Université Joseph Fourier GRENOBLE I

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  • redaction - matière potentielle : articles scientifiques
  • redaction
Université Joseph Fourier GRENOBLE I BIO 121 Année 2008-2009 1 TRAVAUX PRATIQUES
  • pnp
  • spectre d'absorption du pnp
  • para-nitrophénol en milieu alcalin
  • absorption de la lumière
  • protéines - chromatographie par filtration sur gel et par électrophorèse sur gel de polyacrylamide
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  • travail pratique

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Langue Français
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Université Joseph Fourier GRENOBLE I
TRAVAUX PRATIQUES
BIO 121
Année 2008-2009
1Première année de LICENCE

AVERTISSEMENT
Le port de la blouse est obligatoire en salle de travaux pratiques.
L'achat d'un feutre indélébile est fortement conseillé.
Le but de ces Travaux Pratiques est d'initier les étudiants au travail de laboratoire en leur
présentant quelques-unes des techniques de BIOCHIMIE.
La capacité à manipuler correctement, la qualité des résultats expérimentaux et la
rédaction d’un compte-rendu concis et précis seront évalués dans le cadre d'un contrôle
continu à partir de comptes-rendus rédigés en séance, selon le modèle fourni dans les pages
suivantes et sur la base de votre attitude en séance de travaux pratiques.

SOMMAIRE
MANIPULATION N° 1 p 5
Initiation au travail de laboratoire en Biochimie
MANIPULATION N° 2 p 11
Les glucides - Dosage des glucides par la méthode de la GOD
MANIPULATION N° 3 p 17
Les acides nucléiques - Electrophorèse sur gel d'agarose
MANIPULATION N° 4 p 29
Les protéines - Chromatographie par filtration sur gel et par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide (SDS-PAGE).
MANIPULATION N° 5 p 37
Les lipides - Chromatographie de partage sur couche mince
2REDACTION DU COMPTE-RENDU DE MANIPULATION
Le compte rendu devra comporter au maximum une copie double.
AVANT LA SEANCE

La manipulation à effectuer le jour du TP devra être obligatoirement préparée au
préalable de telle sorte que vous compreniez la ou les expériences de la séance. Pour
cela, vous devrez rendre en début de séance une feuille comportant les parties 1 = titre, 2
= but et 3 = principe. Ce document devra donc être rédigé avant la séance avec votre
binôme.
Il est aussi fortement conseillé de commencer à rédiger le reste du compte-rendu (ex :
tableaux) afin de n’avoir à rajouter que les résultats et de pouvoir rendre un compte rendu
de qualité en fin de séance (note de contrôle continu comptant pour l’examen).
ORGANISATION DU COMPTE-RENDU (20 points)
Le compte-rendu de travaux pratiques a pour objectif de vous familiariser avec la rédaction
d’articles scientifiques et doit comporter les parties suivantes :
1- Un TITRE (1 point)
2- BUT (1 point)
3- PRINCIPE (1 page maximum) (2 points)
4- MODE OPERATOIRE (uniquement sous forme d’organigramme à préparer avant) (2
points)
5- ANALYSE ET QUALITE DES RESULTATS (14 points)
Le TITRE : doit être court et répond à la question : « de quelle manipulation s’agit-il ? ».
Le BUT : doit présenter l’objectif de la manipulation et très brièvement l’approche
expérimentale utilisée.

Le PRINCIPE : doit reprendre l’aspect théorique de la technique utilisée (sans recopier le
polycopié). Il est conseillé d’utiliser des schémas et de faire appel aux documents fournis
en cours, TD et TP …. Il répond à la question comment et pourquoi les techniques mises en
œuvre permettent d'atteindre le but fixé.
Le MODE OPERATOIRE (organigramme du protocole expérimental) : cette partie doit
être synthétique mais elle doit aussi vous permettre d’effectuer la manipulation sans
regarder le poly. Vous pouvez préparer l’organigramme avant la séance et le compléter le
3l
l
jour des TP, avec les variables de l’expérimentation, comme la masse de réactifs
effectivement pesée, les volumes utilisés pour les dilutions …
Utiliser des tableaux et des schémas (cf exemple donné pour le TP d’initiation).
Les RESULTATS : vous trouverez à la fin de chaque TP, des questions vous aidant à rédiger
cette partie. Ces questions font office de trame, mais ne sont pas exhaustives, vous devrez
donc tirer parti non seulement des résultats demandés mais aussi de l’ensemble de vos
résultats expérimentaux présentés sous forme de figures.
Cette partie contient :
- Les questions théoriques qui sont à préparer à l’avance en même temps que
l’organigramme de la manipulation.
- Des tableaux synthétiques regroupant vos résultats
- Une présentation soignée de vos courbes : tracé des courbes, analyse de ces courbes et
une conclusion sur les résultats qu’elles apportent.
- Les commentaires des Figures : chaque figure en annexe doit faire l’objet d’un
commentaire succinct dans la partie texte soulignant les aspects importants de la figure.
Les Figures :
Utiliser des tableaux, des représentations graphiques ou la photographie d’un gel.
Chaque document doit comporter un maximum d’informations (imaginez que l’on retrouve la
figure x et que l’on souhaite savoir de quoi il s’agit sans avoir le texte).
Devront donc y figurer :
 Un titre rappelant ce que vous cherchez et comment vous allez y parvenir
(Exemple : détermination de par le tracé du spectre d’absorption du pNP-OH : max
A= f( ) )
 Une échelle avec des unités et des axes légendés.
 Une légende complète précisant les conditions de l’expérience (ex : température,
durée...).
 Des annotations mettant certains points en évidence.
 La conclusion des Figures : quel est le résultat principal que vous tirez de la figure.
4MANIPULATION N° 1
Initiation au travail de laboratoire en Biochimie
Cette première séance de travaux pratiques est une séance d'initiation. Elle a pour but de
vous familiariser avec les outils et les techniques de laboratoires spécifiques à la biochimie.
L’accent est surtout mis sur la précision et la reproductibilité des manipulations. Ce sont
des conditions indispensables pour obtenir des résultats scientifiques fiables et donc
analysables.
Pendant cette séance vous allez évaluer la qualité de vos manipulations et vous familiariser
avec la notion de limite de validité de valeurs expérimentales. Pour cela vous allez utiliser 5
critères tirés du protocole de validation des techniques (VALTEC)*. Vous analyserez des
mesures d’absorbance obtenues avec différentes dilutions de pNP-OH.
1 - La répétabilité : variation de la valeur pour une même série.
2 - La reproductibilité : variation de la valeur pour des séries différentes.
3 - La justesse : le fait que cette technique soit proche en valeur d’un matériel de
référence.
4 - La limite de linéarité : ce sont les valeurs au-delà desquelles la droite d’étalonnage
n’est plus une droite.
5 - La limite de détection : correspondant aux valeurs les plus basses que l’on peut
distinguer du bruit de fond inhérent à la technique de détection.
*Le passage en routine d’une technique de laboratoire nécessite au préalable son évaluation
technique. Cette démarche fait partie de l’assurance qualité obligatoire dans les laboratoires
de biologie médicale depuis le décret de 1997. La société française de biologie clinique (SFBC)
a publié un protocole de validation des techniques (VALTEC) dès 1986. Les directives du
protocole VALTEC proposent d’étudier 7 critères différents de qualité pour évaluer une
technique.
5MANIPULATION
Consignes importantes :
 Marquez les indications nécessaires au feutre indélébile sur tous vos tubes
 Ne rien jeter avant la fin de la manipulation.
Une solution qui est destinée à être diluée est souvent appelée solution mère, pour la
distinguer des autres solutions qu'elle génère.
Matériel
Pour prélever un volume de liquide avec la meilleure précision possible il faut utiliser le
matériel adapté :
Volume Matériel
1 et 20 µL Pipette automatique P20
10 et 200 µL Pipette automatique P200
200 et 1000 µL Pipette automatique P1000
1 et 5 mL Pipette 5 mL
5 et 10 mL Pipette 10 mL
Au-delà de 20 mL éprouvette graduée, fiole jaugée pour
ajuster
Attention : les graduations indiquées sur les béchers ne sont qu’approximatives, il ne faut
donc pas utiliser ce type de récipient pour mesurer un volume.
1 - Dilution en cascades
-1La solution mère de pNP-OH est la solution A de concentration 1,4 mg.mL soit 10 mM car
-1MM = 139 g.molepNP-OH
1 – Prélevez 5 mL de la solution A et compléter à 100 mL avec du NaOH 0,01 M pour obtenir
6S
l
la solution B.
Indiquez sur votre organigramme le matériel que vous devez utiliser pour cette
manipulation.
2- Prélevez 50 mL de la solution précédente (B) et compléter à 100 mL de NaOH 0,01 M
pour obtenir l a solution C.
Indiquez le matériel que vous devez utiliser pour cette manipulation.
2 – Pipetages et mesures d’absorbance
Une gamme de concentrations est réalisée à partir de la solution C selon le tableau suivant :
tube 0 1 2 3 4 5 6
Solution C 0 20 100 200 350 500 1000
(µL)
NaOH 0,01M 1000 980 900 800 650 500 0
(µL)
Pour pouvoir évaluer la qualité de vos manipulations, vous devrez préparer plusieurs tubes 1
à 6. Pour cela, procéder comme suit.
Commencer par préparer,
- un tube correspondant au tube n°0
- trois tubes correspondant au tube n°1 (triplicat)
- Mesurer l’absorbance à . des 3 tubes n°1 en prenant le tube n° 0 comme max
référence. Attention ! Penser à conserver le contenu des tubes (ne pas le jeter).
- Si la valeur de l’écart à la moyenne est inférieure à 15 %, passez au tube n°2, sinon
préparer à nouveau 3 tubes n°1 jusqu’à obtention d’un écart à la moyenne inférieur à
15 %.
Ecart à la moyenne : |Abs - Abs | /nombre de mesuresexpérimentales moyenne
Reproduire ce protocole pour chaque tube 2 à 6.
Une fois que vous avez obtenu des valeurs fiables pour les 6 tubes, vous pouvez
exploiter vos résultats en suivant les consignes ci-dessous.
7l
l
e
e
e
l
Les parties « titre, but et principe » seront rendues en début de séance. Les parties
« mode opératoire, analyse des résultats et conclusion » seront rendues à la fin de la
séance. Pour rédiger l’ensemble de ces parties se référer à la page 2 (consignes
détaillées).
Le mode opératoire doit être présenté sous forme d'organigramme.
La partie « analyse des résultats » devra comporter :
le calcul des concentrations des différentes dilutions (donner un exemple de calcul
détaillé) sous forme de tableau,
la courbe A = f([pNP-OH]) tracée en utilisant pour chaque concentration la valeur max
moyenne des absorbances fiables, et son commentaire,
le calcul du coefficient d'extinction molaire du pNP-OH à à partir de la courbe,max
le calcul de l’incertitude, sachant que le coefficient d'extinction molaire théorique
-1 -1du pNP-OH à est de 16800 M cm , et son commentaire. ( Incertitude = | - max Théorique
| / ) Expérimental Théorique
Conclure sur l’adéquation de vos résultats par rapport aux critères de qualité Valtec.
8l
Annexe 1 : Structure du paranitrophénol
Placé en milieu alcalin, le para-nitrophénol s'ionise en para-nitrophénate. La délocalisation
des électrons qui est alors rendue possible conduit à la forme mésomère II dans laquelle il
apparaît plusieurs doubles liaisons conjuguées. L'absorption de la lumière de composés
ayant ce type de structure se fait dans le domaine du visible.
Par voie de conséquence, le para-nitrophénol en milieu alcalin (forme II) devient fortement
coloré en jaune alors qu'il reste incolore (forme I) en milieu acide.
OH O
-OH
+H
+ +N N
- - -OO O O
Forme I Forme II

Le tracé du spectre d'absorption du para-nitrophénol en milieu alcalin permet de
déterminer la longueur d'onde ( max) correspondant au maximum d'absorption du
paranitrophénate.
9l
Organigramme à compléter Binôme
Groupe
GAMME D’ETALONNAGE DU PARA-NITROPHENOL
 Dilutions en cascade
SOLUTION A
[A] =
SOLUTION B
- 5 mL de solution A
- NaOH 0,01 M qsp 100 mL
[B] =
SOLUTION C
- 50 mL de solution B
- NaOH 0,01 M qsp 100 mL
[C] =
 Gamme
tube 0 1 2 3 4 5 6
Solution C 0 20 100 200 350 500 1000
(µL)
NaOH 0,01M 1000 980 900 800 650 500 0
(µL)
 Etude spectrophotométrique
Mesures d’absorbance des solutions des triplicats des tubes 1 à 6
Spectrophotomètre fixé à , mesure des absorbances des triplicats des tubes 1 à 6max
avec comme référence le tube 0, en respectant un écart à la moyenne inférieur à 15%
pour chacun des triplicats

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