Dissertationsubmitted to theCombined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematicsof the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germanyfor the degree ofDoctor of Natural SciencesPut forward byDiplom-Physiker Roman Schmidtborn in Wuppertal, GermanyOral examination: November 5th, 20083D uorescence microscopywith isotropic resolutionon the nanoscaleReferees:Prof. Dr. Stefan W. HellProf. Dr. Christoph CremerKurzdarstellung.Die Au osung eines jeden linearen Abbildungverfahrens ist durch seine Punkt-bildfunktion (engl. point-spread-function, PSF) gegeben, die das Verwascheneines Punktes des Urbilds quanti ziert. Je scharfer die PSF, desto besser dieAu osung. In der herk ommlichen Fluoreszenzmikroskopie weist die PSF beu-gungsbedingt ein zigarrenf ormiges Hauptmaximum auf, welches auch fokalerFleck genannt wird. Seine Ausdehnung betragt mindestens die Halfte derLichtwellenlange ( = 400-800 nm) in der Fokalebene und> entlang der op-tischen Achse (z). Obwohl Konzepte entwickelt wurden, die den fokalen Flecksowohl lateral als auch axial scharfen, ist es bisher keinem von ihnen gelun-gen, das ultimatives Ziel zu erreichen: Die isotrope Abbildung mittels eineskugelf ormigen fokalen Flecks, der beliebig verkleinert werden kann.
Dissertation submitted to the Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany for the degree of Doctor of Natural Sciences
Put forward by
Diplom-Physiker Roman Schmidt born in Wuppertal, Germany
Oral examination: November 5th, 2008
3D fluorescence microscopy with isotropic resolution on the nanoscale
Referees:
Prof. Dr. Stefan W. Hell Prof. Dr. Christoph Cremer
Kurzdarstellung. Die A fl¨ ngeines jeden linearen Abbildungverfahrens ist durch seine Punkt-u osu bildfunktion (engl. point-spread-function, PSF) gegeben, die das Verwaschen einesPunktesdesUrbildsquantifiziert.Jescha¨rferdiePSF,destobesserdie Auflo¨sung.Inderherk¨ommlichenFluoreszenzmikroskopieweistdiePSFbeu-gungsbedingteinzigarrenf¨ormigesHauptmaximumauf,welchesauchfokaler Fleckgenanntwird.SeineAusdehnungbetra¨gtmindestensdieH¨alfteder Lichtwellenl¨ e (λ= 400-800 nm) in der Fokalebene und> λentlang der op-ang tischen Achse (z Konzepte entwickelt wurden, die den fokalen Fleck). Obwohl sowohllateralalsauchaxialsch¨arfen,istesbisherkeinemvonihnengelun-gen, das ultimatives Ziel zu erreichen: Die isotrope Abbildung mittels eines kugelformigen fokalen Flecks, der beliebig verkleinert werden kann. Hier stelle ¨ ich solch ein Fluoreszenzmikroskop vor und demonstriere die Erzeugung eines kugelf¨ormigenfokalenFlecksmiteinemDurchmesservon40-45nm(∼λ/16), der unter geigneten Bedingungen auf 21-30 nm (∼λ/30) verkleinert wird. Rein auf fokussiertem Licht basierend, blickt dieses linsenbasierte Fluoreszenz-nanoskop in das Innere von Zellen und analysiert nicht-invasiv die Struktur ihrer sub-λ Weiteremessenden Organellen. Anwendungen, wie zum Beispiel dieCharakterisierungneuartigerNanomaterialien,er¨offnenneueEinsatzgebiete. Abstract. The resolution of any linear imaging system is given by its point-spread-function (PSF) quantifying the blur of an object point in the image. The sharper the PSF, the better is the resolution. In standard fluorescence microscopy, however, diffraction dictates a PSF with a cigar-shaped main maximum, called the focal spot which extends over at least half the wavelength of light (λ= 400-800 nm) in the focal plane and> λalong the optic axis (z). While concepts have evolved to sharpen the focal spot both laterally and axially, none of them has reached their ultimate goal: a spherical spot that can be arbitrarily downscaled in size. Herein, I introduce such a fluorescence microscope and demonstrate the creation of spherical focal spots of 40-45 nm (∼λ/16) diameter that is pushed down to 21-30 nm (∼λ/ Fully relying on focused30) under suitable conditions. light, this lens-based fluorescence nanoscope unravels the interior of cells non-invasively, uniquely dissecting their sub-λsized organelles. Further fields of application open up, such as the characterization of novel nanomaterials.