Isolement et caractérisation des cellules souches leucémiques dans la Leucémie Aigüe Myéloïde

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Niveau: Supérieur, Master, Bac+5
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences et Vie de la Terre MEMOIRE Présenté par Stéphane JOLY Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique Des Hautes Etudes Isolement et caractérisation des cellules souches leucémiques dans la Leucémie Aigüe Myéloïde Soutenu le : 2 février 2010 Devant le jury : Xavier RONOT Président Claire RACAUD-SULTAN Rapporteur Jean Marie EXBRAYAT Examinateur Xavier THOMAS Examinateur Véronique MAGUER-SATTA Examinateur Laboratoire EPHE : Reproduction et Développement des Vertébrés Directeur : Jean-Marie EXBRAYAT () 15 rue du Plat – 69 288 Lyon Cedex 02 Laboratoire d'accueil : INSERM U590 Oncogenèse et Progression Tumorale Directeur : Alain PUISIEUX Responsable scientifique : Véronique MAGUER-SATTA () Centre Léon Bérard – 28 rue Laënnec – 69 373 Lyon Cedex 08

  • modification de l'expression des isoformes du gène tp73 en réponse aux traitements

  • cellule souche leucémique

  • réponse aux drogues de chimiothérapie

  • cellule souche

  • tp73

  • lam

  • mécanismes d'action de la niche hématopoïétique……………………………


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Publié le 01 février 2010
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE



ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

Sciences et Vie de la Terre

MEMOIRE

Présenté par

Stéphane JOLY


Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique Des Hautes Etudes


Isolement et caractérisation des cellules souches leucémiques
dans la Leucémie Aigüe Myéloïde



Soutenu le : 2 février 2010

Devant le jury :

Xavier RONOT Président
Claire RACAUD-SULTAN Rapporteur
Jean Marie EXBRAYAT Examinateur
Xavier THOMAS
Véronique MAGUER-SATTA Examinateur



Laboratoire EPHE : Reproduction et Développement des Vertébrés
Directeur : Jean-Marie EXBRAYAT (jmexbrayat@univ-catholyon.fr)
15 rue du Plat – 69 288 Lyon Cedex 02

Laboratoire d’accueil : INSERM U590 Oncogenèse et Progression Tumorale
Directeur : Alain PUISIEUX
Responsable scientifique : Véronique MAGUER-SATTA (MAGUER@lyon.fnclcc.fr)
Centre Léon Bérard – 28 rue Laënnec – 69 373 Lyon Cedex 08 RESUME

La niche hématopoïétique qui renferme les cellules souches influence la leucémogénèse et
la résistance des cellules souches leucémiques (CSL) aux drogues utilisées en chimiothérapie. Pour
mieux comprendre les interactions entre les différents composants de la niche et proposer de
nouvelles stratégies de traitements des leucémies, il est nécessaire d’isoler chacun des différents
partenaires (cellules souches mésenchymateuse, cellules souches leucémiques…).
L’objectif de notre étude est d’isoler et de caractériser les cellules souches leucémiques
(CSL) dans la Leucémie Aigüe Myéloïde (LAM) et d’étudier le rôle du microenvironnement dans
la résistance de ces CSL aux traitements de chimiothérapie. Pour cela des prélèvements de
donneurs sains et de patients atteints de LAM ont été utilisés. Des tris cellulaires ont été réalisés
avec des marqueurs décrits dans la littérature comme spécifiques des cellules souches leucémiques
de LAM (CD90, CD33 et CD123). Les populations triées ont ensuite été réensemencées pour des
tests fonctionnels pour déterminer le compartiment des progéniteurs leucémiques et celui des CSL.
Le phénotype des progéniteurs leucémiques n’a pas pu être déterminé, par contre les CSL ont été
+ - +retrouvées pour une partie des patients testés dans la fraction de phénotype CD34 CD38 CD123
+ - -tandis que les cellules souches hématopoïétiques saines sont de phénotype CD34 CD38 CD123 .
L’étude moléculaire nous a permis de confirmer la dérégulation de Bmi-1 dans la LAM
mais également d’autres gènes comme par exemple TP73 dont les isoformes sont surexprimées
dans la LAM et notamment dans les LAM M1 et M5.
A partir des premiers résultats obtenus sur les cellules primaires, nous avons pu déterminer
parmi les lignées de LAM à notre disposition deux modèles, les KG1 modèle de progéniteurs
leucémiques et les KG-1a modèle de CSL. Ces modèles nous ont permis d’étudier la réponse aux
drogues de chimiothérapie (daunorubicine et resvératrol) en condition d’adhésion ou non. Nous
nous sommes ensuite intéressé à l’expression des isoformes de TP73 et d’autres gènes en réponse
aux traitements. Les premiers résultats obtenus mettent en évidence une modification de
l’expression des isoformes du gène TP73 en réponse aux traitements. Nous avons également put
observer que l’effet des traitements sur l’expression de isoformes de TP73 peut être modulés par
l’adhésion à la fibronectine.

Mots clefs : Cellule souche leucémique, microenvironnement, TP73



SOMMAIRE

Partie I : Introduction bibliographique

Introduction générale

I. Les cellules souches…………………………………………………………………p.1

a. Généralités
b. Les différents types de cellules souches………………………………………...p.2
c. Auto-renouvellement et division asymétrique…………………………………..p.3
d. La potentialité des cellules souches
e. Caractéristiques des cellules souches…… ……… ……… ……… ……… …….. . p . 4
e.1. Identification des cellules souches
e.2. Caractéristiques moléculaires et biochimiques……………………………..p.6

II. Le modèle hématopoïétique……………………………………………………....p.11

a. Définition et fonction de l’hématopoïèse
b. Origine embryonnaire………………………………………………………….. p.12
c. Les différents compartiments de l’hématopoïèse……………………………… p.13

III. La niche hématopoïétique………………………………………………………….. p.15

a. Localisation et structure physique de la niche hématopoïétique
b. Les deux types de niche hématopoïétique……………………………………... p.17
c. Mécanismes d’action de la niche hématopoïétique……………………………. p.19

IV. Cellule souche et cancer…………………………………………………………… p.23

a. Définition de la cellule souche cancéreuse
b. Mise en évidence des cellules souches cancéreuses…………………………… p.25


V. La Leucémie Aigüe Myéloïde……………………………………………………... p.28

a. Définition
b. Les différents types de LAM et leur classification…………………………….. p.29
c. Les antimitotiques dans le traitement des LAM : principale thérapeutique…… p.30
d. Approche thérapeutique………………………………………………………... p.31
e. Le cas particulier de la LAM promyélocytique : LAM de type 3……………... p.33
f. Les nouvelles molécules en cours d’étude……………………………………... p.34

VI. Les éléments de dérégulation des cellules souches leucémiques dans la LAM…… p.37

a. Phénotype et identification des CSL de LAM
a.1. Indentification par les marqueurs membranaires
a.2. Les autres moyens de caractériser les CSL………………………………………... p.39
b. Mécanismes de résistance des CSL……………………………………………. p.40
c. Rôle de la niche dans la résistance……………………………………………... p.41
d. Dérégulation de la famille p53…………………………………………………. p.43

VII. Objectif de travail………………………………………………………………….. p.45














ABREVIATIONS

Unité :

°C = Degré Celcius % = Pourcentage
µg Microgramme nm =nanomètre
µL = Microlitre ml = Millilitre
h = heure min = Minute
µM = Micromole / Litre mM = milimolaire
mg = Milligramme s = seconde

Abréviations :

ABC = ATP Binding Cassette
ADN = Acide DésoxyriboNucléique
ADNc = Acide Desoxyribo Nucléique complémentaire
ALDH = Aldéhyde Déshydrogénase
ARN = Acide RiboNucléique
ATP = Adénosine Tri Phosphate
BMP = Bone Morphogenetic Protein
BSA=Albumine Sérique Bovine
CD = Cluster Differentiation
CFC = Colony Forming Cell
CS = Cellules Souche
CSC = Cellule Souche Cancéreuse
CSH = Cellule Souche Hématopoïétique
CSL = Cellule Souche Leucémique
CSM = Cellule Souche Mesenchymales
DMSO = Diméthyle Sulfoxyde
DNTP = désoxyNucléotides TriPhosphate
EDTA = acide EthylèneDiamineTétraAcétique
FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter
FAK = Focale Adhesion Kinase
FITC = Fluorescein Iso ThioCyanate Fn = Fibronectine
G-CSF = Granulocyte Colony Stimulating Factor
GM-CSF = Granulocyte Macrophage – Cell Stimulating Factor
GSK3  = glycogène synthase kinase 3 beta
Ig = Immunoglobuline
IMDM = Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium
KO = Knock Out
LAM = Leucémie Aiguë Myéloïde
LMC = Leucémie Myéloïde Chronique
LTC-IC = Long Term Cultur Initiating cell
MAPC = Multipotent Adult Progenitor Cells
MEC = Matrice ExtraCellulaire
MNC = Mono Nuclear Cells
NOD / SCID = NonObese Diabetic / Severe Combined ImmunoDeffiscient
PBS = Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
PCR = Polymerase Chain Reaction
PCRQ = PCR quantitative
RT = Reverse Transcriptase
RPMI = Roswell Park Memorial Institute
RT-PCR = Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SCID = Severe Combined ImmunoDeffiscient
VEGF= Vascular Endothelial Growth Factor











Introduction générale

L’hématopoïèse est l’ensemble des mécanismes qui sont impliqués dans la fabrication et le
remplacement des cellules sanguines afin de maintenir le renouvellement des cellules et ainsi un
état de bon fonctionnement. Les leucémies sont des cancers dans lesquels l’hématopoïèse est
dérégulée. Il existe plusieurs types de leucémies dont la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) et
la Leucémie Aigüe Myéloïde (LAM). Le modèle d’étude que nous avons choisi pour cette étude
est la LAM car c’est dans ce modèle qu’a été mis en évidence pour la première fois l’existence de
cellules souches cancéreuses (Dick E. and Bonnet D. 1997). De plus, pour ce type de leucémie, il
existe très peu de traitements permettant une guérison sur le long terme, ces traitements étant
encore moins efficaces sur les nombreux cas de rechute après rémission observés dans la LAM.
C’est pourquoi il est important de comprendre et d’identifier quelle est l’origine de la résistance
des cellules leucémiques aux différents traitements et quelle est l’origine de la rechute des patients.
Nous nous sommes donc particulièrement intéressés aux cellules souches leucémiques et à leur
microenvironnement. En effet, les rechutes pourraient être dues au maintien d’une cellule souche
cancéreuse qui permettrait la reprise de prolifération des cellules malignes. La résistance aux
traitements de cette cellule souche cancéreuse serait due aux propriétés-mêmes des cellules
souches. En effet, les cellules souches se divisant rarement, elles ne sont pas touchées par les
traitements de chimiothérapie à base d’antimitotiques (intercalant de l’ADN lors de la division
cellulaire). De plus, les cellules souches sont localisées dans des niches hématopoïétiques qui
constituent une barrière physique empêchant ainsi les drogues d’atteindre ces cellules. Afin
d’étudier les mécanismes de résistance et de rechute, nous avons choisi d’isoler les cellules
souches leucémiques pour les caractériser dans le but de mieux les connaître et de pouvoir mieux
les cibler dans les thérapies. Les informations ainsi obtenues pourraient alors permettre d’adapter
les traitements pour augmenter le taux de rémission des patients et diminuer le taux de rechute.

I. Les cellules souches

a. Généralités

Le terme de cellule souche (CS) désigne une cellule indifférenciée dont le rôle est le
maintien de l’homéostasie tissulaire, c’est-à-dire la capacité à maintenir un tissu dans son état
fonctionnel en remplaçant continuellement les différentes cellules composant le tissu. Les CS sont
1 dotés de nombreuses caractéristiques. Elles possèdent une capacité d’auto-renouvellement
quasiment illimité (capacité de se reproduire sans se différencier). Elles possèdent également un
cycle cellulaire particulier car elles ne se divisent que rarement et peuvent se diviser de manière
asymétrique. Ce sont des cellules pluripotentes, c’est-à-dire capables de donner naissance à tous
les types cellulaires de l’organisme. Elles sont capables de se multiplier lorsqu’elles sont placées
dans un environnement tissulaire approprié pour remplacer les cellules détruites en engendrant les
progéniteurs des différents lignages cellulaires. Les progéniteurs donneront alors naissance à des
cellules hautement différenciées qui vont acquérir une morphologie et une fonction tissulaire
spécifique.

b. Les différents types de cellules souches

Il est possible de classer les CS selon leur potentiel développemental. Les CS
embryonnaires (isolées en culture à partir de la masse interne des blastocystes) et les CS
germinales (isolées en culture à partir de la zone germinale primordiale d’embryon précoce) sont
dites pluripotentes car elles sont capables de produire l’ensemble des cellules d’un organisme y
compris les cellules germinales. Les CS embryonnaires sont caractérisées par l’expression de
gènes codant pour des facteurs de transcription tels que OCT4 et NANOG ainsi que le gène SOX2.
Ces trois gènes sont impliqués dans le maintien de la pluripotentialité des CS embryonnaires
(Johnson BV. et al., 2006). Le zygote issu de la fécondation, bien que n’étant pas considéré
comme une CS car il ne possède pas la capacité d’auto-renouvellement, est dit totipotent. La
différence entre la pluripotentialité des CS embryonnaires et la totipotentialité du zygote réside
dans le fait que les CS embryonnaires peuvent uniquement former des cellules nécessaires à la
formation de l’embryon alors que le zygote totipotent peut également former les cellules
nécessaires à la formation des annexes extra-embryonnaires comme le placenta.
Les autres CS sont dites multipotentes si elles peuvent produire plusieurs types cellulaires,
comme par exemple les CS hématopoïétiques. Ces CS dites organe-spécifiques, tissu-spécifiques
ou adultes dérivent progressivement des CS embryonnaires.
Il existe trois types de CS. Les CS des tissus adultes, les CS fœtales parmi lesquelles on
peut distinguer des CS somatiques et des cellules germinales et les CS embryonnaires
pluripotentes. De plus, il est possible de prendre en compte un dernier type de CS appelé
précurseurs. Les CS embryonnaires sont des cellules très primitives qui proviennent de l’embryon
précoce. Elles se distinguent des CS adultes par une propriété essentielle : leur capacité à générer
tous les tissus de l’organisme incluant la lignée germinale. Ces CS embryonnaires donnent
2 naissance aux CS adultes multipotentes, propres à un tissu ou à un organe donné. Elles possèdent
généralement un potentiel de différenciation restreint. Cette caractéristique est un élément
fondamental qui distingue les cellules souches embryonnaires des CS tissulaires propres aux
organes. Les cellules souches adultes sont, pour leur part, déjà engagée dans un programme
tissulaire spécifique, ce qui explique leur hétérogénéité, et même si certaines d’entre elle peuvent
conduire à la formation ou à la régénération de tissus distincts (multipotentes), elles ne sont pas
pluripotentes comme leurs homologues embryonnaires, à l’origine de toutes les cellules d’un
organisme.

c. Auto-renouvellement et division asymétrique

Le mécanisme d’auto-renouvellement des CS vient du fait que ces cellules sont capables
d’effectuer deux types de division : une division symétrique classique et une division asymétrique.
Les divisions symétriques produisent deux cellules filles identiques, dont les potentialités sont plus
restreintes que celles de la cellule initiale. La division asymétrique produit, quant à elle, une cellule
fille identique à la cellule initiale, qui conserve toutes les propriétés de la cellule mère et est
destinée au maintien du réservoir de cellules souches initiales. La division asymétrique est
également à l’origine d’une cellule fille dont les potentialités sont plus restreintes que celles de la
cellule d’origine et qui sera à l’origine de cellules plus différenciées. Seules les cellules souches
sont capables d’auto-renouvellement dans l’organisme sain. Par contre, dans de nombreux cancer,
certaines cellules tumorales ont également cette propriété (voir le paragraphe IV cellules souches
et cancer).

d. La potentialité des cellules souches

La CS est caractérisée par sa pluripotentialité, c’est-à-dire sa capacité à générer tous les
types cellulaires d’un tissu ou d’un organe donné. A mesure que la cellule évolue depuis l’état de
CS jusqu’à la différenciation terminale, la potentialité ou capacité à donner d’autres types
cellulaires diminue. Par la même occasion, le degré de différenciation augmente. Les cellules sont
alors orientées vers un nombre de types cellulaires de plus en plus restreint. Le lignage des cellules
de mammifères se fait normalement dans un seul sens. Les cellules souches produisent des
progéniteurs, qui à leur tour donneront des précurseurs, qui finalement se différencieront pour
atteindre le degré de cellules matures fonctionnelles. La cellule en cours de différenciation voit ses
potentialités de plus en plus restreintes à chacune des étapes. L’exemple classique de la restriction
3 développementale est la gastrulation au cours de laquelle les trois feuillets primitifs sont formés.
Chaque feuillet donne alors naissance à différents types cellulaires. L’endoderme forme le tube
digestif, le foie, le pancréas et les poumons. Le mésoderme donnera les muscles, le sang, les os et
les tissus adipeux. L’ectoderme génèrera la peau et le système nerveux.
Le terme de différenciation cellulaire caractérise le processus cellulaire s’exerçant sur les
cellules spécifiées. Par exemple, un précurseur de neurone se transforme progressivement en un
neurone morphologiquement et fonctionnellement identifié. Ce processus est aussi appelé
maturation. Le processus de différenciation cellulaire est caractérisé par l’apparition de
l’expression de molécules membranaires et de marqueurs de différenciation, spécifiques de chaque
lignage cellulaire et au degré de maturité de la cellule. Pour identifier une cellule différenciée dite
mature, il est important de choisir des marqueurs de différenciation hautement spécifiques du type
cellulaire étudié et du stade de différenciation.

e. Caractéristiques des cellules souches

Les caractéristiques des CS telles que les marqueurs membranaires, l’auto-renouvellement
et la pluripotentialité, qui permettent de les ségréger des cellules engagées et des cellules matures
sont régulées par de nombreux mécanismes génétiques et épigénétiques, qui sont, eux aussi,
spécifiques des CS et qui servent également à les caractériser et les isoler. Ces mécanismes sont
principalement des voies de signalisation, des modifications de la structure de l’ADN et la
présence d’enzyme activée uniquement chez les cellules immatures.

e.1. Identification des cellules souches

Marqueurs membranaires des cellules souches

Les populations enrichies en cellules souches adultes dans différents tissus peuvent être
identifiées par l’intermédiaire de marqueurs membranaires. Ces marqueurs sont en générale
spécifiques du tissu étudié. Dans le tissu hématopoïétique, les cellules souche hématopoïétiques
+sont décrites pour être enrichie dans la population de cellules CD34 . Les cellules souches
mésenchymateuse sont décrites pour porter les marqueurs membranaires CD73, CD90 et CD105
notamment et peuvent être à l’origine d’ostéoblastes ou d’adipocytes. Dans le tissu épithéliale, la
+ + +population enrichie en cellules souches est CD29 CD49f et CD133 . Enfin dans le tissus adipeux
+ + + + +la population enrichie en cellules souches est CD29 CD44 CD71 CD90 et CD105 . Dans
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