MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE DE LA RECHERCHE ET DE LA TECHNOLOGIE

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Niveau: Supérieur, Master, Bac+5

  • mémoire


MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE DE LA RECHERCHE ET DE LA TECHNOLOGIE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et la Terre Mémoire présenté par Clémence THOMAS pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes EFFET DE L'INACTIVATION DE p53 DANS DES CELLULES MAMMAIRES IMMORTALISÉES soutenu le 12 Mars 2007 devant le jury suivant : Mme C. Bellaton - Maître de conférences - Rapporteur et Présidente Mr J.M. Exbrayat - Professeur - Examinateur Mme C. Caron de Fromentel - Docteur - Examinatrice Mme A-P Morel - Docteur - Examinatrice Laboratoire d'étude du développement post-embryonnaire des vertébrés inférieurs EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) Directeur : Pr. J.M. Exbrayat Unité d'Oncologie moléculaire Directeur : Pr. A. Puisieux Centre Léon Bérard 28, rue Laënnec Encadrante : Dr A-P Morel EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • stress génotoxique…………………

  • cellule

  • cible p21 dans les lignées surexprimant

  • aminés adn acide

  • validation de l'inactivation de p53 dans les cellules mammaires

  • p53

  • incorporation de iodure de propidium……………………………………45

  • analyse de l'expression de p53

  • cancer du sein………………………

  • cellule mammaire


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Publié le 01 mars 2007
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Langue Français
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     MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE DE LA RECHERCHE ET DE LA TECHNOLOGIE  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et la Terre   Mémoire présenté par  Clémence THOMAS  pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes    EFFET DE L’INACTIVATION DE p53 DANS DES  CELLULES MAMMAIRES IMMORTALISÉES  
   soutenu le12 Mars 2007                                                           devant le jury suivant :   Mme C. Bellaton - Maître de conférences - Rapporteur et Présidente Mr J.M. Exbrayat - Professeur - Examinateur Mme C. Caron de Fromentel - Docteur - Examinatrice Mme A-P Morel - Docteur - Examinatrice    Laboratoire d’étude du développement post-embryonnaire des vertébrés inférieurs EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre)Directeur : Pr. J.M. Exbrayat   Unité d’Oncologie moléculaire Directeur : Pr. A. Puisieux Centre Léon Bérard puisieux@lyon.fnclcc.fr 28, rue Laënnec Encadrante : Dr A-P Morel
Clémence THOMAS
69008 Lyon morela@lyon.fnclcc.fr                                                                                                                     EFFET DE L’INACTIVATION DE p53 DANS DES CELLULES MAMMAIRES IMMORTALISÉES    RÉSUMÉ Le gène suppresseur de tumeurTP53 altéré avec une fréquence très élevée de 60% dans les est cancers humains et de 25% dans les cancers du sein. La protéine p53 joue un rôle essentiel dans de nombreux événements cellulaires tels que la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la réponse aux stress, la sénescence et la réplication de l’ADN. L’inactivation de la protéine p53 semble être un évènement précoce dans la carcinogenèse mammaire. Par conséquent, il nous a semblé intéressant d’étudier les conséquences biologiques de l’inactivation de p53 dans des cellules non transformées. Pour cela nous avons créé un modèle cellulaire de cellules immortalisées mammaires et inactivées pour p53 par la méthodologie siRNA. Suite à l’obtention de ces différentes lignées, nous avons étudié leur prolifération et ainsi pu démontrer que les cellules inactivées pour p53 ont acquis un avantage de croissance. Nous avons également démontré que suite à un stress génotoxique de type irradiation gamma ou traitement à l’adriamycine, les cellules inactivées échappent à l’arrêt du cycle cellulaire en phase G1. De manière tout à fait intéressante, nous avons observé que la réponse au traitement à l’adriamycine, à la différence de l’irradiation, semble dépendante du degré d’inactivation de p53 : en effet les cellules partiellement inactivées (50% du taux normal de p53) présentent une réponse semblable aux cellules p53 sauvage alors que les cellules plus fortement inactivées perdent la réponse p53 dépendante. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que la surexpression d’un oncogène tel que ErbB2 est plus facilement tolérée dans les cellules possédant une inactivation de p53. Enfin, nous avons démontré que les cellules inactivées pour p53 placées dans un environnementin vitrofavorable à la morphogenèse mammaire, ne perdent pas la capacité à former des acini, les structures multicellulaires obtenues présentent un défaut de lumière centrale et d’organisation structurale.   Mots clés : cancer du sein, p53, stress génotoxiques, stress oncogénique, acini.                                                                          Tables des matières  LISTE DES ABREVIATIONS…...………………………………………………………..1 LISTE DES FIGURES…….……………………………………………………………….2 LISTE DES TABLEAUX…..………………………………………………………………4 RESUME…………..……………………………….………………………………5..……… INTRODUCTION…….…..……………………………………………………………..6 à7
 
Première partie : Notions bibliographiques…..…………………….…………….8 à 29                I.     Le cancer du sein……………………….……….………………...………………...8  I.1. Développement et anatomie de la glande mammaire………………………….8  I.2. Les pathologies du sein………………………………………………………...9  I.3. Facteurs de risques…………………………………..…...……………….….11  I.4. Histoire naturelle du cancer du sein…………………………………………..14  I.5. Altérations génomiques dans les cancers du sein…………………………….15                                                                                                                                                                        II.     Le gène suppresseur de tumeur TP53 …………………………………………19  II.1. Historique …………..…………………………………….………………….19  II.2. Famille p53………………………………………………………...……...…20     II.3. Le gèneTP53….……………...…...……………………………...………….20  II.4. La protéine p53 ...………………………………..…………....……………..21  II.5. Régulation de p53………………………………..…………….…………….23  II.6. Les cibles connues de p53 ……………………………..……………….……24  II.7. Fonctions biologiques de p53 sauvage …………………..…………………..25  II.8. Mode d’inactivation de p53…………………...……………………………..27  Deuxième partie : Contexte de l’étude et objectifs………………..…..………30 à 31  Troisième partie : Matériels et Méthodes……………………………………….32 à 46  I. Lignées et culture cellulaire…………………………...…………………………32 II. Vecteurs d’expression et méthodologie………………………………...……….35  II.1. vecteurs d’expression de p53………………...……………………………...35  II.2. transfection…………………………………………………………………..37  II.3. infection virale ………………………………...…………………………….38 III. Sous clonage………………………………...…………………………………...39  IV. Techniques immunochimiques………………………………...……………….39  IV.1. Western-immunoblotting…………………………………………………. 39  IV.2. Immunomarquage à la péroxydase .…...……………………………………41  IV.3. Immunofluorescence sur acini……………………………………………...42  V. Test de clonogenicit酅………………………...……………………………...42