A systematic genome-wide association analysis for inflammatory bowel diseases (IBD) [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Andre Franke

Andre Franke

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: christian-albrechts-universitat_zu_kiel
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 5
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 17 Mo

Extrait

A systematic genome-wide
association analysis for
inflammatory bowel diseases (IBD)
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
vorgelegt von
Dipl.-Biol. ANDRE FRANKE
Kiel, im September 2006Referent: Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C.G. Bosch
Koreferent: Prof. Dr. Stefan Schreiber
Tag der mündlichen Prüfung:
Zum Druck genehmigt:
der Dekan“After great pain a formal feeling comes.”
(Emily Dickinson)
To my wife and familyii
Table of contents
Abbreviations, units, symbols, and acronyms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi
List of figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii
List of tables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .xv
1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
1.1 Inflammatory bowel diseases, a complex disorder . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1 Pathogenesis and pathophysiology. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2
1.2 Genetics basis of inflammatory bowel diseases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.1 Genetic evidence from family and twin studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
1.2.2 Single nucleotide polymorphisms (SNPs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
1.2.3 Linkage studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
1.2.4 Association studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2.5 Known susceptibility genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.2.5.1 CARD15. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
1.2.5.2 CARD4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
1.2.5.3 TNF-α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
1.2.5.4 5q31 haplotype . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
1.2.5.5 DLG5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
1.2.5.6 TNFSF15 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
1.2.5.7 HLA/MHC on chromosome 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
1.2.5.8 Other proposed IBD susceptibility genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
1.2.6 Animal models . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.3 Aims of this study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24
2.1 Laboratory information management system (LIMS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2 Recruitment. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3 Sample preparation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3.1 DNA extraction from blood. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3.2 Plate design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.4 Measurement of DNA concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.5 Whole genome amplification (WGA). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.6 Agarose gel electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.7 Mutation detection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.7.1 Primer design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.7.2 Polymerase chain reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.7.3 DNA sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.7.3.1 Sequence analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38iii
2.8 Genotyping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392.8.1 TaqMan
2.8.2 SNPlex™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.8.3 SNP selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.8.4 Design of coding SNPlex™ pools by Applied Biosystems . . . . . . . . . . . 48
2.8.5 Affymetrix arrays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.8.6 Quality control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.9 Association analyses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.9.1 Linkage disequilibrium (LD). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.9.2 Case-control single-point analyses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.9.2.1 Genotype-based case-control comparison (CCG) . . . . . . . . . . . . . . . .58
2.9.2.2 Allele-based case-control comparison (CCA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
2.9.2.3 Odds ratio (OR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
2.9.3 GENOMIZER - an analysis tool for genome-wide
association studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.9.4 Transmission disequilibrium test (TDT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
2.9.5 Haplotype analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2.9.5.1 Haplotype tagging SNPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69
2.9.6 Multivariate logistic regression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.9.7 Fisher’s exact test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.10 Functional experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.10.1 Gene expression experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.10.1.1 Stimulation of cell lines. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
2.10.1.2 RNA extraction from cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72
2.10.1.3 cDNA synthesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
2.10.1.4 Plate production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
2.10.1.5 Real-time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74
2.10.2 Isolation of primary epithelial cells (IECs). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.10.3 RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.10.4 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
2.10.5 Immunohistochemistry. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
2.11 Protein modeling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80
3.1 Genome-wide screenings (GWS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
3.1.1 Direct approach: cSNP experiment. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
3.1.2 LD-based approach: 100k SNP array . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
3.1.2.1 Randomization of the 100k dataset . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88
3.2 Replication of leads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.2.1 Replication of the ATG16L1 nsSNP in a UK panel . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.2.2 RNELL1 and 5p13.1 lead SNPs in
independent panels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
3.3 Mutation detection and fine mapping of candidate genes and regions . . . . . . 91
3.3.1 ATG16L1 fine mapping . . . . . . . . . . . . . .