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UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG

De
169 pages
Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG THESE Présentée pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Discipline : Sciences du Vivant Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie par Eric SCHORDAN Implication de la Protéine Apparentée à l'Hormone Parathyroïdienne (PTHrP) dans la prolifération des Cellules Musculaires Lisses Vasculaires et identification d'une cible nucléaire de la PTHrP Pharmacologie et Physiopathologie Rénales U727 INSERM-ULP (Directeur : Dr JJ. Helwig) Faculté de Médecine, Strasbourg Soutenue le 21 juin 2005 devant la commission d'examen : P. Corvol Examinateur A. Parini Rapporteur externe V. Schini-Kerth Rapporteur interne C. Silve Rapporteur externe JJ. Helwig Codirecteur de thèse T. Massfelder Codirecteur de thèse

  • schini-kerth rapporteur interne

  • protéine kinase

  • séquence de localisation nucléaire

  • growth factor

  • mitogen activated protein

  • transcription réverse-réaction de polymérisation en chaine

  • pthrp

  • signal de location nucléaire

  • implication de la protéine apparentée


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UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG

THESE

Présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG


Discipline : Sciences du Vivant

Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie

par

Eric SCHORDAN


Implication de la Protéine Apparentée à l’Hormone
Parathyroïdienne (PTHrP) dans la prolifération des
Cellules Musculaires Lisses Vasculaires et identification
d’une cible nucléaire de la PTHrP


Pharmacologie et Physiopathologie Rénales
U727 INSERM-ULP (Directeur : Dr JJ. Helwig)
Faculté de Médecine, Strasbourg



Soutenue le 21 juin 2005 devant la commission d’examen :

P. Corvol Examinateur A. Parini Rapporteur externe
V. Schini-Kerth Rapporteur interne C. Silve
JJ. Helwig Codirecteur de thèse
T. Massfelder r de thèse


A Sandra
A mes parents
A ma grand-mère
A mes défunts grands-parents
A mes sœurs et leurs familles
A tous ceux qui me sont chers
Je remercie chaleureusement le Docteur Thierry Massfelder, CR1 à l’Inserm,
codirecteur de ma thèse pour son aide, sa disponibilité, nos discussions enrichissantes,
son excellence scientifique et ses précieux conseils le tout dans la bonne humeur.

Je remercie chaleureusement le Docteur Jean-Jacques Helwig, Directeur de
recherche à l’Inserm, Directeur du laboratoire de Pharmacologie et Physiopathologie
Rénales U727 et co-directeur de ma thèse pour son accueil, son accessibilité, sa
disponibilité, son expertise scientifique et son soutien.


Je remercie également les membres du jury : les Docteurs Caroline Silve et
Angelo Parini et les Professeurs Valérie Schini-Kerth et Pierre Corvol pour avoir
acceptés de juger mon travail.


Je remercie tout particulièrement Mademoiselle Sandra Welsch pour son aide de
tous les instants et son réconfort quotidien. Merci de m’avoir soutenu et motivé toutes
ces années me permettant de réaliser mon cursus comme je l’ai fait.


Mes pensés vont également à tous les membres du Laboratoire de Pharmacologie et
Physiopathologie Rénales qui ont tous participé à la réalisation de ce travail.


Au Docteur Mariette Barthelmebs pour son concours scientifique.


A Madame Sylvie Rothhut pour sa précieuse aide et son amitié.


A Monsieur Alain Lambert, ingénieur à l’Inserm pour sa disponibilité et son aide
technique.


A Mesdames Danièle Kuhlwein, Virginie Roques et Suzanne Wendling pour leur
aide technique et les travaux de secrétariat.


A tous mes amis du laboratoire, Mesdemoiselle Sabrina Danilin et Carole
Sourbier, et Monsieur Abdelali Agouni ainsi que Madame le Docteur Véronique
Lindner et Messieurs les Docteurs Benoît Escande et Hervé Lang, pour leur
sympathie, leur soutien et leur bonne humeur quotidienne. Abréviations

AC : adénylate cyclase
ADN : acide désoxyribonucléique
AMPc : adénosine monophosphate cyclique
Ang II : angiotensine II
ANP : peptide natriurétique atrial
ARNm : acide ribonucléique messager
ATP : adénosine triphosphate

BSA : sérum albumine de bœuf

CML : cellule musculaire lisse
- Ao : aortique
- Rv : rénovasculaire
- V : vasculaires
CRE : élément répondant à l’AMPc

DAG : diacylglycérol
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium

EDTA : acide éthylène diamine tétraacétique
EGF : facteur de croissance épithélial

FACS : fluorescence-activated cell sorting
FBS : sérum fœtal de bœuf
FGF : facteur de croissance fibroblastique

GAPDH : glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
GC : guanylate cyclase
GMPc : guanosine monophosphate cyclique
GPCR : récepteurs couplés aux protéines G
GRKs : kinases des récepteurs couplés aux protéines G

HHM : hypercalcémie humorale maligne
HTA : hypertension artérielle
HTLV-1 : human T cell leukemia virus de type 1
IGF : insuline growth factor
IL-1 : interleukine 1
IP-3 : inositol triphosphate

MAPK : mitogen activated protein kinase

NLS: signal de location nucléaire
NO: monoxyde d’azote
NOS : synthase du monoxyde d’azote

PBS : phosphate buffer saline
pcDNA : plasmide complementary désoxyribonucléic acid
PDGF : platelet-derived growth factor
PKA : protéine kinase A
PKC : protéine kinase C
PLC : phospholipase C
PTH : hormone parathyroïdienne
PTHrP: protéine apparentée à l’hormone parathyroïdienne

RPTH1 : récepteur à l’hormone parathyroïdienne de type 1
RT-PCR : transcription réverse-réaction de polymérisation en chaine

SHR : rat spontanément hypertendu
SLN : séquence de localisation nucléaire
SP : séquence signal

TIP 39: peptide tubéroinfundibulaire de 39 acides aminés
TGF- β: facteur de croissance tumoral
TNF- α: facteur de nécrose tumorale

VEGF: vascular endothelial growth factor
VIP : Vasointestinal peptide
Sommaire

Abréviations

Chapitre I : Introduction bibliographique 1

1. Historique et découverte de la PTHrP 2
Découverte de la PTHrP 2
Historique 2

2. Biologie moléculaire de la PTHrP 3
2.1 Structure du gène de la PTHrP 3
2.2 Modifications post-traductionnelles 5
La séquence prépro de la PTHrP 6
La PTHrP(1-36) 6
La PTHrP intermédiaire 6
La PTHrP C-Terminale (107-139) 7
Le fragment C-terminal extrême : la PTHrP(141-173) 7
2.3 Les formes circulantes de la PTHrP 8
La PTHrP(1-36) 8
La PTHrP(38-94/95 et/ou 101) 9 PTHrP(107-139/141) PTHrP(141-173) 10
2.4 Sécrétion de la PTHrP
2.5 Régulation de l’expression de la PTHrP 11

3. Récepteur de la PTHrP 13
3.1 Le RPTH1 14
Généralités 14
Structure du gène 14
Régulation de l’expression 15
Distribution6
Systèmes effecteurs couplés et régulation fonctionnelle 17
RPTH1 et désordres génétiques 18
3.2 Le RPTH2 20
Généralités 20
Distribution 0
Ligands 21
Systèmes effecteurs couplés et rôles potentiels 22

4. Effets biologiques de la PTHrP 22
4.1 La PTHrP dans les tissus fœtaux 23
Chez l'homme 4
Modèles génétiquement modifiés 25
Système cardiovasculaire 26
4.2 La PTHrP dans les tissus adultes 26
Dans les tumeurs 26
Dans l’os et le squelette 7
Dans le système nerveux central 28
Dans la peau et le follicule pileux 28
Dans le sein et la glande mammaire 29
Danslepoumon 9
Dans le foie 29 Dans le système endocrine 30

5. La PTHrP dans le système cardiovasculaire et rénal 31
5.1 Effets cardiaques 31
La PTHrP dans le développement cardiaque 31
La PTHrP dans le cœur 32 ans les pathologies cardiaques : 33
5.2 Effets hémodynamiques 35
Effets hypotenseurs/vasodilatateurs 35 hypertenseurs 37
5.2.1 Effet sur l’hémodynamique rénale 38
Expression 38
Le rein, cible privilégiée de l’action relaxante de la PTHrP 39
Actions sur le tonus glomérulo-vasculaire 40
Action sur la libération de rénine 41
5.3 Effets trophiques 42
CML rénovasculaires 42
Cellules mésangiales tubulaires 43

6. La PTHrP et les cellules musculaires lisses 43
6.1 Expression 43
Stimulation par le sérum et les vasoconstricteurs 44
Stimulation par les forces mécaniques 45
Stimuli pathologiques 46
6.2 Voie de transduction dans les CMLV 46
6.3 Effets sur la prolifération des CMLV 47
6.3.1 Inhibition autocrine/paracrine de la prolifération 47
6.3.2 Stimulation intracrine 50

7. Mécanisme du ciblage nucléaire de la PTHrP 53
7.1 Accès au cytoplasme 54
Endocytose 54
Initiation alternative de la traduction 55
Passage rétrogradu réticulum endoplasmique 57
7.2 Accès au noyau 58
7.3 Fonctions nucléaires possibles de la PTHrP 61
7.4 Prolifération et apoptose cellulaire 61
7.5 La biogénèse des ribosomes 62

8. Cibles nucléaires potentielles de la PTHrP : la culline 3 63

9. Le stretch mécanique dans les CMLV 67
9.1 Définition 67
9.2 Influence sur le phénotype de CMLV 67
9.3 Mécanisme d’action / voie de transduction 69
Les récepteurs à tyrosine kinase 69
Les intégrines 70 rs à protéine G et protéines G 71
Les canaux ioniques 72
9.4 Induction de l’expression de gènes cibles 74
9.5 Effet sur la prolifération des CMLV 75
10. Modèles antérieurs de souris transgéniques 76
10.1 Souris invalidées pour la PTHrP et le R-PTH1 76
10.2 Souris « rescue » 76
10.3 Souris transgéniques surexprimant la PTHrP et/ou le R-PTH1 dans les
CML 76
10.4 Excision conditionnelle de la PTHrP dans les CML 77
Obtention des souris dont la PTHrP peut être excisée de manière conditionnelle dans
les CML 79

Objectifs 82


Chapitre II : Matériel et Méthodes 85

Animaux 86
Isolement des arbres vasculaires intra-rénaux et des aortes thoraciques 86
Obtention et mise en culture des CMLRv et CMLAo 86
Immunofluorescence 87 Mesure de la prolifération cellulaire 87
Protocole de stretch mécanique des cellules 88
Transfection stable des CMLRv et CMLAo 88
Mesure de viabilité cellulaire 89 Mesure de la prolifération parincorporation BrdU 89
Stabilité de l’ARNm de la PTHrP 90
Mesure de l’activité des promoteurs de la PTHrP 90
Analyse de l’expression de la PTHrP par RT-PCR semi-quantitative et
quantitative 90
o Extraction de l’ARN 90
oSynthèse de l’ADNc par transcription réverse (RT) 91
o PCR Semi-Quantitative 91
oAmplification de l’ADNc par PCR quantitative en temps réel 92
Analyse par Western Blot 93 Statistiques 94


Chapitre III : Implication de la PTHrP sur la prolifération des
CMLV soumises au stretch mécanique. 96

Introduction 97

Résultats et discussion 98
Effet du stretch mécanique sur la prolifération des CMLV 98
Effet du stretch mécanique sur l’expression de la PTHrP et le RPTH1 99
Implication de la PTHrP dans l’inhibition de la prolifération par le stretch
mécanique 100
Mécanisme de la stimulation de la PTHrP par le stretch mécanique 101

??????????????????Chapitre IV : Etablissement des lignées de CMLV délétées pour
la PTHrP 110

Introduction 111
Résultats et discussion 111
Excision de la PTHrP dans les CMLV de souris 112
Implication de la PTHrP dans la prolifération des CMLV 112
Dérégulation du RPTH1 par l’angiotensine II et la PTHrP : un exemple de
l’apport des CMLV délétées pour la PTHrP 113
Perspectives 114

Chapitre V : Identification d’une cible nucléaire de la PTHrP : la
Culline 3 116

Introduction 117

Résultats et discussion 117
Stimulation de l’expression de la culline 3 par la PTHrP intracrine 117

Chapitre VI : Discussion générale 122

Conclusions 127

Résumé 129

Références Bibliographiques 136



?????






Introduction bibliographique























Chapitre I
1