A structural and functional study of the second periplasmic loop P2 of MalF in the maltose transporter of Escherichia coli [Elektronische Ressource] / von Tomas Jacso

Tomas Jacso

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• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 31
• Langue: Deutsch
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Extrait

A structural and functional study of the
second periplasmic loop P2 of MalF in the
maltose transporter of Escherichia coli.


Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades


doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biophysik

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der

Humboldt-Universität zu Berlin


von

Tomas Jacso, Diplom-Ing.



Präsident der Humboldt-Universität
Prof. Dr. Christoph Markschies


Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön


Gutachter: 1. Prof. Bernd Reif
2. Prof. Erwin Schneider
3. Udo Heinemann

Tag der mündlichen Prüfung: 09.07.2010 Zusammenfassung/Summary
Zusammenfassung

ABC (ATP-binding-cassette)-Transporter katalysieren den ATP-abhängigen
Transport diverser niedermolekularer Substanzen durch die biologische
Zellmembran. Ihr Vorkommen erstreckt sich auf alle drei Domänen des Lebens. Der
Maltose Transporter von E.coli gehört zu dieser Superfamilie der ABC-Transporter.
Die Kristallstrukturen des Transporters MalFGK wurden kürzlich gelöst für dessen 2
inaktiven Zustand als auch für dessen katalytischen Zwischenzustand. Um den
Transportmechanismus besser verstehen zu können, müssen die Kristallstrukturen des
Transporters und seiner Komponenten unter physiologischen Bedingungen genau
geprüft werden, um den daraus katalytischen Mechanismus zu bewerten. Im rahmen
der Dissertation konnte mittels Lösungs-NMR kann gezeigt werden, dass die
periplasmatische Schleife P2 von MalF eine unabhängige Faltung aufweist und eine
wohl definierte Tertiärstruktur einnimmt, die vergleichbar ist mit der im Kristall
vorliegenden Konformation. MalF-P2 interagiert unabhängig von der
Transmembranregion von MalF und MalG mit dem Maltose-Bindeprotein in An- und
Abwesenheit des Substrats mit einem K im mikromolaren Bereich. NMR D
Untersuchungen zu den an der Interaktion beteiligten Aminosäuren stehen in
Einklang mit den Kristallstrukturdaten. Die Analyse residualer dipolarer Kopplungen
(RDC) zeigt, dass die Konformation der zwei individuellen Domänen von MalF-P2 in
Abwesenheit von MalE erhalten bleibt und der im Kristall ähnelt. Die Zugabe von
MalE induziert eine Änderung der relativen Orientierung der zwei Domänen von
MalF-P2 um so dem räumlichen Anspruch des Liganden gerecht zu werden.
Besonders betroffen hiervon ist die Domäne 2 von MalF-P2, deren Konformation
abweicht von der in der Kristallstruktur. Die Struktur der Domäne 1 dagegen bleibt
konserviert, während sich lediglich ihre relative Orientierung zu Domäne 2 ändert.
MD Simulationen des MalF-P2-MalE-Komplexes deuten auf eine stark dynamische
Interaktion von MalF-P2 mit der MalE Bindungsregion hin. NMR CPMG
Kinetikstudien weisen auf die Bildung eines ungewöhnlichen Knicks in α-Helix α2
während der Assoziation hin. Diese konformelle Änderung der α-Helix findet auf
einer Zeitskala von Millisekunden statt, was im Einklang mit der Austauschrate der
Komplexbildung ist.
I Zusammenfassung/Summary
Summary

ABC (ATP-binding-cassette)-transporters catalyze the ATP-dependent transport of
diverse solutes across the cellular membrane. They are present in all three kingdoms
of life. The E.coli maltose transporter belongs to the ATP binding cassette (ABC)
transporter superfamily. Recently, the crystal structures of the full transporter
MalFGK2 in its resting and a catalytic intermediate state was solved. At the present
state of research, it is of particular interest to scrutinize the X-ray structures of the
transporter and its components under physiological conditions as well as to evaluate
their implications for the catalytic mechanism.
In the context of the PhD thesis, it could be shown using solution-state NMR that the
periplasmic loop P2 of MalF folds independently in solution and adopts a well-
defined tertiary structure, which is similar to the one found in the crystal structure.
MalF-P2 interacts with the maltose binding protein, independent of the
transmembrane region of MalF and MalG, with a K in the μM range, in the presence D
and absence of substrate. NMR studies showed good agreement of the residues
interacting in solution to those identified in the X-ray structure. Analysis of residual
dipolar coupling (RDC) experiments shows that the conformation of the two
individual domains of MalF-P2 is preserved in the absence of MalE, and resembles
the conformation in the X-ray structure. Upon titration of MalE to MalF-P2, the two
domains of MalF-P2 change their relative orientation in order to accommodate the
ligand. In particular, a conformational change of domain 2 of MalF-P2 is induced,
which is distinct to the conformation found in the X-ray structure. Domain 1 retains
its structure but changes its relative orientation to domain 2. MD simulations of the
MalF-P2 – MalE complex show a highly dynamic interaction of MalF-P2 to the MalE
interface. From NMR CPMG kinetic studies, a peculiar kink of α-helix α2 can be seen
introduced upon association. The transition time of this conformational change of the
α -helix is on the ms timescale, which is matching the exchange rate of the complex
formation.
II Table of contents
Table of contents

Zusammenfassung......................................................................................................... I
Summary.......................................................................................................................II
Table of contents ........................................................................................................ III
Abbreviations ............................................................................................................VII
1. Introduction...............................................................................................................1
1.1. Biology.................................................................................................................1
1.1.1 Membrane proteins ........................................................................................1
1.1.2 General overview of ATP-Binding Cassette (ABC) transporters..................2
1.1.2.1 Characteristics of ABC-transporters.......................................................2
1.1.2.2 Substrate transport ..................................................................................6
1.1.3 The maltose uptake system of E.coli .............................................................9
1.1.4 The maltose transporter MalFGK -E. ..........................................................11 2
1.1.4.1 A transport model for maltose ..............................................................13
1.1.4.2 ATP-hydrolysis....................................................................................14
1.1.4.3 Characteristics of the transmembrane domains ....................................15
1.1.4.4 The periplasmic region of MalFGK ....................................................16 2
1.2 Objectives of this research ..................................................................................18
2 Results .......................................................................................................................19
2.1 Expression and purification of MalF-P2 and MalE ............................................19
2.1.1 Expression and purification of MalF-P2......................................................19
2.1.2 Expression and purification of MalE ...........................................................22
2.2 Characterization of the soluble protein MalF-P2 in solution..............................23
2.2.1 Mass spectrometry (MS)..............................................................................23
2.2.2 Analytical ultracentrifugation (AUC) ..........................................................25
2.2.3 Circular dichroism (CD-) spectroscopy.......................................................26
2.3 Assignments of the soluble protein MalF-P2 by NMR ......................................27
2.3.1 Backbone assignments MalF-P2..................................................................27
2.3.2 Sidechain assignments of MalF-P2..............................................................29
2.4 Structural characterization of MalF-P2 in solution by NMR..............................31
2.5 Interactions of MalF-P2 and MalE in solution ...................................................33
2.5.1 Chemical cross-linking with sulfonate cross-linkers ...................................33
2.5.2 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) .......................................................34
2.5.3 Titration experiments with MalF-P2............................................................36
III Table of contents
2.6 Interactions of MalF-P2 and MalE as seen in the crystal structure of
MalFGK -E.........................................................................................................39 2
2.7 Structural changes of MalF-P