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Niveau: Supérieur, Master, Bac+5

  • mémoire


MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE MEMOIRE Présenté Par Guillaume MARCY Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Cellules Souches Embryonnaires De Primate : Culture Et Etude du Cycle Cellulaire Soutenu le 29 Novembre 2006 devant le jury suivant : Mme Geneviève CORDIER - Présidente - Mr Jean-Marie EXBRAYAT - Tuteur pédagogique - Mr Bertrand Pain - Examinateur - Mme Colette DEHAY - Tuteur scientifique - Laboratoire Reproduction et Développement des Vertébrés 25, rue du Plat 69288 Lyon Cedex 02 Directeur EPHE : Jean-Marie EXBRAYAT Laboratoire INSERM U371 –Institut cellule souche et cerveau- Equipe Colette DEHAY 18 avenue du Doyen Lépine DIRECTEUR : Henry KENNEDY 69675 Bron cedex RESPONSABLE : Colette DEHAY EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • embryons pré-implantatoires de souris, de singe et d'homme

  • cellule

  • recherche préclinique des maladies génétiques et des cancers

  • revue générale du cycle cellulaire des cellules somatiques

  • primate

  • lignées de cellules souches embryonnaires

  • cycle cellulaire


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Publié le 01 novembre 2006
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MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE



MEMOIRE

Présenté

Par Guillaume MARCY

Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes



Cellules Souches Embryonnaires De Primate :
Culture Et Etude du Cycle Cellulaire





Soutenu le 29 Novembre 2006 devant le jury suivant :

Mme Geneviève CORDIER - Présidente -
Mr Jean-Marie EXBRAYAT - Tuteur pédagogique -
Mr Bertrand Pain - Examinateur -
Mme Colette DEHAY - Tuteur scientifique -





Laboratoire Reproduction et Développement des Vertébrés
25, rue du Plat
69288 Lyon Cedex 02 Directeur EPHE : Jean-Marie EXBRAYAT
jmexbrayat@univ-catholyon.fr


Laboratoire INSERM U371 –Institut cellule souche et cerveau-
Equipe Colette DEHAY
18 avenue du Doyen Lépine DIRECTEUR : Henry KENNEDY
69675 Bron cedex RESPONSABLE : Colette DEHAY
dehay@lyon.inserm.fr

EPHE Banque de Monographies SVT 1ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES DE PRIMATE : CULTURE
ET ETUDE DU CYCLE CELLULAIRE

PAR GUILLAUME MARCY

SOUTENU LE 29 Novembre 2006

Des lignées de cellules souches embryonnaires (cellules ES) ont été isolées à partir
d’embryons pré-implantatoires de souris, de singe et d’homme. Les cellules ES de ces trois espèces
ont la capacité de s’autorenouveller indéfiniment in vitro tout en conservant les propriétés de
pluripotence leur permettant de se différencier dans tous les types cellulaires. Autorenouvellement
illimité et pluripotence font des cellules ES un candidat idéal pour le développement de nouveaux
outils de thérapie cellulaire.
L’objectif du projet de recherche décrit dans ce mémoire a été (i) d’optimiser les conditions de
culture des cellules ES de primate afin d'obtenir facilement de grandes quantités de cellules à l'état
indifférencié/pluripotent et (ii) de caractériser les propriétés du cycle cellulaire des cellules ES de
singe rhésus. En effet, le cycle des cellules ES de souris diffère radicalement de celui des cellules
somatiques à de nombreux égards (revue dans Savatier et al., 2002). Il semble que ces caractéristiques
atypiques du cycle cellulaire permettent aux cellules ES de maintenir leurs propriétés
d’autorenouvellement et de pluripotence. Le cycle cellulaire des cellules ES de primate n’ayant jamais
été décrit, nous avons donc entrepris de déterminer dans quelle mesure les propriétés observées dans
les cellules ES de souris sont conservées chez le primate. Ce projet s’inscrit dans le contexte des
travaux de l’unité, qui visent le développement et la validation préclinique de stratégies de thérapie
cellulaire, basées sur l'utilisation des cellules ES de primate pour le traitement de la maladie de
Parkinson.
Par l’utilisation de mesures de cytométrie en flux combinées avec des analyses quantitatives
de la cinétique du cycle cellulaire, nous avons montré que les cellules ES de singe rhésus sont
caractérisés par une progression extrêmement rapide de la phase G1, qui correspond à 15% de la
durée totale du cycle. Les cellules ES de singe présentent une expression de la cycline E détectée
dans toutes les phases du cycle cellulaire, et ne s’arrêtent pas en G1 après une irradiation-g, reflétant
l’absence de point de contrôle en G1. La privation de sérum ou l’inhibition pharmacologique des
kinases MEK n’entraînent pas d’altération de la distribution cellulaire dans le cycle, indiquant que la
croissance des cellules ES de primate ne nécessite pas de signaux mitogènes transduits par la voie
Ras/Raf/MEK. Pris ensemble, ces résultats indiquent que les cellules ES de singe rhésus, comme les
cellules ES de souris, possèdent des caractéristiques inhabituelles de cycle cellulaire dans lequel les
contrôles des mécanismes opérant pendant la phase G1 sont réduits ou absents.


Mots clés : cellules ES de primate ; autorenouvellement ; pluripotence ; conditions de culture ; cycle
cellulaire.


SOMMAIRE

ABREVIATIONS....................................................................... 6

EPHE Banque de Monographies SVT 2INTRODUCTION....................................................................... 7

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES...................................................... 8

1. Définition et applications en clinique et en recherche des cellules ES....... 8
1.1 Définition.................................................................................. 8
1.2 Cellules ES : applications cliniques et recherche............................ 8
1.2.1 Etude génomique........................................................................................ 8 1.2.2 Etude des processus biologiques................................................................ 9
1.2.3 Recherche préclinique des maladies génétiques et des cancers.................. 9 1.2.4 Thérapie cellulaire...................................................................................... 9
1.2.5 Recherche pharmaceutique....................................................................... 10 1.2.6 Transfert nucléaire................................................................................... 10

2. Dérivation des cellules ES...................................................... 11

3. Propriétés des cellules ES 12
3.1 Autorenouvellement.................................................................. 12
3.2 Pluripotence............................................................................. 12
3.3 Caryotype................................................................................ 13
3.4 Distinction entre les cellules ES et les cellules souches de l’embryon 14

4. Facteurs intrinsèques de l’autorenouvellement et les marqueurs de pluripotence dans les
cellules ES 14
4.1 Marqueurs de surface................................................................ 14
4.2 Oct-4...................................................................................... 15
4.2.1 Co-facteurs de Oct-4............................................................................... 15
4.2.2 Gènes cibles de Oct-4 16
4.3 Nanog 17
4.4 Autres facteurs......................................................................... 18
4.4 Activité télomérase................................................................... 18
4.5 Activité phosphatase alcaline.................................................... 19

5. Facteurs extrinsèques de l’autorenouvellement et de la pluripotence dans les cellules ES 19
5.1 Voie LIF/gp130/STAT3............................................................... 19
5.2 Voie des TGFβ............................................................................. 21
5.2.1 TGF β/Nodal/activine................................................................................ 21
5.2.2 BMP......................................................................................................... 23
5.3 Voie FGF et PI3K....................................................................... 25
5.4 Voie canonique Wnt/ β-caténine.................................................. 26
EPHE Banque de Monographies SVT 3
6. Optimisation des conditions pour la culture des cellules ES humaines.... 27
6.1 Optimisation des conditions de culture afin d’obtenir des populations pures de
cellules ES humaines 27
6.2 Matrices extracellulaires et substrats......................................... 28
6.3 Milieux de culture..................................................................... 28
6.4 Passages.................................................................................. 29
6.5 Optimisation des conditions afin d’utiliser les cellules ES en thérapie cellulaire 30
6.6 Modifications génétiques des cellules ES..................................... 31
6.6.1 Transfections transitoires et stables........................................................ 31
6.6.2 Vecteurs viraux : système lentiviraux...................................................... 32

7. Cycle cellulaire des cellules somatiques et des cellules ES................. 33
7.1 Revue générale du cycle cellulaire des cellules somatiques........... 33
7.1.1 Introduction............................................................................................. 33 7.1.2 Régulation de la phase G1........................................................................ 34
7.1.2 1 Voie des kinases cycline D dépendantes............................................ 34
7.1.2.1.a Activation de la cycline D................................................. 34 7.1.2.1.b Fonctions des kinases cycline D dépendantes...................... 35
7.1.2.2 Voie Myc.................................................................................... 36
7.1.3 Réponse à l’endommagement de l’ADN dans les cellules
somatiques 37

7.2 Cycle cellulaire des cellules ES de souris..................................... 38
7.2.1 Etat des connaissances............................................................................ 38
7.2.1.1 Statut de RB/E2F dans les cellules ES de souris........................ 38 7.2.1.2 Activité constitutive des kinases cycline E-dépendantes.......... 39
7.2.2 Régulation de la phase G1 dans les cellules ES de souris......................... 39
7.2.2.1 Régulation des cyclines D dans les cellules ES........................... 39 7.2.2.2 de la voie RB/E2F dans les cellules ES .................... 40
7.2.3 Réponse à l’endommagement de l’ADN dans les ES..................... 41
7.2.3.1 Absence d’un point de contrôle en G1........................................ 41
7.2.3.2 Mise en place d’un cycle cellulaire régulé lors de la différenciation
des cellules ES 42

7.3 Cycle cellulaire des cellules ES de primate................................... 43

LISTE DES ABREVIATIONS

EPHE Banque de Monographies SVT 4µg, µl, µM, µF: microgramme, microlitre, micromolaire, microfarad
ADN: Acide DésoxyriboNucléique
ADNc: ADN complémentaire
APC: Adeomatosis Polyposis Coli
ARNm : ARN messager
ARN: Acide RiboNucléique
BIO: 6-BromoIndirubin-3-Oxime
BMP: Bone Morphogenic Protein
BrdU : BromodésoxyUridine
CD9: Cell Differentiation Antigen 9
DIA: Inhibiting Activity
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
Dsh: Dishevelled
EB: Embryoid Body
EC: Embryonic carcinomal
EGF: Epidermal Growth Factor
eGFP: enhanced Green Florescent Protein
EHS: Engelbreth-Holm-Swarm
ERK: Extracellular Signal Regulated Kinase
ES: Embryonic Stem
FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter
FGF: Fibroblast Growth Factor
FITC: Fluorescein IsoThioCyanate
Frz: Frizzled
FSH: Follicle Stimulating Hormone
GCTM-2: Germ Cell Tumor Monoclonal-2
GDF3: Human Growth Differenciation Factor
GFP: Green Fluorescent Protein
Grb2: Growth factor receptor binding protein 2
GSK-3β: Glycogen Synthase Kinase-3β
hES: human embryonic stem
HLH: Helix Loop Helix
ICM: Inner Cell Mass
Id: Inhibitor Of Differentiation
IP: Iodure de Propidium
IRES: Internal Ribosome Entry Site
JAK: Janus kinase
KOSR: knock Out Serum Replacment
KV: Kilo-Volt
LIF: Leukaemia Inhibitory Factor
MAPK: Mtogen Activated Protein Kinase
MEF: Mouse Embryonic Fibroblast
MEK: MAP/ERK Kinase
mES: mouse embryonic stem
mg, ml, mM: milligramme, millilitre, millimolaire
EPHE Banque de Monographies SVT 5MHC1: Major Histocompatibility Complex Gene 1
MOI: Multiplicity Of Infection
LIF: Leukaemia Iinhibitory Factor
LEF: Lymphoid Enhancer Factor
pb: paire de bases
PBS: Phosphate Buffer Saline
PCR: Polymerase Chain Reaction
PFA: ParaFormAldéhyde
PI3K: PhosphatIdylinositol 3 Kinase
PKB: Protein Kinase B
PTEN: Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten
RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
SARA: Smad Anchor Inhibitory Smad
SEF: Simian Embryonic Fibroblast
siRNA: short interfering RNA
SIV: Simian Immunodeficiency Virus
SOCS: Supressor Of Cytokines
SR: Serum Replacement
SSEA: Stage Specific Embryonic Antigen
STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription
SVF: Sérum de Veau Foetal
TCF: T-Cell Factor
TERT: Telomerase Reverse Transcriptase
TGF β: Transforming Growth Factor
TLV: Time Laps Videomicroscopy
TR: Telomerase RNA
TRA: Tumor Rejection Antigen
INTRODUCTION

Des lignées de cellules souches embryonnaires (cellules ES) ont été isolées à partir
d’embryons pré-implantatoires de souris, de singe et d’homme. Les cellules ES issues de ces trois
espèces ont la capacité de s’autorenouveller indéfiniment in vitro tout en conservant les propriétés de
pluripotence leur permettant de se différencier dans tous les types cellulaires. Autorenouvellement
illimité et pluripotence font des cellules ES un candidat idéal pour le développement de nouveaux
outils de thérapie cellulaire (Smith, 2001). Cependant, l’équilibre autorenouvellement/différenciation
des cellules ES de primates (homme et rhésus) est très instable. Même dans les conditions optimales
de culture, une fraction importante des cellules se différencie spontanément. Cette situation constitue
un obstacle à l’analyse des caractéristiques génétiques des cellules ES car il est alors difficile, voire
impossible, de disposer de populations pures de cellules souches en autorenouvellement. La difficulté
à cultiver les cellules ES de primates est également un obstacle à leur utilisation pour le
développement des thérapies cellulaires. La culture des cellules ES nécessite en effet une sélection
rigoureuse des colonies de cellules indifférenciées à chaque étape d’amplification. Ce travail est
fastidieux et exige un soutien technique important. Ces difficultés tiennent sans doute pour beaucoup
EPHE Banque de Monographies SVT 6à l'ignorance de la nature exacte des nombreux facteurs de croissance qui contrôlent
l'autorenouvellement.
L’objectif du projet de recherche décrit dans ce mémoire a été (i) d’optimiser les conditions de
culture des cellules ES de primate afin d'obtenir facilement de grandes quantités de ces cellules à
l'état indifférencié/pluripotent et (ii) de caractériser les propriétés du cycle cellulaire de ces
ES de singe rhésus. En effet, le cycle cellulaire des cellules ES de souris diffère radicalement de celui
des cellules somatiques à de nombreux égards (Savatier et al., 2002). Il semble que ces
caractéristiques atypiques du cycle cellulaire permettent aux cellules ES de maintenir leurs propriétés
d’autorenouvellement et de pluripotence. Le cycle cellulaire des cellules ES de primate n’ayant jamais
été décrit, nous avons donc entrepris de déterminer dans quelle mesure les propriétés déjà observées
chez la souris sont conservées chez le primate. Ce projet s’inscrit dans le contexte des travaux de
l’Unité, qui visent le développement et la validation préclinique de stratégies de thérapie cellulaire,
basées sur l'utilisation des cellules ES de singe pour le traitement de la maladie de Parkinson chez le
singe.
Dans le texte, l’abréviation « mES » correspond aux cellules ES de souris, « hES » aux
cellules ES humaines et «ES» aux deux espèces à la fois.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

1. Définition et applications en clinique et en recherche des cellules ES

1.1 Définition
Les cellules ES sont dérivées des cellules pluripotentes de la masse cellulaire interne (ICM) du
blastocyste préimplantatoire (Reubinoff et al., 2000; Thomson et al., 1998). Elles sont caractérisées
par deux propriétés majeures. (1) L’autorenouvellement : elles peuvent se maintenir et s’amplifier
comme une population pure de cellules indifférenciées pendant de longues périodes de culture avec
un caryotype normal. (2) La pluripotence : elles possèdent la capacité de générer tous les types
cellulaires de l’organisme.
Ces deux caractéristiques primordiales en font un outil idéal pour la thérapie cellulaire, et leurs
applications en recherche sont nombreuses.

1.2 Applications cliniques et en recherche des cellules ES
De par leurs caractéristiques qui les distinguent de toutes les autres cellules souches d’organes
spécifiques identifiées à ce jour (Keller, 2005; Xu et al., 2005b), les cellules ES représentent un enjeu
majeur pour la médecine et la biologie moderne.

1.2.1 Etude génomique
La fonction d’un tiers des gènes humains est encore inconnue, faute de disposer en quantité
suffisante de cellules les exprimant. La possibilité de disposer in vitro de tissus humains dérivés de
cellules ES correspondant à chaque niveau de différenciation, depuis les premiers stades du
développement, offre pour la première fois la possibilité de combler cette lacune importante de la
EPHE Banque de Monographies SVT 7biologie. Plusieurs études indiquent que les cellules hES ont des régulations géniques différentes des
cellules mES (Ginis et al., 2004; Xu et al., 2005b). Les mécanismes qui contrôlent le maintien des hES en état d’autorenouvellement ou leur orientation vers la différenciation sont encore très
mal connus. Le développement de la stratégie des siRNA (Short Interfering RNA) (Fire et al., 1998),
associé à l’utilisation de vecteurs lentiviraux (Chang et Gay, 2001) à expression conditionnelle,
devrait contribuer à faire progresser ces études. En inactivant ou surexprimant chaque gène, il sera en
effet possible d’en déduire leurs fonctions biologiques dans les cellules où ils sont exprimés. Pour la
première fois dans l’histoire de la biologie humaine, il sera possible de disposer, grâce aux cellules
ES humaines, de chaque tissu apparaissant au cours du développement embryonnaire ou adulte, en
quantité non limitative pour la recherche. Cette étape est la condition préalable indispensable et
nécessaire pour étudier les gènes du développement qui représentent une grande partie des gènes
humains non encore caractérisés.

1.2.2 Etude des processus biologiques
Les cellules ES constituent un modèle particulièrement intéressant pour l’étude des
événements se déroulant lors de l’embryogenèse. La compréhension des événements intervenant aux
cours des premières étapes du développement permettra de prévenir ou traiter les problèmes
d’infertilité, d’arrêt de grossesse ainsi que les problèmes survenant lors de la naissance.

1.2.3 Recherche préclinique des maladies génétiques et des cancers
Par recombinaison homologue, il est possible de remplacer un gène par son homologue muté
responsable d’une maladie génétique. Cela permet d’étudier l’effet de la mutation au cours du
développement des tissus. Les cellules hES permettront d’analyser également les remaniements
épigénétiques ou d’éclaircir les mécanismes responsables du développement de cancers qui, dans de
nombreux cas, résultent du disfonctionnements des cellules souches.

1.2.4 Thérapie cellulaire
L’utilisation des cellules ES pour guérir des maladies dévastatrices est certainement
l’application clinique la plus importante de ces cellules. Les cellules ES sont capables de proliférer
indéfiniment en culture et peuvent potentiellement, de par leur propriété de pluripotence, fournir une
source illimitée de cellules adultes spécifiques. Les cellules sont cultivées dans des conditions de
culture définies afin de diriger leur différenciation vers un type cellulaire spécifique. Il a ainsi été
montré que les cellules ES pouvaient se différencier dans de nombreux types cellulaires, comme des
neurones, des cardiomyocytes ou des cellules endodermiques afin de traiter de multiples maladies,
comme la maladie de Parkinson et le diabète de type I. La possibilité de remplacer les cellules
dégénérées par des cellules saines offre un espoir pour des traitements définitifs (Fluckiger et al.,
2003). Cependant, avant d’atteindre cette étape finale d’application, plusieurs sérieux problèmes
devront être résolus tels que par exemple le rejet du greffon (Odorico et al., 2001). Les cellules hES
expriment un niveau très faible de molécules activant une réponse immunitaire. Cependant au cours
de la différenciation, le niveau d’expression d’une de ces molécules, MHC1 (Major
EPHE Banque de Monographies SVT 8Histocompatibility Complex gene 1), est augmenté (Drukker et Benvenisty, 2004), ce qui peut
entraîner un rejet de la greffe en absence de thérapie immunosuppressive. Il existe également un
risque de contamination des cellules hES par les éléments de culture, comme le milieu de culture ou
la couche nourricière contenant des produits animaux, qu’il s’agisse de cellules ou de matrice
extracellulaire. Une équipe vient ainsi de mettre en évidence dans des cellules hES la présence d’un
acide sialique, le Neu5Gc, normalement absent dans les cellules humaines mais présent dans les
cellules de souris (Martin et al., 2005). Ces éléments pourraient compromettre une greffe en induisant
une lyse cellulaire par le système du complément avec les anticorps éventuellement présents chez le
receveur. Des anticorps antiNeu5Gc ont notamment été mis en évidence dans des sérums humains
(Martin et al., 2005). Ce risque pourra être éliminé par la mise au point de systèmes de culture
dépourvus de produits d’origine animale et ne contenant que des molécules humaines appropriées.
Par ailleurs, dans la population de cellules hES différenciées et destinées à être transplantées,
il faudra être capable d’éliminer toute possibilité de développement de tératomes à partir d’une
éventuelle sous-population restée indifférenciée et présente en quantité éventuellement indétectable.
Dans des modèles de greffes de cellules neurales (Zhang et al., 2001) ou endothéliales (Schuldiner et
al., 2003), il n’y a pas eu de développement de tératomes, sans que le risque ait toutefois été éliminé.

1.2.5 Recherche pharmaceutique
La possibilité de produire en grande quantité des microcultures standardisées, correspondant à
chaque tissu ou organe, dans des conditions définies de culture in vitro, permettra le criblage à haut
débit de molécules pouvant aboutir à la découverte de médicaments. Ces études permettraient ainsi de
réduire notablement l’utilisation de modèles animaux. La réduction des coûts, la rapidité et la
meilleure évaluation de l’effet direct d’une molécule sur une cellule humaine devraient
considérablement améliorer les approches de la recherche pharmaceutique dans l’avenir.

1.2.6 Transfert nucléaire
La solution la plus probable pour palier le problème de rejet de greffe est le clonage
thérapeutique. L’objectif de cette approche est de produire des cellules hES pluripotentes contenant le
propre génome nucléaire du patient avant d’induire leur différenciation en cellules spécifiques qui
pourront être transplantées chez ce dernier (Rhind et al., 2003). La technique de transfert nucléaire de
cellules somatiques consiste en l’introduction d’un noyau de cellule somatique d’un donneur adulte
dans un ovocyte énucléé. En culture, les blastocystes issus de ce transfert nucléaire pourront être
utilisés pour dériver des cellules hES possédant le génome du patient et pouvant se différencier dans
tous les types cellulaires. Chez les animaux, la transplantation de cellules différenciées par cette
technique a été une réussite dans le cadre du traitement expérimental de la maladie de Parkinson chez
le modèle rongeur (Barberi et al., 2003). Chez l’homme, cette approche ouvre la perspective
d’améliorer le traitement de nombreuses maladies incurables.

2. Dérivation des cellules ES

EPHE Banque de Monographies SVT 9 La méthode d’isolement des cellules de l’ICM a été mise en place en 1975 par Solter et
Knowles (Solter et Knowles, 1975). Cette méthode a permis, en 1981, à deux équipes (Evans et
Kaufman 1981, Martin 1981) de réussir le premier isolement de cellules ES provenant de blastocystes
de souris. Quatorze ans plus tard, Thomson et ses collègues (Thomson et al., 1995) ont établi les
premières lignées de cellules ES de singe rhésus puis, en 1998, les premières lignées de cellules ES
humaines (Thomson et al., 1998).
La méthode d’isolement des cellules de l’ICM par immunochirurgie du blastocyste est restée
inchangée depuis 1975. Elle est devenue, depuis 1995, la pratique de référence dans de nombreux
laboratoires pour la dérivation des cellules ES de primate. La majorité des lignées de cellules ES
humaines et de primates non humains a été dérivée par cette technique, à partir de blastocystes âgés
de 5 à 8 jours obtenus par fécondation in vitro (FIV). Depuis les années 2000, de nombreuses équipes
ont dérivé de nouvelles lignées de cellules hES selon cette méthode (Kim et al., 2005a; Park et al.,
2003; Pickering et al., 2003; Reubinoff et al., 2000; Stojkovic et al., 2004). La zone pellucide du
blastocyste est tout d’abord éliminée sous l’action enzymatique de la pronase. On pratique, ensuite,
une immunochirurgie à l’aide d’un traitement par des anticorps dirigés contre le sérum entier de
l’espèce cible et par du complément de cobaye. Ceci induit la lyse du trophectoderme qui est
complètement séparé de l’ICM après légère agitation. Finalement, l’ICM isolée est ensemencée sur
des MEF (fibroblastes embryonnaires de souris) nourriciers inactivés. Après quelques jours de
culture, les structures adhérentes qui se sont développées sont transférées en petits amas dans de
nouvelles boîtes de cultures recouvertes également de MEF inactivés. Les colonies contenant des
cellules présentant la morphologie de cellules ES, c'est-à-dire des cellules ayant un rapport nucléo-
cytoplasmique très élevé, deux nucléoles caractéristiques et formant une monocouche de cellules très
denses au centre et plus lâches au pourtour, délimitant une bordure très distincte, sont sélectionnées
pour être amplifiées. Elles formeront, au terme de quelques passages, des colonies de cellules ES. Les
résultats publiés suggèrent que le taux de réussite de la dérivation des lignées de cellules hES dépend
fortement de la qualité initiale des blastocystes, des conditions d’isolement de l’ICM et de
l’expérience des manipulateurs (Mitalipova et al., 2003; Pera et al., 2000).

3. Propriétés des cellules ES

Les cellules ES sont caractérisées par leur capacité à s’autorenouveller, proliférer et par leur
pluripotence. De plus, ces cellules ES doivent également conserver un caryotype normal (euploïde)
pendant des périodes de culture prolongées in vitro.

3.1 Autorenouvellement
La caractéristique majeure définissant les cellules ES est leur capacité à se diviser sans se
différencier pour obtenir une descendance pluripotente identique. On parle alors
d’autorenouvellement permanent. Cette propriété confère aux cellules ES un potentiel prolifératif
illimité tout en conservant un phénotype normal et un caryotype euploïde.

EPHE Banque de Monographies SVT 10