Corso di Dottorato di Ricerca in Tecnologie Biomediche XVIII ciclo

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Corso di Dottorato di Ricerca in Tecnologie Biomediche , XVIII ciclo in cotutela tra UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI MILANO-BICOCCA Dipartimento di Medicina Sperimentale Ambientale e Biotecnologie Mediche UNIVERSITE' LOUIS PASTEUR - STRASBOURG Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-organique “Modulazione nutrizionale del proteoma di Saccharomyces cerevisiae nel ceppo selvatico e nei mutanti nel gene FAR1 codificante per un regolatore negativo della transizione da G1 a S.” Relatore italiano: Chiar.mo Prof. Marzia GALLI KIENLE Relatore francese: Chiar.mo Prof. Alain VAN DORSSELAER Tesi di Rossella SANVITO Matr. Nr. R00252

  • saccharomyces cerevisiae

  • studi di

  • modulation nutritionnelle du protéome de saccharomyces cerevisiae dans la souche sauvage et dans les mutants du gène far1


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Corso di Dottorato di Ricerca in Tecnologie Biomediche , XVIII ciclo

in cotutela tra



UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO-BICOCCA
Dipartimento di Medicina Sperimentale Ambientale e Biotecnologie
Mediche



UNIVERSITE’ LOUIS PASTEUR - STRASBOURG
Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-organique



“Modulazione nutrizionale del proteoma di Saccharomyces cerevisiae
nel ceppo selvatico e nei mutanti nel gene FAR1 codificante per un
regolatore negativo della transizione da G1 a S.”




Relatore italiano: Chiar.mo Prof. Marzia GALLI KIENLE
Relatore francese: Chiar.mo Prof. Alain VAN DORSSELAER




Tesi di

Rossella SANVITO


Matr. Nr. R00252


THESE en co-tutelle entre



UNIVERSITE’ LOUIS PASTEUR - STRASBOURG
Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-organique


UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO-BICOCCA
Dipartimento di Medicina Sperimentale Ambientale e Biotecnologie
Mediche


présentée pour l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
Discipline : chimie

par

Rossella SANVITO


“Modulation nutritionnelle du protéome de Saccharomyces cerevisiae
dans la souche sauvage et dans les mutants du gène FAR1 qui
code pour un régulateur négatif de la transition de G1 à S.”


Soutenue le 28 Mars 2006 devant la commission d’examen :

Dr. Alain VAN DORSSELAER Directeur de thèse
Prof. Claude KEDINGER Rapporteur interne
Prof. Marina PITTO Rapporteur externe
Prof. Fiamma RONCHETTI
Prof. Marzia GALLI KIENLE Examinateur (Directeur de thèse italien)
Prof. Marco VANONI ur
Dr. Christine SCHAEFFER Examinateur


Thesis in Biomedical Technology

In co-tutelage with:





UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO-BICOCCA
Dipartimento di Medicina Sperimentale Ambientale e Biotecnologie
Mediche



UNIVERSITE’ LOUIS PASTEUR - STRASBOURG
Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-organique





“Nutritional modulation of Saccharomyces cerevisiae proteome
in wild type and mutated strains in the FAR1 gene, encoding a
negative regulator of the G1 to S transition.”



Rossella SANVITO
Indice
INDICE
“Modulazione nutrizionale del proteoma di Saccharomyces cerevisiae nel ceppo
selvatico e nei mutanti nel gene FAR1 codificante per un regolatore negativo della
transizione da G1 a S.”

INTRODUZIONE GENERALE - PRESENTAZIONE DEL LAVORO DI TESI pg 1

pg 3 Capitolo 1 - IL LIEVITO SACCHAROMYCES CEREVISIAE
pg 3 1.1 - Un organismo modello nella biologia molecolare comparata
pg 4 1.2 – La similitudine dei meccanismi del ciclo cellulare in tutte le cellule eucariote
pg 5 1.3 - Il ciclo cellulare del lievito Saccharomyces cerevisiae
pg 7 1.4 - I chekpoints del ciclo cellulare
pg 8 1.5 - Il processo di gemmazione (budding)
pg 9 1.6 - Effetti dell’aggiunta di glucosio sulla crescita della cellula
pg 11 1.7 - Analisi post-genomica in lievito
pg 12 1.8 - Costruzione dei mutanti nel lievito
pg 12 1.9 - L’inibitore FAR1: Factor ARrest
pg 13 1.9.1 - Funzioni di Far1
Induzione della polarizzazione
Inibizione della Cdc28 (Chinasi ciclica-dipendente)
pg 15 1.9.2 - Degradazione di Far1
pg 15 1.9.3 - Localizzazione di Far1
pg 16 1.10 - I mutanti del gene FAR1
pg 20 1.11 - La crescita esponenziale
pg 21 1.12 – Lo shif-up nutrizionale

pg 23 Capitolo 2 - LA PROTEOMICA
pg 23 2.1 - La dinamicità del proteoma
pg 25 2.2 – Le tecniche analitiche della proteomica

pg 27 Capitolo 3 - ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE
pg 27 3.1 – SDS-PAGE: elettroforesi su gel di poliacrilammide
pg 28 3.2 - Considerazioni sulla tecnica
pg 29 3.2.1 – Preparazione del campione
Indice
Estrazione delle proteine
Quantificazione
Purificazione dell’estratto proteico
3.2.2 - Prima dimensione - IPG strips pg 31
Reidratazione e applicazione del campione
Isoelettrofocalizzazione
3.2.3 - Seconda dimensione – SDS-PAGE pg 31
Equilibrazione delle strips
Elettroforesi
Presupposti per una corretta analisi comparativa tra gel
3.2.4 - Visualizzazione dei risultati pg 33
3.2.5 – Analisi dell’immagine pg 34
PdQuest
Scanning
Individuazione automatica delle spot
Matching tra gel
Normalizzazione
Analisi differenziale

pg 39 Captiolo 4 - LA SPETTROMETRIA DI MASSA
4.1 – La strumentazione della spettrometria di massa pg 39
4.2 – MALDI TOF MS pg 41
4.2.1 - Il principio della tecnica MALDI-TOF pg 41
4.2.2 - La sorgente MALDI pg 42
4.2.2.1 - La matrice pg 42
4.2.2.2 - Il laser pg 43
4.2.2.3 - Il meccanismo di ionizzazione pg 44
4.2.2.4 - Il metodo di deposito pg 45
4.2.3 - L’analizzatore a tempo di volo TOF pg 46
4.2.4 - La risoluzione pg 46
4.2.5 - L’estrazione ritardata (Delayed Extraction) pg 47
4.2.6 - Il reflector pg 48
4.3 - LA STRATEGIA DEL PEPTIDE MASS FINGERPRINT pg 49
4.3.1 – Osservazione sulla tecnica pg 49
Indice
Il vantaggio della proteolisi
Match mancanti
Mancata identificazione
4.3.2 - Digestione tramite tripsina pg 51
Digestione in gel
4.3.3 – La tecnologia MALDI nel PMF pg 52
4.3.4 – Caratterizzazione di una proteina pg 53
4.4 - LA SPETTROMETRIA DI MASSA TANDEM pg 55
4.4.1 - LC-MS pg 56
Nano-HPLC-MS
4.4.2 - Principio di ionizzazione elettrospray pg 57
4.4.3 - Preparazione del campione per l’elettrospray pg 58
4.4.4 - L’analizzatore quadrupolo pg 59
4.4.5 - Accoppiamenti LC-MS/MS pg 60
ESI-Q-TOF
4.4.6 - Identificazione proteica tramite LC/MS/MS pg 61

Capitolo 5 - LA BIOINFORMATICA pg 63
5.1 - L’identificazione di una proteina pg 63
5.2 – Database pg 64
5.2.1 - Swiss-Prot pg 64
La ricchezza delle annotazioni
Accurata integrazione con altri database
Database non ridondante
5.2.2 - EMBL pg 66
5.1.2 - TrEMBL pg 66
5.1.3 - NCBI pg 66
5.2 – Il software di ricerca Mascot pg 66
Valutazione del risultato
5.3 - Informazioni sulle proteine pg 70

Capitolo 6 - L’ AUTOMATIZZAZIONE pg 73
6.1 - Sistemi integrati 'high throughput' pg 73
6.2 - Spot picker pg 74
Indice
6.3 - Robot di riduzione e alchilazione pg 74
6.4 – Acquisizione automatica degli spettri pg 74
6.5 - Trattamento dello spettro pg 75
6.6 - Ricerca in automatico pg 75

Capitolo 7 – SCOPO DELLA TESI pg 77
7.1 – La comprensione dei meccanismi del ciclo cellulare pg 77
7.1.1 - Studi sui mutanti del gene FAR1 pg 77
7.1.2 - Studi sullo shift-up nutrizionale etanolo-glucosio di ceppi wild type pg 88

Capitolo 8 - MATERIALI E METODI pg 79
8.1 – Preparazione del campione pg 79
Microrganismi utilizzati
Conservazione dei ceppi
Terreni e condizioni di crescita
8.2 – Estrazione delle proteine e separazione tramite SDS – PAGE pg 81
8.2.1 - Estrazione delle proteine totali da culture di Saccharomyces cerevisiae pg 81
8.2.2 - Dosaggio delle proteine estratte (Biorad a un reagente) pg 82
8.2.3 - Desalificazione dell´estratto totale pg 82
8.2.4 – Essiccazione dell´estratto pg 82
8.2.5 - Reidratazione delle strip pg 83
8.2.6 – Focalizzazione pg 83
8.2.7 - Preparazione dei gel SDS-PAGE per la seconda dimensione pg 83
8.2.8 - Equilibrazione delle strip pg 85
8.2.9 - SDS-PAGE (seconda dimensione) pg 85
8.2.10 – Colorazione pg 85
8.2.11 – Conservazione dei gel pg 86
8.3 - Analisi di immagine tramite PdQuest pg 86
8.4 - Incisione delle spot manuale e tramite robot pg 86
8.5 - Procedura di riduzione, alchilazione e digestione manuale e tramite robot: pg 87
8.6 – Deposito su target pg 89
8.7 - Acquisizione degli spettri tramite MALDI-TOF pg 90
8.8 - Trattamento dello spettro pg 91
8.9 - Ricerca in banca dati pg 92