merci pour tout et à
nos futurs vaches, chèvres et moutons…

A Paul Cabanié, professeur classé « X » comme il dit…, pour m’avoir délesté de matinées
d’autopsie quand j’étais trop à la bourre. Il n’y a que vous que je peux appeler à 9h45
pour me remplacer au pied levé à 10h00… Promis, l’année prochaine je rendrai tous mes
jours : bonne chasse…

Merci aux Poupou’s (Poupou I, Poupou II La Peste, le petit Blackou, la Crevette… mais
quand va t-on s’arrêter ?) et à vos biberons du soir qui clôturaient souvent mes journées
d’ordinateur…

A toute ma (grande) famille, mes parents et mon frère (Monsieur « Table des
matières »), qui y ont toujours cru et m’ont toujours soutenue. Merci de m’avoir toujours
laissé faire tout ce qui me passait par la tête. Avec tout mon amour…

Enfin et surtout, à Olivier, ma « pleine lune à moi »…Sans toi je ne serais jamais arrivée
au bout. Heureusement que tu as des solutions à tout (faire marcher des PCR bourrées
d’inhibiteurs, des anticorps sans bruit de fond…)… Grumpfff…

3
SOMMAIRE


CHAPITRE I : PREAMBULE ............................................................................................8
CHAPITRE II : CONTEXTE BIBLIOGRAPHIQUE .....................................................10
1. GENERALITES SUR LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX DES OVINS.........................11
1.1. Classification et critères d’identification des Trichostrongles gastro-intestinaux des
ovins.............................................................................................................................11
1.2. Le cycle biologique des Trichostrongles gastro-intestinaux....................................13
1.3. Les deux espèces de Trichostrongles utilisées comme modèles dans nos travaux
expérimentaux : Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis...................15
1.3.1. Haemonchus contortus et l’haemonchose ovine...............................................15
1.3.2. Trichostrongylus colubriformis et la trichostrongylose ovine...........................17
2. MOYENS DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX ...........................20
2.1. Les anthelminthiques et leur mode d’action............................................................20
2.2. Les limites d’utilisation des anthelminthiques ........................................................22
2.3. La résistance aux anthelminthiques : définition et mécanismes...............................22
2.4. Prévalence de la résistance aux anthelminthiques..................................................24
3. METHODES ALTERNATIVES DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX
.........................................................................................................................................26
3.1. Tarir les sources de contamination.........................................................................27
3.1.1. La gestion raisonnée des pâturages..................................................................27
3.1.2. Les champignons et bactéries nématophages ...................................................28
3.2. Augmenter la résistance de l’hôte ..........................................................................29
3.2.1. La vaccination.................................................................................................29
3.2.2. Interactions nutrition-parasitisme ....................................................................33
3.2.3. La sélection de la résistance aux nématodes gastro-intestinaux ........................35
4. LA REPONSE IMMUNITAIRE DES OVINS FACE AUX STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX .49
4.1. Organisation générale de la réponse immunitaire..................................................49
4.2. La réponse immunitaire innée ................................................................................49
4.3. La réponse immunitaire adaptative ........................................................................51
4.3.1. Présentation des antigènes parasitaires et initiation de la réponse immunitaire
adaptative .................................................................................................................52
4.3.2. Orientation de la réponse immunitaire : Th ou Th ?.......................................54 1 2
4
4.3.3. Mise en place et rôle des effecteurs de l’immunité dans les strongyloses gastro-
intestinales................................................................................................................58
4.3.4. Conséquences de la réponse immunitaire adaptative sur les traits de vie des
parasites : manifestations de l’immunité et régulation des populations de strongles ...70
4.3.4.1. Manifestations de l’immunité contre les nématodes parasites adultes........70
4.3.4.2. Manifestations de l’immunité contre les larves de nématodes parasites .....71
4.3.5. Régulation de la réponse immunitaire..............................................................73
4.3.5.1. Induction de types cellulaires immunomodulateurs par les strongles gastro-
intestinaux.............................................................................................................73
4.3.5.2. Production de molécules parasitaires immunomodulatrices.......................75
CHAPITRE III : OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE..........................................79
CHAPITRE IV : LES PROCEDURES EXPERIMENTALES (OUTILS
METHODOLOGIQUES) ..................................................................................................82
1. MODELES EXPERIMENTAUX.........................................................................................83
1.1. Les animaux...........................................................................................................83
1.1.1. Ovins de race INRA 401 .................................................................................83
1.1.2. Ovins de race Barbados Black Belly................................................................83
1.1.3. Age et sexe des animaux .................................................................................84
1.2. Les parasites..........................................................................................................84
1.3. Infestations expérimentales ....................................................................................84
2. ETUDE DES POPULATIONS PARASITAIRES .....................................................................85
2.1. Comptage des œufs de strongles dans les matières fécales .....................................85
2.2. Mise en culture in vitro des œufs de Haemonchus contortus...................................86
2.3. Etude quantitative et qualitative de la population parasitaire chez l’hôte (bilans
parasitaires) .................................................................................................................87
2.4. Etude de la fécondité des femelles parasitaires adultes...........................................87
3. ETUDE DE PARAMETRES PHYSIOPATHOLOGIQUES CHEZ L’HOTE .................................88
3.1. Suivi de l’éosinophilie sanguine .............................................................................88
3.2. Suivi de l’hématocrite ............................................................................................88
4. ETUDE DE L’ORIENTATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE...........................................89
4.1. Principe de la PCR quantitative.............................................................................89
4.2. Du tissu à l’ARN….................................................................................................90
5
4.3. Isolement des cellules CD4 positives du nœud lymphatique abomasal pour
extraction spécifique des ARN de cette fraction cellulaire.............................................91
4.4. De l’ARN à l’ADN complémentaire (ADNc)… .......................................................92
4.5. PCR quantitative....................................................................................................92
5. EXPLORATION DE LA REPONSE HUMORALE GENERALE GENERALE ET LOCALE............94
5.1. Collecte des prélèvements ......................................................................................94
5.2. Préparation des antigènes......................................................................................94
5.3. Détermination des conditions optimales pour l’ELISA ...........................................95
5.4. Technique ELISA ...................................................................................................98
6. ETUDE DE LA REPONSE CELLULAIRE LOCALE ..............................................................98
6.1. Histologie conventionnelle et immunohistochimie sur coupes en paraffine .............99
6.1.1. Collecte des prélèvements ...............................................................................99
6.1.2. Technique histologique ...................................................................................99
6.1.3. Colorations à l’Hémalun/Eosine et au Giemsa .................................................99
6.1.4. Immunohistochimie sur coupes en paraffine..................................................101
6.2. Immunohistochimie sur coupes en congélation.....................................................102
6.2.1. Collecte et technique des prélèvements..........................................................102
6.2.2. Immunohistochimie.......................................................................................102
7. ETUDE DE LA LYMPHOPROLIFERATION SPECIFIQUE D’ANTIGENES PARASITAIRES.....103
7.1. Principe ...............................................................................................................103
7.2. Technique ............................................................................................................104
7.2.1. Préparation des cellules .................................................................................104
7.2.2. Mise en culture et stimulation des cellules mononucléées..............................104
7.3. Interprétation des résultats ..................................................................................105
8. ANALYSES STATISTIQUES ...........................................................................................105
CHAPITRE V : RESULTATS.........................................................................................107
PARTIE I : ETUDE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE CHEZ DES
AGNEAUX DE RACE SENSIBLE, INRA 401, INFESTES PAR H. CONTORTUS OU T.
COLUBRIFORMIS...........................................................................................................108
ARTICLE I :HAEMONCHUS CONTORTUS (NEMATODA : TRICHOSTRONGYLIDAE) INFECTION
IN LAMBS ELICITS AN UNEQUIVOCAL TH IMMUNE RESPONSE........................................111 2
6
ANNEXE A L’ARTICLE « HAEMONCHUS CONTORTUS (NEMATODA :
TRICHOSTRONGYLIDAE) INFECTION IN LAMBS ELICITS AN UNEQUIVOCAL TH IMMUNE 2
RESPONSE »....................................................................................................................127
ARTICLE II : IMMUNE RESPONSES IN LAMBS INFECTED WITH TRICHOSTRONGYLUS
COLUBRIFORMIS..............................................................................................................131
PARTIE II : ETUDE COMPARATIVE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE
ADAPTATIVE CHEZ DES AGNEAUX DE RACE RESISTANTE, BARBADOS
BLACK BELLY, ET DE RACE SENSIBLE, INRA 401, INFESTES PAR H.
CONTORTUS....................................................................................................................165
ARTICLE III : DYNAMICS OF THE ADAPTIVE IMMUNE RESPONSE TO HAEMONCHUS
CONTORTUS IN SUSCEPTIBLE INRA 401 AND RESISTANT BARBADOS BLACKBELLY LAMBS
.......................................................................................................................................167
CHAPITRE VI : DISCUSSION GENERALE................................................................197
1. REGULATION DES POPULATIONS DE NEMATODES CHEZ L’HOTE.................................198
1.1. Variations selon le parasite au sein de la race INRA 401 .....................................198
1.2. Variations selon la race pour un même parasite : Haemonchus contortus............199
2. L’IMPLICATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE DANS LA REGULATION DES
POPULATIONS DE NEMATODES GASTRO-INTESTINAUX....................................................200
2.1. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon l’espèce de
parasite considérée.....................................................................................................200
2.2. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon la race ovine
considérée ..................................................................................................................202
2.3. Rôle des mécanismes effecteurs dans la protection contre les nématodes gastro-
intestinaux ..................................................................................................................202
3. PERSPECTIVES DANS LA COMPREHENSION DE LA RESISTANCE ...................................205
3.1. Le rôle de la réponse immunitaire innée...............................................................205
3.2. Régulation de la réponse immunitaire adaptative.................................................206
3.3. L’exploration de la résistance : aspects génétiques et identification de gènes
candidats ....................................................................................................................207
4. CONCLUSION..............................................................................................................208
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................210

7 Préambule

















CHAPITRE I : PREAMBULE



















8 Préambule

Un problème économique … et scientifique





La compréhension des mécanismes de résistance de certaines races ovines aux nématodes
gastro-intestinaux représente un véritable défi scientifique avec des conséquences
économiques non négligeables dans le contexte actuel d’extension des résistances aux
principales molécules anthelminthiques dans les populations parasitaires. En effet, une
meilleure connaissance de la réponse immunitaire des ovins (dont l’implication est supposée
dans la protection contre les strongles chez des individus résistants) pourrait permettre à
l’avenir de développer de nouvelles méthodes de lutte, comme la sélection d’animaux
résistants ou la mise en place de schémas de vaccination efficaces et applicables à large
échelle.
Notre travail de thèse a ainsi principalement concerné la caractérisation et l’étude de la
dynamique de la réponse immunitaire adaptative i) des ovins infestés soit par Haemonchus
contortus, soit par Trichostrongylus colubriformis, et ii) les effets de cette réponse dans la
régulation des populations de ces nématodes. Dans un premier temps, notre étude a été
réalisée dans une race ovine (INRA 401) considérée comme sensible à ces deux espèces de
strongles. Puis, dans un second temps, nous avons comparé les éléments de la réponse
immunitaire adaptative entre cette race et une race « tropicale » (Barbados Black Belly)
considérée comme résistante.

Ce travail conduit au laboratoire de Parasitologie de l’UMR 1225 INRA/Ecole Nationale
Vétérinaire de Toulouse est divisé en trois grandes parties. La première partie est un rappel
bibliographique sur les deux nématodes utilisés comme modèles, les solutions de lutte
envisagées comme alternatives aux traitements anti-parasitaires et les connaissances actuelles
de la réponse immunitaire dans les strongyloses gastro-intestinales. Dans une deuxième partie
sont exposés les principaux outils méthologiques utilisés et les résultats de nos travaux. Ces
derniers sont présentés sous la forme de trois articles. Enfin, une discussion générale, au sein
de laquelle sont également envisagées les perspectives pour la poursuite de ce travail, clôt le
manuscrit.



9 Contexte bibliographique











CHAPITRE II : CONTEXTE
BIBLIOGRAPHIQUE






10