UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR-STRASBOURG I 2003 THESE présentée à LA FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Domaine : BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE par Laurent HOFFMANN Etude du métabolisme des phénylpropanoïdes; analyse de l'interaction de la caféoyl-coenzyme A 3-O-méthyltransférase (CCoAOMT) avec son substrat et caractérisation fonctionnelle d'une nouvelle acyltransférase, l'HydroxyCinnamoyl-CoA : shikimate/quinate hydroxycinnamoyl Transférase (HCT). Soutenue le 4 juillet 2003 devant la Commission d'Examen : Mme C. LAPIERRE RAPPORTEUR EXTERNE M. B. ST-PIERRE RAPPORTEUR EXTERNE M. T. BACH RAPPORTEUR INTERNE M. M. LEGRAND DIRECTEUR DE THESE Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP-CNRS), Strasbourg

  • pensée amicale aux collègues de l'iut

  • bach rapporteur

  • iut de colmar

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  • acide chlorogénique

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  • chromatographie sur couche mince

  • lapierre rapporteur externe

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UNIVERSITE LOUIS PASTEUR-STRASBOURG I 2003 THESEprésentée à
LA FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE
pour obtenir le titre de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
Domaine :BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE
par
Laurent HOFFMANN
Etude du métabolisme des phénylpropanoïdes; analyse de
l’interaction de la caféoyl-coenzyme A 3-O-méthyltransférase
(CCoAOMT) avec son substrat et caractérisation fonctionnelle
d’une nouvelle acyltransférase, l’HydroxyCinnamoyl-CoA :
shikimate/quinate hydroxycinnamoyl Transférase (HCT).
 Soutenue le4 juillet 2003devant la Commission d'Examen :
Mme C. LAPIERRE
M. B. ST-PIERRE
M. T. BACH
M. M. LEGRAND
RAPPORTEUR EXTERNE
RAPPORTEUR EXTERNE
RAPPORTEUR INTERNE
DIRECTEUR DE THESE
Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP-CNRS), Strasbourg
« … la diversité doit être considérée comme un don, puisqu’il faut être divers pour échanger et échanger pour progresser. »  Axel Kahn  Et l’Homme dans tout ça ?
A mes parents A Stéphanie
Je tiens à remercier tout d’abord Bernard Fritig et Michel Legrand pour m’avoir accueilli au sein de l’équipe de phytopathologie et d’avoir mis à ma disposition les moyens nécessaires pour réaliser ce travail. J’exprime toute ma gratitude à Michel Legrand. Sa compétence et sa disponibilité ont été des atouts précieux. Je voudrai remercier Madame C. Lapierre et Messieurs T. Bach et B. St-Pierre d’avoir accepté d’évaluer cette thèse. Un grand merci à Pierrette Geoffroy pour sa rigueur, sa gentillesse et sa disponibilité. Ses compétences techniques et son efficacité ont fortement contribué à la réalisation de ces travaux. Merci à Gaëlle Pinçon et Stéphane Maury qui m’ont encadré et formé pendant mon année de DEA. Je tiens à remercier Denise Meyer pour son aide technique concernant la cytochimie et Marc Bergdoll pour les études bioinformatiques. Je remercie également Christophe Ritzenthaler pour ces précieux conseils en microscopie, nos nombreuses discussions scientifiques et sa collaboration enrichissante. Mes remerciements iront également à Paul Schellenbaum pour m’avoir permis de découvrir les joies de l’enseignement à l’IUT de Colmar, en tant que vacataire puis en tant qu’ATER. Une pensée amicale aux collègues de l’IUT pour leur soutien et leur aide, ainsi qu’aux étudiants. Merci aux stagiaires que j’ai eu la joie et le plaisir d’encadrer : Michel Undreiner, Laurence Baumann, Sigrid Malfait, Laurette De Franco et Sébastien Besseau, pour leur rigueur et leur contribution à ce travail. Un grand merci à toutes les personnes qui, grâce à leur disponibilité et à leur bonne humeur, m’ont soutenu en rendant agréable les moments passés ensemble : Guigui, Samie (trop la classe !), Alban, Sylvain, Seb, Ahmed, Nanard, Manu, Marie G., Sophie, Daniel, Nadège, Zaza, Cécile, Zack, Tatiana, Clément, Mahlek, Philippe H. Laurent C., Sylvain D., Ester G., Patrick, Claire, Thierry, Julie, Rozenne, Gwendoline, Maïlys, Guillaume G., Pascaline D., Olivier V., Gilles, Marc O.,… Une tendre pensée pour Eva, pour sa patience, sa présence à mes côtés et sa contribution à l’élaboration de ce manuscrit.
ADN ADNc ADN-T ArabidopsisARN ARNm ATP BSA CHI CHS C3H C4H 4CL CAD CaMV Cald CatOMT CCoA CCM CCR CoA CoASH CCoAOMT CGA CHS CLHP COMT CPG-SM cv. dNTP DCG DO dpi DTT EDTA EST F5H G GUS H HCA HCT HCT -HRGP kb kDa N. benthamiana
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ABREVIATIONS
acide désoxyribonucléique ADN complémentaire ADN transféré Arabidopsis thalianaacide ribonucléique ARN messager adénosine triphosphate bovine serum albumin chalcone isomérase chalcone synthase trans-cinnamate 3-hydroxylase para-coumarate 4-hydroxylase 4-coumarate CoA ligase alcool cinnamylique déshydrogénase cauliflower mosaic virus coniféraldéhyde catéchol OMT caféoyl-CoA chromatographie sur couche mince cinnamoyl-CoA réductase coenzyme A coenzyme A réduit caféoyl-CoAO-méthyltransférase acide chlorogénique chalcone synthase chromatographie liquide haute performance acide caféiqueO-méthyltransférase chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse cultivar désoxyribonucléoside 5'-triphosphate alcool déhydroconiférylique glucoside densité optique jours après infiltration (days post-inoculation) dithiothréitol éthylène diamine tétra-acétate expressed sequenced tag férulate 5-hydroxylase gaïacyle β-glucuronidase para-hydroxyphényle acide hydroxycinnamique HydroxyCinnamoyl-Transférase plant deN. benthamianaréprimé pour l’expression du gèneHCThydroxyproline-rich glycoprotein kilobase kiloDaltonNicotiana benthamiana
N. tabacum 5-OHG OMT PAL pb PCR PF PR RE RH RMN RT-PCR S SA SAD SAH SAM SAR SDS SM SS TRV U.V. UA VIGS VMT WT
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
Nicotiana tabacum 5-hydroxygaïacyle O-méthyltransférase phényalanine ammoniac-lyase paire de bases polymerase chain reaction poids frais pathogenesis related réticulum endoplasmique réaction d'hypersensibilité résonance magnétique nucléaire transcription réverse suivie d’une PCR syringyle acide salicylique alcool sinapylique déshydrogénase S-adénosyl-L-homocystéine S-adénosyl-L-méthionine systemic acquired resistance dodécylsulfate de sodium sinapoylmalate stilbène synthase Tobacco Rattle Virus ultraviolet unité d’aire Virus Induced Gene Silencing virus de la mosaïque du tabac wild type
SOMMAIRE
Sommaire
Introduction générale......................................................................................... 1
1.
1.1
Le métabolisme des phénylpropanoïdes ...................................................... 4
Rôle du métabolisme des phénylpropanoïdes chez les plantes .............................................................. 4
1.2Les produits dérivés du métabolisme des phénylpropanoïdes .............................................................. 51.2.1Les coumarines.................................................................................................................................... 51.2.2Les stilbènes, les flavonoïdes et dérivés.............................................................................................. 61.2.3Les dérivés d’acides hydroxycinnamiques, dont l’acide chlorogénique ............................................. 61.2.4La subérine .......................................................................................................................................... 91.2.5La lignine .......................................................................................................................................... 10
1.3Les enzymes de la voie générale du métabolisme des phénylpropanoïdes ......................................... 101.3.1La phénylalanine ammoniac lyase (PAL) ......................................................................................... 101.3.2La cinnamate 4-hydroxylase (C4H) .................................................................................................. 121.3.3Lap-coumarate 3-hydroxylase (C3H)............................................................................................... 121.3.4LesO.................................................................................................... 13-méthyltransférases (OMTs) 1.3.4.1Les caféoyl-CoA OMTs (CCoAOMTs).......................................................................................... 141.3.4.2Les acide caféique OMTs (COMTs).............................................................................................. 151.3.5La férulate 5-hydroxylase (F5H) ....................................................................................................... 161.3.6La coumarate CoA ligase (4CL) ....................................................................................................... 17
1.4Les enzymes spécifiques de la voie de biosynthèse de la lignine.......................................................... 191.4.1La cinnamoyl-CoA réductase (CCR) ................................................................................................ 191.4.2La cinnamyl alcool déshydrogénase (CAD)...................................................................................... 201.4.3Stockage et transport des unités monolignols ................................................................................... 211.4.3.1L’alcool coniférylique UDP-glucose glucosyltransférase............................................................. 211.4.3.2La coniférineβ-glucosidase......................................................................................................... 221.4.4Polymérisation des unités monolignols ............................................................................................. 231.4.4.1Les peroxydases............................................................................................................................ 231.4.4.2Les laccases................................................................................................................................... 24
1.5..................................................... 25Le métabolisme des phénylpropanoïdes et les réponses aux stress 1.5.1....................................................... 26Inductibilité des gènes du métabolisme des phénylpropanoïdes 1.5.2Identification et fonctions des dérivés phénylpropanes produits dans les situations de stress .......... 27
1.6Les mécanismes de régulation du métabolisme des phénylpropanoïdes ............................................ 291.6.1Les élémentscisrégulateurs.............................................................................................................. 291.6.2Les facteurs de transcription ............................................................................................................. 301.6.3Autres mécanismes de régulation...................................................................................................... 32
2.
2.1
La lignine........................................................................................................ 32
Rôle de la lignine ..................................................................................................................................... 32
2.2Les tissus conducteurs et le processus de lignification ......................................................................... 332.2.1Le système vasculaire........................................................................................................................ 332.2.2............................................................. 34Le processus de lignification de la paroi cellulaire végétale
2.3Nature chimique et hétérogénéité des polymères de lignine................................................................ 352.3.1................................................................................................................................ 35Les monolignols 2.3.2Les liaisons chimiques ...................................................................................................................... 352.3.3Hétérogénéité des polymères de lignine............................................................................................ 362.3.4Analyse chimique de la lignine ......................................................................................................... 37
2.4
Sommaire
Importance économique de la lignine.................................................................................................... 37
2.5Modulation par génie génétique de la voie de biosynthèse de la lignine............................................. 382.5.1Modulation de l’expression de la PAL.............................................................................................. 392.5.2Modulation de l’expression de la C4H.............................................................................................. 402.5.3: analyse du mutantModulation de l’expression de la C3H ref8dans l’expression du gène affecté C3H41 ........................................................................................................................................................... 2.5.4Modulation de l’expression de la COMT.......................................................................................... 412.5.5Modulation de l’expression de la CCoAOMT .................................................................................. 422.5.6Modulation de l’expression de la F5H par transgénèse et analyse du mutantfah 1-2 affecté dans l’expression du gèneF5H................................................................................................................................. 432.5.74CL ............................................................................................. 44Modulation de l’expression de la 2.5.8Modulation de l’expression de la CCR par transgénèse et analyse du mutantirx4 affecté dans l’expression du gèneCCR................................................................................................................................. 442.5.9Modulation de l’expression de la CAD par transgénèse et analyse de mutants naturels................... 452.5.10Modulation de l’expression des peroxydases .................................................................................... 462.5.11Modulation de l’expression des laccases........................................................................................... 472.5.12Modulation de l’expression d’autres gènes affectant la biosynthèse de la lignine ............................ 472.5.1348Conclusions .......................................................................................................................................
2.6
2.7
3.
3.1
Notre connaissance de la voie de biosynthèse de la lignine : synthèse des dernières avancées......... 50
Le coenzyme A ou « coenzyme d’Acylation » ....................................................................................... 52
La voie du shikimate ..................................................................................... 53
Importance de la voie métabolique du shikimate ................................................................................. 53
3.2.............................................. 54Les enzymes de la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques 3.2.1Les enzymes du tronc principal, la voie préchorismate..................................................................... 543.2.1.1La 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase.......................................... 543.2.1.2La 3-déhydroquinate (DHQ) synthase.......................................................................................... 553.2.1.3La 3-déhydroquinate (DHQ) déhydratase et shikimate déhydrogenase....................................... 553.2.1.4La shikimate kinase....................................................................................................................... 553.2.1.5La 5-énolpyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP) synthase............................................................ 553.2.1.6La chorismate synthase................................................................................................................. 563.2.2Les enzymes conduisant à la synthèse de la phénylalanine et de la tyrosine (Fig. 62A)................... 563.2.3Les enzymes conduisant à la synthèse du tryptophane (Fig. 62B) .................................................... 57
3.3
3.4
Localisation subcellulaire de la voie du shikimate ............................................................................... 57
Les produits dérivés et fonctions de la voie du shikimate.................................................................... 58
3.5Régulation de la voie du shikimate en réponse à des stimuli développementaux et environnementaux............................................................................................................................................... 59
Objectifs des travaux de thèse .............................................................................. 61
Sommaire
Chapitre I: Caractérisation fonctionnelle d’une nouvelle acyltransférase de tabac, l’HydroxyCinnamoyl-CoA : shikimate/quinate hydroxycinnamoyl Transférase (HCT).. ................................................................................................ 62
PARTIE I: Purification, clonage et caractérisation biochimique d’une acyltransférase de tabac contrôlant le pool des esters shikimiques et quiniques, intermédiaires métaboliques de la voie des phénylpropanoïdes...................................................... 62
1.
Introduction............................................................................................................................... 62
2.Article 1.Purification, cloning, and properties of an acyltransferase controlling shikimate and quinate ester intermediates in phenylpropanoid metabolism. ............................................................... 65
3.« BAHD » Compléments d’information sur la superfamille des acyltransférases dépendantes des esters de CoA. ....................................................................................................... 75
3.1
3.2
3.3
Introduction ............................................................................................................................................... 75
Les acyltransférases dépendantes des « esters de CoA activés » .............................................................. 75
La superfamille « BAHD » des acyltransférases dépendantes des esters de CoA..................................... 76
PARTIE II: La répression du gène HCT, grâce à l’infection par un virus recombinant (approche « Virus Induced Gene Silencing », VIGS), affecte le métabolisme des phénylpropanoïdes et modifie les processus de lignification des tissus conducteurs...  ........................................................................................................................ 78
1.
Introduction............................................................................................................................... 78
2.Article 2.Silencing of hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase (HCT) affects lignin biosynthesis. .......................................................................................................... 80
3.
3.1
3.2
Résultats complémentaires ................................................................................................... 102
Clonage d’un fragment d’ADNc du gène codant pour HCT chezN. benthamiana................................ 102
Analyse histologique des tissus conducteurs de plants deN. benthamianadont le gèneHCTest réprimé .. ................................................................................................................................................................ 102
3.3Analyse par CLHP de la teneur en composés phénoliques solubles de tige et de feuilles de plants deN. benthamianadont le gèneHCTest réprimé ........................................................................................................ 103
3.4L’enzyme HCT peut-elle jouer un rôle dans les mécanismes de résistance des plantes aux agents pathogènes? Mesure de l’activité HCT lors de la réaction d’hypersensibilité (RH) du tabac vis-à-vis du VMT. ....  ................................................................................................................................................................ 106
CONCLUSIONS..................................................................................................... 108