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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
N° d'ordre : ………………. THESE Présentée pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE Ecole doctorale Sciences Ecologiques Vétérinaires Agronomiques Bioingénieries Spécialité: Toxicologie et Sécurité des Aliments Par : Mlle TOZLOVANU Mariana Evaluation du risque de contamination alimentaire en mycotoxines néphrotoxiques et cancérogènes (notamment l'ochratoxine A) : Validation de biomarqueurs d'exposition et d'effet . Soutenue le 3 juillet 2008 devant le jury composé de : Pr Dupouy Eleonora, Université Technique de Moldova, Chisinau, Moldavie Président du jury Pr Leszkowicz Annie, Lab. de Toxicologie et Sécurité Alimentaire, UMR/CNRS 5503, ENSAT Toulouse Directeur de thèse Pr Ciumac Jorj, Université Technique de Moldova, Chisinau, Moldavie Co-Directeur de thèse Pr Larondelle Yvan, Université catholique de Louvain, Belgique Rapporteur Dr Roussos Sevastianos, Université Paul Cezanne, Marseille, France Rapporteur Pr Manderville Richard, University of Guelph, Ontario, Canada Examinateur

  • estimation des risques

  • principe général des extractions des mycotoxines

  • adduits stables

  • extraction au toluène en milieu acide

  • formation d'adduits

  • evaluation du risque de contamination alimentaire en mycotoxines


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Publié le 01 juillet 2008
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Langue Français
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N° d’ordre : ………………. THESE Présentée pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE  Ecole doctorale Sciences Ecologiques Vétérinaires Agronomiques Bioingénieries Spécialité: Toxicologie et Sécurité des Aliments Par : Mlle TOZLOVANU Mariana "Evaluation du risque de contamination alimentaire en mycotoxines néphrotoxiques et cancérogènes (notamment l’ochratoxine A) : Validation de biomarqueurs d’exposition et d’effet ". Soutenue le 3 juillet 2008 devant le jury composé de : Pr Dupouy Eleonora, Université Technique de Moldova, Chisinau, Président du jury Moldavie Pr Leszkowicz Annie, Lab. de Toxicologie et Sécurité Alimentaire, Directeur de thèse UMR/CNRS 5503, ENSAT Toulouse Pr Ciumac Jorj, Université Technique de Moldova, Chisinau, Co-Directeur de thèse Moldavie Pr Larondelle Yvan, Université catholique de Louvain, Belgique Rapporteur Dr Roussos Sevastianos, Université Paul Cezanne, Marseille, France Rapporteur Pr Manderville Richard, University of Guelph, Ontario, Canada Examinateur
Remerciements Le travail présenté dans cette thèse de doctorat a été effectué au laboratoire de Génie Chimique (UMR 5503, CNRS-INPT-UPS) au sein du Département « Bioprocédés et Systèmes Microbiens » à l’École Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse (ENSAT-INPT) France, sous la direction scientifique de Mme Annie LESZKOWICZ en cotutelle avec l’Université Technique de Moldova, sous la direction de M. Jorj CIUMAC, co-directeur de thèse. Je tiens avant tout à exprimer ma sincère gratitude à Mme Annie Leszkowicz, qui m’a accueillie au sein de son laboratoire, il y a de nombreuses années. Elle m’a permis de me former à la recherche en débutant par le stage de Master en 2004 puis en me donnant l’opportunité de continuer par une thèse au sein de son équipe ainsi que de m’avoir aidée à financer ma thèse. Je la remercie pour sa compétence scientifique et sa disponibilité.  J’exprime ma sincère gratitude à M. Jorj Ciumac d’avoir accepté être co-directeur de ma thèse, pour son soutien et son aide. Je remercie vivement le Dr Roussos et le Pr Larondelle d’avoir si gentiment accepté la lourde tache d’examiner ce travail et d’en être les rapporteurs. Je remercie Mme Dupouy et le Pr. Manderville d’avoir accepté d’examiner ce travail. Je ne saurais oublier tous ceux qui m’ont apporté leurs savoirs faire, leurs aides techniques, leur expérience, nécessaires pour la réalisation et le développement de ce travail. Je remercie tout particulièrement Virginie, qui, pendant quatre années, m’a épaulée quotidiennement ; un grand merci pour ta gentillesse, pour ton soutien chaleureux et tes encouragements. Je remercie Delphine, qui m’a initiée à la recherche, malgré les différences de caractère ! Ma reconnaissance va également à tous mes collègues du laboratoire qui par leur bonne humeur m’ont aidée à mener à bien ce travail : Dalal, Chakib, Jelena, Tri, … Je remercie également mes stagiaires : Kheira, Diana, Sadaf, Jovica, Stephanie, Halidi qui sont passés par le labo et qui m’ont apporté une aide précieuse tout le long de la thèse.  Je remercie l’Agence Universitaire de la Francophonie, l’Aliance Française à Moldavie (bourse EIFFEL), la Ligue contre le cancer, l’Association pour la Recherche sur le cancer (ARC) pour le soutien financier et leur confiance dans mon travail. Nos remerciments vont aussi à l’INC (Institut National de la Consommation), en particulier Rémy REUSS et Robert VICTORIA qui nous ont confié les études sur le café et les céréales du peti-déjeuner. J’adresse à mes parents et à ma soeur un grand et tout particulier « merci », qui de loin, mais toujours présents et proches dans mon cœur, ont su m’encourager et me soutenir dans les différentes situations de ma vie. Un grand merci à M’hamed. Trouve ici l’expression de ma reconnaissance pour toutes les discussions scientifiques que j’ai eues avec toi.
2
Sommaire
Remerciements..................................................................................................... 2
Liste des figures et des tableaux....................................................................... 11
Liste des abréviations........................................................................................ 15
Liste des publications ........................................................................................ 17
Liste des communications à des congrès internationaux............................... 19
Introduction ....................................................................................................... 21
Analyse bibliographique ................................................................................... 24
1. Généralités sur les mycotoxines ................................................................... 25
2. L'ochratoxine A. ............................................................................................ 28
2.1 Origine et structure. .................................................................................... 28
2.2 Production de l'OTA. .................................................................................. 28
2.3 Présence d'OTA dans les aliments / exposition de l'homme / estimation du risque. ............................................................................................................ 29 2.3.1 Présence d'OTA dans les aliments. ..................................................... 29 2.3.2 Contamination par l’OTA de l’ensemble de la chaîne alimentaire . 31
2.4 Toxicocinétique de l'OTA. .......................................................................... 33
2.5 Effets toxiques.............................................................................................. 34 2.5.1 Toxicité aiguë......................................................................................... 34 2.5.2 Toxicité subaiguë et chronique. ........................................................... 35 2.5.2.1 Néphrotoxicité................................................................................. 35 2.5.2.2 Carcinogénicité ............................................................................... 36
2.6 Mécanismes de génotoxicité et mutagénicité ............................................ 37 2.6.1 Mutagénicité de l'OTA ......................................................................... 37 2.6.2 Formation d'adduits à l'ADN .............................................................. 37
3
3. Autres mycotoxines contaminant la chaine alimentaire............................ 39
3.1 Citrinine ....................................................................................................... 39 3.1.1 Origine et structure de la Citrinine..................................................... 39 3.1.2 Toxicocinétique ..................................................................................... 39 3.1.3 Effets toxiques ....................................................................................... 40
3.2 La Fumonisine B1........................................................................................ 41 3.2.1 Origine et structure de la FB1.............................................................. 41 3.2.2 Exposition de l’homme ......................................................................... 41 3.2.3 Toxicocinétique ..................................................................................... 41 3.2.4 Effets toxiques ....................................................................................... 42
3.3 Les Aflatoxines............................................................................................. 43
3.4 La Zéaralénone ............................................................................................ 44
4. Législation concernant les mycotoxines ...................................................... 45
4.1 Etat de la réglementation............................................................................ 45
4.2 Règlement (CE) No 1881/2006 de la commission du 19 décembre 2006 portant fixation de teneurs maximales pour certains contaminants dans les denrées alimentaires.......................................................................................... 46
5. Métabolisation des xénobiotiques ................................................................ 49
5.1 Généralités. .................................................................................................. 49
5.2 Les peroxydases. .......................................................................................... 51
5.3 Les glutathion-S-transférases..................................................................... 52
6. Cancérogenèse et adduits à l'ADN............................................................... 54
6.1 Notions générales de cancérogenèse .......................................................... 54
6.2 Les adduits à l'ADN comme marqueurs de la génotoxicité .................... 56
6.3 Effets biologiques des adduits à l'ADN ..................................................... 56 6.3.1 Adduits stables et adduits dépurinants............................................... 56 6.3.2 Formation d'adduits et cancérogenèse ............................................... 57
4
6.3.3 Adduits comme marqueurs d'exposition ............................................ 59
Matériels et méthodes ....................................................................................... 60
1.1 Principe général des extractions des mycotoxines ................................... 61
1.2 Préparation des solutions standards de toxines ....................................... 62
1.3 Extraction des mycotoxines à partir des différentes matrices alimentaires solides (café, céréales, olives, noix, épices,…) ........................... 64
1.4 Protocole d’extraction de l’ochratoxine A à partir du café torréfié : d’après la norme CEN 14132 ........................................................................... 64
1.5 Protocole d’extraction de l’OTA sur le café torréfié norme CEN 15141-1 extraction au toluène en milieu acide .............................................................. 65
1.6 Méthode d’extraction de l’OTA sur le café selon A. Pittet (1996) ........ 66
1.7 Protocole d’extraction de l’OTA sur le café « boisson » ......................... 66 1.7.1 Protocole d’extraction de l’OTA sur le café « boisson » de base .... 66 1.7.2 Protocole d’extraction sur le café « boisson » modifié selon le protocole proposé par A. Pittet..................................................................... 67
1.8 Extraction de l'OTA, ses dérivés et autres mycotoxines à partir des organes................................................................................................................ 67
1.9 Extraction de l'OTA, ses dérivés et autres mycotoxines à partir des urines .................................................................................................................. 67
1.10 Méthode d’extraction de l’OTA, ses dérivés et autres mycotoxines à partir du sang..................................................................................................... 68
1.11 Extraction de l'OTA, ses dérivés et autres mycotoxines à partir des surnageants cellulaires ...................................................................................... 68
1.12 Confirmation de la présence d’OTA par hydrolyse par la carboxypeptidase ............................................................................................... 68
2. Techniques analytiques
des mycotoxines .................................... 69
2.1 Produits et matériels ................................................................................... 69
2.2 Appareillage. ................................................................................................ 69
5
2.3 Analyses par Chromatographie en phase Liquide de Haute Performance (HPLC) ............................................................................................................... 70 2.3.1 Principe de l’HPLC .............................................................................. 70 2.3.2 Description du système HPLC............................................................. 70 2.3.3 Paramètres d'analyse HPLC ............................................................... 71 2.3.3.1 Analyses HPLC réalisées en conditions isocratiques .................. 71 2.3.3.2 Analyses HPLC réalisées en conditions de gradients ................. 71 2.3.3.3 Analyses HPLC pour la détection des aflatoxines....................... 72 2.3.3.4 Analyses HPLC réalisées afin de détecter des fumonisines ...... 73 2.3.4 Protocole pour l'analyse d'échantillons par HPLC ........................... 73 2.3.5 Préparation des standards OTA (OTHQ, OTB-Br) /GSH et OTA (OTHQ, OTB-Br) /NAC................................................................................ 73
3. Utilisation de lignées cellulaires ................................................................... 74
3.1 Description des souches cellulaires ............................................................ 74
3.2 Produits utilisés en culture cellulaire ........................................................ 74
3.3 Conditions de culture .................................................................................. 74 3.3.1 Maintien des constantes physico-chimiques....................................... 74 3.3.2 Mise en culture d'une lignée cellulaire................................................ 74 3.3.3 Amplification d’une lignée cellulaire .................................................. 74 3.3.4 Mise en conservation d'une culture cellulaire.................................... 75
3.4 Conditions de traitement des cellules ........................................................ 76
4. Test de cytotoxicité ........................................................................................ 76
4.1 Produits utilisés pour le test de cytotoxicité.............................................. 76
4.2 Principe du test de cytotoxicité .................................................................. 76
5. Utilisation de microsomes pour l'étude de l'adduction à l'ADN et de la métabolisation .................................................................................................... 77
5.1 Préparation des microsomes à partir de tissus......................................... 77
5.2 Dosage des protéines totales ....................................................................... 78
5.3 Conditions d'incubations des microsomes ................................................ 78  6
5.4 Purification des ADN incubés avant analyse des adduits formés.......... 78
6. Extraction et purification de l'ADN ............................................................ 80
6.1 Extraction de l'ADN.................................................................................... 80 6.1.1 A partir de tissus ................................................................................... 80 6.1.2 A partir du sang .................................................................................... 80 6.1.3 A partir des cellules .............................................................................. 80
6.2 Purification et dosage de l'ADN................................................................. 81
6.3 Estimation de la qualité et de la quantité d'ADN..................................... 81
7. Analyse des adduits à l'ADN par la méthode du post-marquage au phosphore 32 ...................................................................................................... 82
7.1 Produits utilisés pour le post-marquage ................................................... 82 7.1.1 Les produits chimiques......................................................................... 82 7.1.2 Les enzymes ........................................................................................... 82 7.1.3 Matériels de chromatographie............................................................. 82 7.1.4 Les adduits standard ............................................................................ 82
7.2 Principe du post-marquage ........................................................................ 83
7.3 Marquage des adduits ................................................................................. 84
7.4 Autoradiographie et quantification des adduits....................................... 86
Résultats ............................................................................................................. 87
Chapitre I ........................................................................................................... 88
Améliorations des téchniques d’analyse des mycotoxines. Identification des causes de sous-estimation des contaminations................................................ 88
1. Identification des causes de sous estimation lors de l’analyse de mycotoxines ........................................................................................................ 89 1.1. Problème d’isomérisation de l’OTA dans le café ................................ 89 1.2. Modification des Aflatoxines B en présence de la lumière ................. 90 1.3. Les problèmes liés aux colonnes d’immunoaffinité. ........................... 91
7
1.4. Test sur la compétition de l’OTA, l’OTB et l’OP-OTA au niveau des colonnes d’immunoaffinité............................................................................ 91
2. Amélioration des conditions d’analyse des métabolites de l’OTA. Changement de la longueur d’onde pour OTHQ pour HPLC ..................... 92
Chapitre II.......................................................................................................... 94
Analyse des mycotoxines dans diverses matrices alimentaires..................... 94
1. Céréales brutes : blé, maïs, riz ..................................................................... 96
2. Céréales transformés : Céréales petit déjeuner ......................................... 98 2.1 Echantillonnage........................................................................................ 98 2.2 Résultats bruts.......................................................................................... 98 2.2 Analyse des résultats de céréales petit déjeuner : Toxine par toxine . 99 2.3 Conclusions ............................................................................................. 100
3. Olive .............................................................................................................. 102
4. Noix ............................................................................................................... 103
5. Epices ............................................................................................................ 104
6. Vin, bière ...................................................................................................... 104
7. Café ............................................................................................................... 105 7.1 Les échantillons de café. ........................................................................ 105 7.2 Les techniques d’analyse de l’OTA dans le café ................................. 105 7.3 Rendement de récupération de l’OTA par ces différentes techniques ........................................................................................................................ 106 7.4 Analyse des cafés moulus ...................................................................... 107 7.5 Confirmation de la présence d’OTA et OTB dans le café par dégradation par la carboxypeptidase A..................................................... 109 7.6 Café « boisson »..................................................................................... 111 7.7 Conclusions concernant la contamination en OTA des cafés ........... 113
8. Evaluation des risques ................................................................................ 115 8.1. Simulation de l'apport en OTA ........................................................... 115 8.1.1. Café .................................................................................................. 115 8.1.2. Céréales petit déjeuner. ................................................................. 116  8
8.1.3. Céréales brutes : riz, blé ................................................................ 116 8.1.4. Olives ............................................................................................... 116 8.1.5 Noix, vin, bière, épices..................................................................... 117 8.2. Simulation de l'apport en FB............................................................... 117 8.2.1. Céréales petit déjeuner .................................................................. 117 8.2.2 Céréales brutes : maïs ..................................................................... 118 8.3 Simulation de l'apport en ZEA dans les céréales petit déjeuner ...... 118 8.4 Simulation de l'apport en AFB ............................................................ 118 8.4.1 Riz ..................................................................................................... 119 8.4.2 Olive .................................................................................................. 119 8.4.3 Vin et bière ....................................................................................... 119 8.5 Simulation de l'apport en plusieurs mycotoxines simultanément.... 119
CHAPITREIII .................................................................................................... 121
Etude de mécanisme d’action de l’ochratoxine A (OTA). Rôle du dérivé Quinone de l’OTA (OTHQ). .......................................................................... 121
Etude de la synergie entre l’OTA et la Citrinine. ........................................ 121
1. Rappel des études antérieures.................................................................... 122
2. Etudein vitro................................................................................................ 124
2.1 Description des dérivés de l'ochratoxine A étudiés................................ 124
2.2 Métabolites étudiés dans notre étude. .................................................... 124 2.2.1 Ochratoxine B (OTB) ......................................................................... 124 2.2.2 L'hydroquinone d'ochratoxine (OTHQ) .......................................... 125 2.2.3 Dérivé synthétique d’OTA : Ochratoxine B - Bromé (OTB-Br).... 125
2.3 Etude de cytotoxicité. ................................................................................ 126 2.3.1 Choix des modèles cellulaires d’étude ............................................. 126 2.3.2 Effets cytotoxiques d’OTA et de CIT sur la viabilité cellulaire ..... 126 2.3.3 Etude de la toxicité d’une co-contamination OTA/CIT .................. 128 2.3.4 Cytotoxicité d’OTHQ, OTB et OTB-Br ........................................... 128
9
2.4 Etude de génotoxicité. ............................................................................... 131 2.4.1 Génotoxicité d’OTHQ. Rôle de la forme hydroquinone de l’OTA (OTHQ) dans la formation d’adduits à l’ADN ......................................... 131 2.4.2 Formation des adduits à l’ADN dans les cellules rénales humaines par OTA, CIT............................................................................................... 132
2.5. Etude de métabolisation d’OTA et de ses dérivées. La conjugaison d'OTA au glutathion (GSH) et à la N-acétylcystéine (NAC). ..................... 133
Chapitre IV ...................................................................................................... 138
Etude pré-épidemiologique sur trois familles serbes. Implication des mycotoxines dans les néphropathies et les tumeurs du tractus urinaire. .. 138
1. Introduction ................................................................................................. 139
2. Contamination de la nourriture................................................................. 141
3. Teneur en OTA et CIT dans les urines de familles serbes ...................... 143
4. Teneur en OTA et CIT dans le sang de familles serbes........................... 145
5. Analyse des adduits à l’ADN de sang de familles serbes ......................... 146
6. Identification des métabolites d’OTA dans le sang et urine humaine.147
DISCUSSION GENERALE,CONCLUSION ET PERSPECTIVE.................................. 151
REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES................................................................... 160
ANNEXES ........................................................................................................ 181 Annexe 1........................................................................................................ 182 Annexe 2........................................................................................................ 183 Annexe 3........................................................................................................ 184 Annexe 4........................................................................................................ 185 Annexe 5........................................................................................................ 186 Annexe 6........................................................................................................ 187 Annexe 7........................................................................................................ 188 Annexe 8........................................................................................................ 189
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