Etude de l'interaction de Medicago truncatula avec Fusarium oxysporum et du rôle de l'acide salicylique dans les interactions de la plante avec différents agents pathogènes et symbiotiques

Chantal Olivain

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par Institut National Polytechnique de Toulouse Discipline ou spécialité : Interaction Plantes-Microorganismes JURY Dr. Chantal OLIVAIN Université de Bourgogne, Dijon Rapporteur Dr. Philippe REIGNAULT Université du Littoral, Calais Rapporteur Prof. Simon HAWKINS Université de Lille Examinateur Prof. Christophe ROUX UMR 5546, Toulouse Examinateur Ecole doctorale : S.E.V.A.B Unité de recherche : Laboratoire Symbiose et Pathologie des Plantes (SP2) Directeur(s) de Thèse : Martina RICKAUER Présentée et soutenue par Montserrat RAMÍREZ-SUERO Le 03 Décembre 2009 Titre : Etude de l'interaction de Medicago truncatula avec Fusarium oxysporum et du rôle de l'acide salicylique dans les interactions de la plante avec différents agents pathogènes et symbiotiques

• étapes de colonisation de la racine par le champignon


• supérieure agronomique de toulouse


• acide salicylique en catechol


• microscopie confocale des racines da17


• calais rapporteur


• toulouse examinateur


• prétraitement de racines


• microorganismes pathogènes

Sujets

• Université du Littoral
• Institut national polytechnique de Toulouse
• Institut de France
• Université de Bourgogne
• Hawkins
• Université de Toulouse

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 décembre 2009
• Nombre de lectures: 99
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

THÈSE

En v u e d e l' ob t e n t ion d u

DOCTORATDEL’UN I VERSITÉD ETOULOUSE

D é liv r é p a rde ToulousePoly t echnique Nat ional I nst it ut D iscip lin e ou sp é cia lit é :I nt er act ion Plant es- Micr oor ganism es

Pr é se n t é e e t sou t e n u e p a rRAMÍ REZ- SUEROMont ser r at Le03 Décem 2 00 9br e Tit r e :ôleet du r ox y spor um Fusar ium av ec " Et ude de l’in t er act ion de Medicago t r un cat ula de l'acide salicy lique dans les in t er act ion s de la plan t e av ec différ ent s agent s pat hogènes et sy m biot iques"

JU RY Dr . Chant al OLI VAI N Univ er sit é de Bour gogne, Dij on Rappor t eur Dr . Philippe REI GNAULT Univ er sit é du Lit t or al, Calais Rappor t eur Pr of. Sim on HAWKI NS Univ er sit é de Lille Ex am inat eur Pr of. Chr ist ophe ROUX UMR 5 5 4 6, Toulouse Ex am inat eur

Ecole d oct or a le :S. E. V. A. B U n it é d e r e ch e r ch e :hologie des Plan et Pat ( SP2 )t es Sy m biose Labor at oir e D ir e ct e u r ( s) d e Th è se :RI CKAUERMar t ina

N°d’ordre :

THÈSE présentée pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE Spécialité: Interactions Plantes-Microorganismes Ecole doctorale S.E.V.A.B par Montserrat Ramírez Suero "Etude de l’interaction deMedicago truncatulaavecFusarium oxysporumet du rôle de l'acide salicylique dans les interactions de la plante avec différents agents pathogènes et symbiotiques" Dr. Chantal OLIVAINRapportricede Bourgogne, Dijon  Université Dr. Philippe REIGNAULTRapporteurdu Littoral, Calais  Université Prof. Simon HAWKINSde Lille Examinateur Université Prof. Christophe ROUX5546, Toulouse Examinateur UMR Prof. Martina RICKAUER INP-ENSAT, de thèseToulouse Directrice

Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse (ENSAT)

Titre: " Etude de l’interaction deMedicago truncatulaavecFusarium oxysporumet du rôle de l'acide salicylique dans les interactions de la plante avec différents agents pathogènes et symbiotiques". Résumé Des études de l´interaction de la plante modèle des légumineusesMedicago truncatulaavec des microorganismes pathogènes et symbiotiques ont été réalisées. Tout d´abord un pathosystème fongique a été caractérisé:M. truncatula en interaction avecFusarium oxysporumspp., champignon responsable des fusarioses, soit du flétrissement vasculaire ou de la pourriture racinaire chez de nombreuses plantes cultivées. Deux lignées deM. truncatula: A17 et F83005.5 ont été identifiées comme sensible et tolérante respectivement àF. oxysporum f.sp. medicaginis, laforma specialisà la attribuée luzerne. De plus 9 souches deF. oxysporum isolées de différentes plantes hôtes et une souche non pathogène du sol ont été testées dans des expériences d’inoculation avec ces deux lignées. Elles ont toutes été capables d’induire les symptômes de la maladie chezM. truncatula. A l´aide d´une souche deF. oxysporum f.sp. medicaginisexprimant le gène rapporteur GFP, les étapes de colonisation de la racine par le champignon ont été caractérisées. Les observations en microscopie à fluorescence et microscopie confocale des racines d´A17 et F83005.5 ont indiqué un patron de colonisation inhabituel et ont montré que la tolérance de F83005.5 n´était pas corrélée à un mécanisme d’exclusion du cylindre central. Cependant, des différences dans l’expression de gènes de défense ont été détectées entre les deux lignées. Dans la deuxième partie, le rôle de l´acide salicylique a été étudié. Les résultats d´expériences avec l´acide salicylique exogène ont indiqué que le prétraitement de racines avec ce composé pouvait conférer une protection aux plantes vis-à-vis deF. oxysporumf.sp. medicaginiset la bactérie phytopathogèneRalstonia solanacearum. Avec l’objectif d´étudier le rôle de l´acide salicylique endogène dans les interactions avec les microorganismes, la transformation génétique deM. truncatulaavec le gèneNahG codant le salicylate hydroxylase a été entreprise. Cette enzyme dégrade l’acide salicylique en catechol. Seulement la lignée 2HA a pu être transformée et régénérée en plantes transgéniques. Ces plantes 2HA-NahG ont été inoculées avec des microorganismes pathogènes (R. solanacearum,Verticillium albo-atrum,F. oxysporum f. sp. medicaginis Colletotrichumtrifolii etC. higginsianum) ainsi qu’avec le champignon endomycorhizien Glomus intraradices. Les limitations expérimentales n’ont pas permis de conclure définitivement, mais indiquent qu’il est possible que la signalisation par l´acide salicylique ne soit pas impliquée dans les défenses deM. truncatulaà ces microorganismes face pathogènes et symbiotiques. Mots clés:Acide salicylique, colonisation, défense, embryogenèse, Fusarium oxysporum,GFP, Medicago truncatula, microscopie, racine, signalisation, transformation génétique. 3

Title: “A study on the interaction betweenMedicago truncatula andFusarium oxysporumand of the role of salicylic acid during the interactions of the plant with various pathogenic and symbiotic micro-organisms”. Abstract A study on the interactions of the plant model legumeMedicago truncatula (M.t.) with pathogens and symbiotic microorganisms was undertaken. First, a fungal pathosystem was characterized:M. truncatulain interaction with Fusarium oxysporumspp., the causal agent of Fusariosis, of Fusarium wilt and of root rot in many crop plants. TwoM. truncatula lines, A17 and F83005.5, were identified as susceptible and tolerant respectivelyto F. oxysporumf.sp.medicaginis, theforma specialisrelated to alfalfa. Besides, 9 strains ofF. oxysporumisolated from different host plants and a non-pathogenic soil-borne strain were tested in inoculation experiments with both lines. All the strains were able to trigger disease symptoms inM. truncatula. Using theF. oxysporumf.sp.medicaginis strain transformed with the GFP reporter gene, the stages of the root colonization by the fungi were characterized. Fluorescence and confocal microscopy observations on A17 and F83005.5 roots showed an unusual pattern of colonization and showed that the F83005.5 tolerance was not related to an exclusion mechanism in the central cylinder. However, differences on defence gene expression were detected in both lines. In the second part, the role of salicylic acid was studied. Results of experiments with exogenous salicylic acid indicated that prior treatment of roots with this compound may confer a protection towardsF. oxysporumsp. f. medicaginisthe phytopathogenic and bacteriumRalstonia solanacearum. With the goal to study the role of endogenous salicylic acid, the genetic transformation ofM. truncatula with the NahG gene was initiated. This gene codes for a salicylate hydroxylase which degrades salicylic acid to catechol. Only the highly embryogenic 2HA line could be transformed and regenerated into transgenic plants. These 2HA plants were inoculated with pathogenic microorganisms (Ralstonia solanacearum,Verticillium albo- atrum,Fusarium oxysporum f.sp. medicaginis ColletotrichumtrifoliiandC. higginsianum) as well as the mycorrhiza fungusGlomus intraradices. Experimental limitations did not allow us to conclude definitely, but it seems possible that the salicylic acid signaling way may not be implicated in the defence ofM. truncatula against these pathogenic and symbiotic microorganisms. Key words: salicylic acid, colonization, defence, embryogenesis,Fusarium oxysporum, GFP,Medicago truncatula,Fusarium oxysporum, microscopy, root, signaling, genetic transformation.

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REMERCIEMENTS Tout d´abord je voudrais remercier le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) et La Secretaría de Relaciones Públicas du Mexique (SEP) par leur financement qui ont rendu possible la réalisation de cette thèse. Je remercie ma directrice de thèse le Pr. Martina RICKAUER de m´avoir accueillie dans le laboratoire SP2 et d´avoir dirigé ce travail. Merci aux membres du laboratoire SP2, un spécial à Carine TORREGROSA et Marie Françoise JARDINAUD pour leurs conseils scientifiques et pour leur soutien. Un grand merci à mes anciens collègues du laboratoire SP2 qui m´ont apporté une grande aide technique et pour leur amitié : Annie PERRAULT, Marie-Josée TAVELLA et Philippe ANSON. Merci aux stagiaires qui ont participé à certaines parties de ce travail de thèse : Dominique RABY, Anas KANSHOUR, Pierre PÉRICARD, Caroline LAURENDON, Guillaume FARBRE, Guillaume MATHIEU et Mäel BAUDIN, ainsi qu à Damien FORMEY pour sa participation aux expériences de mycorhization. Je remercie aussi au Dr. Mireille CHABAUD (LIPM), à Francis CARBONNE (UMR 5546) et au Dr. Jean KALLERHOFF (ENSAT) pour leurs conseils avisés. Merci aux Dr. Chantal OLIVAIN, Dr. Philippe REIGNAULT, Prof. Simon HAWKINS et Prof. Christophe ROUX pour avoir accepté de juger ce travail et pour avoir enrichi ma thèse de leurs observations. Merci beaucoup à mes parents Mario et Francisca, et ma sœur Cynthia Alejandra ; très importants pour moi et qui ont été avec moi pour m´encourager et me soutenir à tout moment. Merci aussi à mes amis; vous vous reconnaîtrez, et merci à Mr. Henri Plat et Mme Dominique PLAT, Mr. Claude et Mme. Andrée LAVERNHE et Mr. Lucien et Mme. Marie Pierre ROUX pour leur soutien et accueil chaleureux pendant mon séjour en France. 7

ACC ADN ADNc ARN Avr CFU CIM C.t. Dmi DO dpi EDM ET Fom GFP G.i. HR ISR JA MAMP MeJa MS M.t. Nfp PCR PDA PDM PR q-RT-PCR QTL ROS

ABBRÉVIATIONS

acide-1-aminocyclopropane carboxylique acide désoxyribonucléique acide désoxyribonucléique complémentaire acide ribonucléique avirulence Colony-Forming Unit Callus-Inducing Medium Colletotrichum trifolii doesn´t make infections Densité Optique days post-inoculation Embryo Development Medium éthylène Fusarium oxysporum medicaginis Green Fluorescent Protein Glomus intraradices Réponse hypersensible résistance systémique induite acide jasmonique Microbe-Associated Molecular Patterns Méthyle Jasmonate milieu de Murashige et Skoog Medicago truncatula Nod Factor Perception Polymerase Chain Reaction Potato Dextrose Agar Plant Development Medium Pathogenesis Related quantitative real-time PCR Quantitative Trait Loci espèces réactives de l´oxygène

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