MINISTERE DE LA JEUNESSE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE

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Niveau: Supérieur, Master, Bac+5

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences et Vie de la Terre Mémoire présenté par Cynthia FOURGEUX Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes. Stratégies de vaccination contre le Rotavirus. Soutenu le 13 / 07 / 2007, devant le jury suivant : Mme CORDIER Geneviève – Présidente du jury Mme KOHLI Evelyne - Rapporteur M. PONCET Didier - Examinateur Directeur d'Etudes EPHE : Thierry DUPRESSOIR Biologie Intégrative et Virologie des Insectes INRA UMR1231-BIVI Laboratoire EPHE de Pathologie comparée des Invertébrés case courrier 101, Pl. Eugene Bataillon 34095 Montpellier cedex 5 courriel/e-mail: Directeur Scientifique: Isabelle SCHWARTZ-CORNIL Immunobiologie des Viroses des Ruminants Virologie et Immunologie Moléculaires Centre de Recherche INRA- Domaine de Vilvert 78352 Jouy en Josas cedex courriel/e-mail : RESUME Le rotavirus est la principale cause des diarrhées sévères chez l'enfant de moins de 5 ans à travers le monde. Le développement d'un vaccin efficace et bien toléré contre le rotavirus fait partie des priorités de l'Organisation Mondiale de la Santé. Bien que deux vaccins vivants atténués ont été récemment commercialisés, le Rotateq® (Sanofi- Pasteur) et le Rotarix® (GSK), ces deux vaccins doivent prouver à grande échelle et sur le long terme, leur efficacité en terme de protection et leur inocuité.

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Publié le 01 juillet 2007
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences et Vie de la Terre
Mémoire présenté par Cynthia FOURGEUX Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes.
Stratégies de vaccination contre le Rotavirus. 
Soutenu le 13 / 07 / 2007, devant le jury suivant : Mme CORDIER Geneviève – Présidente du jury Mme KOHLI Evelyne - Rapporteur M. PONCET Didier - Examinateur  
Directeur d’Etudes EPHE :Thierry DUPRESSOIR  Biologie Intégrative et Virologie des Insectes INRA UMR1231-BIVI Laboratoire EPHE de Pathologie comparée des Invertébrés case courrier 101, Pl. Eugene Bataillon 34095 Montpellier cedex 5 courriel/e-mail: tdupressoir@univ-montp2.fr   Directeur Scientifique:Isabelle SCHWARTZ-CORNIL Immunobiologie des Viroses des Ruminants Virologie et Immunologie Moléculaires Centre de Recherche INRA- Domaine de Vilvert 78352 Jouy en Josas cedex courriel/e-mail : isabelle.schwartz@jouy.inra.fr      RESUME Le rotavirus est la principale cause des diarrhées sévères chez l’enfant de moins de 5 ans à travers le monde. Le développement d’un vaccin efficace et bien toléré contre le rotavirus fait partie des priorités de l’Organisation Mondiale de la Santé. Bien que deux vaccins vivants atténués ont été récemment commercialisés, le Rotateq® (Sanofi- Pasteur) et le Rotarix® (GSK), ces deux vaccins doivent prouver à grande échelle et sur le long terme, leur efficacité en terme de protection et leur inocuité. Cependant, les vaccins sous-unitaires à base de pseudo-particules virales dénouées de capacité réplicative fournissent des
résultats prometteurs et leur administration par voie rectale semble tout à fait adaptée pour lutter contre un pathogène intestinal tel que le rotavirus. Dans ce travail, nous avons tiré profit des propriétés antigéniques des pseudo-particules virales pour vacciner des souris par voie rectale avec des VLP 2-8/6/7.  Ces VLP, administrées avec la toxine cholérique ou différentes toxines labiles d’ E. coli partiellement détoxifiées, induisent un taux d’anticorps spécifiques du rotavirus significatif dans le sérum et les selles des souris vaccinées. Ces pseudo-particules, qui comprennent des protéines d’origine bovine, sont efficaces pour protéger contre l’infection hétérologue avec du rotavirus murin. L’utilisation large de ces pseudo-particules de rotavirus, qui représentent de bons candidats vaccins, mérite d’être appronfondie et permettrait d’étudier plus précisément certains aspects de la réponse immunitaire anti-rotavirus. ABSTRACT Rotaviruses are the leading cause of viral gastroenteritis in young children worldwide. Development of an effective vaccine and tolerated well against the rotavirus forms part of the priorities of the World Health Organization. Althrough two attenuated live vaccines were recently marketed, Rotateq® (Sanofi- Pasteur) and Rotarix® (GSK), these two vaccines must prove on a large scale and on the long term, their effectiveness in term of protection and their inocuity. Virus-like particles (VLP) are non replicating structures that mimic virus counterparts in morphology and immunogenicity, ans that could be safe and efficient vaccine candidates. In this work, we took advantage of the immunogenic properties of virus-like particles to demonstrate that rectal administration of rotavirus 2-8/6/7 VLP is efficient to induce specific immune response and protection against rotavirus infection in mice. The broad use of these virus-like particles which are a promising alternative to the use of oral live rotavirus vaccines, should provide useful tools to study some aspects of the rotavirus immune response. Sommaire ABRÉVIATIONS UTILISÉES 5 CONTEXTE SCIENTIFIQUE 7 I GENERALITES SUR LE ROTAVIRUS 7 I 1 Rotavirus et diarrhées sévères : impact mondial 7 -I - 2 Rotavirus : transmission 7 I - 3 Classification et épidémiologie 8 I - 4 Pathologie 9 aurait donc virémie au cours du cycle infectieux. 9 I - 5 Morphologie et composition de la particule virale 10 II STRUCTURE DU ROTAVIRUS 11 II - 1 Structure du génome viral 11 II - 2 Protéines de structure et propriétés d'assemblage 12 II-2 a Les protéines du cœur : VP1,VP2,VP3 12 II-2 b VP6 , la protéine de la capside intermédiaire du virus 13 1 - Les modifications post-traductionnelles de VP6 13 2 - Les trimères de VP6 14 3 - Propriétés physicochimiques 14 4 - Propriétés d'assemblage et d'auto-assemblage 15 5 - L'assemblage de VP6 sur le cœur du virus 16 6 - Résidus d’assemblage de VP6 avec VP2 16 7 - Résidus d’assemblage de VP6 avec VP7 et VP4 16 8 - VP6 : une cible vaccinale intéressante ? 17 II-2 c Les protéines VP7 et VP4 de la capside externe 17 II - 3 Les pseudo particules virales de rotavirus (VLP) 19 II - 4 Le cycle infectieux 19 II - 5 Physiopathologie 21 III LE SYSTEME IMMUNITAIRE DE LA MUQUEUSE INTESTINALE ET LE MAINTIEN DE LHOMEOSTASIE 23 III - 1 Système immunitaire organisé associé à la muqueuse intestinale 23 III - 2 Système immunitaire diffus associé à la muqueuse intestinale 24 III-2 a Les l intra é 24
III-2 b La lamina propria 24 III - 3 Domiciliation des lymphocytes intestinaux 24 III - 4 Les immunoglobulines de la lumière intestinale 25 IV IMMUNITÉ ANTI-ROTAVIRUS ET STRATÉGIES VACCINALES 26 IV - 1 Immunité 26 IV - 2 Les différentes populations lymphocytaires : rôles dans la défense 28 IV-2 a Réponse immunitaire cellulaire 28 IV-2 b Les lymphocytes T CD8+ participent à l'élimination du virus 28 IV-2 c Les lymphocytes T CD4+: quel rôle dans la protection ? 29 IV-2 d Réponse immunitaire humorale 31 IV-2 e Les lymphocytes B : acteurs majeurs de la protection ? 31 1- Rôle des lymphocytes B dans la protection 31 2- Mécanisme de blocage par les anticorps 32 2-a Les IgA anti-VP6 32 2-b Les anticorps anti-VP7 et VP4 33 V TRAITEMENT 35 VI LES VACCINS ANTI-ROTAVIRUS 37 VI - 1 Vaccins vivants : inconvénients 37 VI - 2 Les vaccins vivants atténués 38 VI-2 a Le Rotashield® : une durée de vie courte 38 VI-2 b Les vaccins vivants actuels 39 1 - RotaTeq (Merck&co, Inc, Whitehouse Station, NJ 08889, USA) 40 2 - Rotarix® (GlaxoSmith Kline,GSK Biologicals) 41 3 - Les vaccins RotaTeq® et Rotarix® sont-ils vraiment sûrs ? 41 4 - Les autres vaccins vivants 43 VII LES VACCINS RECOMBINANTS : UNE ALTERNATIVE À L'UTILISATION DE VIRUS VIVANTS ATTÉNUÉS 44 VII - 1 Les pseudo-particules virales de rotavirus 44 VII - 2 Production des pseudo-particules du rotavirus 45 VIII ETUDE DE LA RÉPONSE IMMUNITAIRE ASSOCIÉE AUX VLP 47 VIII - 1 Essais d’immunisation avec les pseudo-particules du rotavirus 47 VIII - 2 Quels types de VLP utiliser ? 48 VIII - 3 Les protéines recombinantes utilisées en vaccination 49 VIII - 4 Propriétés immunogéniques des VLP chimériques de rotavirus 50 BUTS DU TRAVAIL 51 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 53  ABRÉVIATIONS UTILISÉES  AMM : Autorisation de mise sur le marché ARN : Acide ribonucléique, ARNm : ARN messager, ADN : Acide désoxyribonucléique CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité CNP : C-type natriuretic peptide CT : toxine cholérique CpG : ologonucléotides non méthylés CsCl : Chlorure de césium DLP : Double-Layered Particles (particules double couche) DTT : Dithiotreitol ED(G)TA : acide éthylène-diamine (glycol)-tetraacétique eIF4G : facteur d’initiation de la traduction ELISA : Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay, technique d’immuno absorption enzymatique FDA : Food and Drug Administration GRP : Gastrin-releasing peptide GMT : moyennes géométriques hSC (SC) : pièce sécrétoire humaine
Hsc70 : heat-shock cognate protein 70 IgA7D9 : Immunoglobuline A monoclonale dirigée contre VP6 i.p. : intra-péritonéal IS : Intussusception, IIA : Invagination Intestinale Aigüe kDa : kilo Dalton LT : Lymphocytes T, CTL : Lymphocytes T cytotoxiques LT: toxines bactériennes labiles LB : Lymphocytes B LIE : Lymphocytes intra-épithéliaux  MAdCAM1 : Mucosal Addresin Cell Adhesion Molecule 1 NIF : adjuvant immunosol nano-particulaire NSP : protéine virale non structurale OMS : Organisation Mondiale de la Santé ORF : open range frame PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis pIgA/ dIgA : IgA polymérique/dimérique, pIgR : récepteur polymérique aux IgA SIgA : complexe formé de pIgA et hSC PM : Poids Moléculaire : réticulum endoplasmique RE RV : Rotavirus RRV : rhésus Rotavirus, souche simienne, RF : Rotavirus français, souche bovine RT-PCR : Transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne SA : Acide sialique  SCID : Severe Combined Immuno Disease SD50 : dose induisant la production virale chez 50% des individus SDS : Sodium Dodécyl Sulfate TLP : Triple-Layered Particles (particules triple couche) TLR : Toll-Like Receptors VLP : Virus-Like Particles (pseudo particules virales) VP : Protéine virale structurale  
 CONTEXTE SCIENTIFIQUE  I GENERALITES SUR LE ROTAVIRUS I - 1 Rotavirus et diarrhées sévères : impact mondial   Les maladies entraînant des diarrhées sont l’une des causes majeures de morbidité et de mortalité infantile dans les pays en voie de développement. Elles sont responsables de 2,5 millions de décès par an, principalement chez les enfants de moins de 5 ans (Koseket al., 2003; Parasharet al., 2003). Parmi les différents agents infectieux identifiés, les Rotavirus (RV) occupent mondialement la première place et sont la cause de diarrhées sévères chez l’enfant. Ils sont responsables dans 20 à 30 % des cas, de diarrhées et de quelques 500 000 décès chaque année dont 85% se produisent dans les populations des pays les plus défavorisés. Malgré une mortalité faible dans les pays industrialisés, les épisodes de gastroentérites à RV représentent un important problème de santé publique : les infections à RV sont la cause principale d’hospitalisation infantile pour diarrhées (Fischeret al., 2004) et durant les pics saisonniers d’infection elles