Actions of lignocellulolytic enzymes on Abies grandis (grand fir) wood for application in biofuel production [Elektronische Ressource] / submitted by Banyat Cherdchim

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• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 28
• Langue: English
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Extrait

Actions of lignocellulolytic enzymes on
Abies grandis (grand fir) wood
for application in biofuel production





Dissertation
In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree
Doctor of Philosophy (PhD)
of the Faculty of Forest Sciences and Forest Ecology
Georg-August-University Göttingen





Submitted by
Banyat Cherdchim
born in Songkhla, Thailand







Göttingen, 2010













































































Actions of lignocellulolytic enzymes on
Abies grandis (grand fir) wood
for application in biofuel production





Dissertation
In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree
Doctor of Philosophy (PhD)
of the Faculty of Forest Sciences and Forest Ecology
Georg-August-University Göttingen





Submitted by
Banyat Cherdchim
born in Songkhla, Thailand







Göttingen, 2010























D7
st
1 Referee: Prof. Dr. Ursula Kües
nd2 Referee Prof. Dr. Stefan Schütz
rd
3 Referee Prof. Dr. Edmone Roffael

thDate of Oral Examination: 27 October 2010

Zusammenfassung
Zusammenfassung

Abies grandis ist ein schnell wachsender Nadelbaum, der großes Potential in der nach
haltigen Holzproduktion und deren verarbeitetenden Industrie besitzt. Daher ist es für
mögliche Anwendungen notwendig, mehr über das Verhalten von A. grandis Holz
gegenüber holzabbauenden Pilzen zu erfahren. In Abbauversuchen nach Norm EN 113
(1996) konnten sowohl Holz als auch Holzprodukte von A. grandis durch Braunfäule
pilze abgebaut werden, aber gegenüber Weißfäulepilzen zeigten A. grandis Holz eine
vergleichsweise gute Resistenz. Früh und Spätholz von A. grandis wurde in unter
schiedlicher Stärke über die Inkubationszeit abgebaut. Nach 19 Wochen zeigten die
vom Braunfäulepilz Corniophora puteana besiedelten Früh und Spätholzproben einen
höheren Gewichtsverlust als die Frühholzproben. Im Gegensatz dazu verursachte der
Weißfäulepilz Trametes versicolor einen 2mal höheren Gewichtsverlust bei Frühholz
proben im Vergleich zu Früh und Spätholzproben. Behandlung mit Harnstoffform
aldehyd oder Ammoniumsulfat steigerte die Beständigkeit des Holzes gegenüber Weiß
fäulepilzen. Wasser und Acetonextrahiertes Holz verlor dagegen an Resistenz
Rissiges Holz war darüber hinaus auch anfälliger; wahrscheinlich erlauben Risse Pilzen
einen leichten Eintritt ins Holz.
Es wurde angenommen, dass Weißfäulepilze oxidative Enzyme (Laccasen, Per
oxidasen) sekretieren, um das in den Holzzellwänden vorkommende Lignin zu modifi
zieren. Diese Modifikation des Lignins resultiert in Chinonstrukturen, die mit MBTH
(3Methyl2benzothiazolinonhydrazon Hydrochlorid Monohydrat) gefärbt werden
können, worauf eine rötliche Farbe entsteht. Die Effekte der oxidativen Enzyme auf
Holzzellwände wurde untersucht, in dem Holzschnitte mit MBTH inkubiert wurden.
Rötliche Färbung der Holzzellwand deutete dabei auf modifiziertes Lignin in der
Holzzellwand hin. Die Dicke der Zellwand und deren Färbung verringerten sich durch
längere Inkubation mit T. versicolor, wahrscheinlich durch starken Ligninabbau. Inner
halb von Jahrringen nahm der Anteil des gefärbten Zellwandbereichs (A ) und der geS
samte Zellwandbereich (A ) in einer sförmigen Kurvenform vom Früh zum Spätholz T
zu. Um den Angriff der Pilze auf das Lignin zu simulieren, wurde das RedOxEnzym
Laccase mit Mediator (HBT: 1Hydroxybenzotriazol, HBA: 4Hydroxybenzoesäure;
3+
beide Substanzen reagieren nach Oxidation durch Laccase mit Lignin) oder Mn Ace
tat als ein mit Lignin reagierendes Produkt der pilzlichen Manganperoxidase in A. gran-
i Zusammenfassung
dis Vollholz injiziert. Die rötliche Färbung mit MBTH war etwas besser mit Laccase
3+mit HBT als mit HBA. Auch die Inkubation mit Mn Acetat ergab eine rötliche
3+
Färbung der Holzzellwände, wobei die stärkste Färbung bei der höheren Mn Acetat
Konzentration von 10 mM auftrat.
Die Weißfäulepilze Pleurotus ostreatus und T. versicolor zählen zu den besten
Laccaseproduzenten bei Zugabe von A. grandis Holz als Laccaseinduktor zu Pilzkultu
ren. Holz und Holzextrakstoffe induzierten in Abhängigkeit von Konzentration die
Produktion von extrazellulären Laccasen, aber nicht von anderen lignozellulolytischen
Pilzenzymen, wie Manganperoxidase (MnP), Ligninperoxidase (LiP) oder Zellulasen
als Enzyme, die ebenfalls mit Lignocellulose reagieren. Aus Kultivierungsversuchen
der Pilze in Medium mit Holz und unterschiedlichen C und N Gehalten läßt sich
folgern, dass das C/N Verhältnis des Holzes ein weiterer genereller Faktor in der Lac
caseinduktion ist.
Holzextraktstoffe von A. grandis zeigten inhibierende Wirkung auf das Wachs
tum der Weißfäulepilze Coprinopsis cinerea, P. ostreatus und T. versicolor. Die extra
hierbaren Holzstoffe wurden mittels Gaschromatographie und Massenspektrometrie
(GCMS) identifiziert. In den Wasser und den Acetonextrakten wurden neun verschie
dene phenolische Stoffe gefunden: 2Methoxyphenol (Guajacol), 4Hydroxybenzalde
hyd, 1,4Dihydroxybenzen (Hydrochinon), 3,5Ditertbut4hydroxytoluol (Butylhydro
xytoluol), 3Methoxy4hydroxybenzaldehyd (Vanillin), 4Hydroxybenzoesäure,
3Methoxy4hydroxybenzoesäure (Vanillinsäure), 4Hydroxyzimtsäure (pCumarin
säure) und 4Hydroxy3methoxyzimtsäure (Ferulasäure). Einige der natürlichen phe
nolischen Stoffe, wie 4Hydroxyzimtsäure, 4Hydroxybenzaldehyd oder 3,5Ditertbut
4hydroxytoluol können als natürliche Induktoren in der Laccaseproduktion mit
P. ostreatus und T. versicolor eingesetzt werden. Allerdings hemmte die Zugabe von
1,4Dihydroxybenzen und pBenzochinon zu den Flüssigkulturen in der Konzentration
von 1 mM das Wachstum von P. ostreatus und T. versicolor. Durch Holyextrakstoffe in
der Produktion induzierte Lasseisoenyzme der beiden Pilze wurden mittels nativer
Gelelektrophorese analysiert und mittels MSAnalyse der proteolytisch verdauten
Proteine indentifiziert. Im Fall von P. ostreatus wurde das Isoenzym Laccase II und im
Fall von T. versicolor die Isoenzyme Laccase I und Laccase III gefunden.
Weiterhin wurde A. grandis Holz für den technischen Einsatz in der enzymati
schen Biokraftstoffherstellung getestet. Dabei konzentrierten sich die Experimente auf
chemische, physikalischchemische und biologische Vorbehandlungen des Holzes und
ii Zusammenfassung
auf die Hydrolyse von Zellulose durch Zellulasen, die entweder allein oder in Kombina
tion mit anderen Enzymen (Xylanase, Laccase oder βGlukosidase) eingesetzt wurden,
um eine hohe Ausbeute an Glukose aus dem lignozellulosehaltigen Substrat für die Bio
kraftstoffherstellung zu erhalten. In biologischen Vorbehandlungen wurden kleine
A. grandis Holzblöcke für 19 Wochen nach der Norm EN 113 (1996) mit Pilzen inku
biert. Die biologische Vorbehandlung mit P. ostreatus (im Vergleich zu T. versicolor
und C. puteana) ergab exzellente Raten von 42,8% für die Umsetzung der gesamten
Holzmasse in Glukose, was 92,4% der im A. grandis Holz verfügbaren Zellulose
entspricht.
Eine energieaufwendigere Vorbehandlung unter Einsatz von 8 ml einer 85%igen
oPhosphorsäure für 1 h bei 50 C resultierte ebenfalls in guten Glukoseausbeuten bei An
1wendung von jeweils 4 U ml Zellulase, Xylanase und Laccase. Längere Inkubations
zeiten und höhere Konzentrationen und Mengen an Phosphorsäure bei einer Inkuba
otionstemperatur von 50 C führten zu Gewichtsverlusten von bis zu 50% bei gleichzei
tiger Steigerung des Zelluloseanteils auf bis zu 100%. Höchste Glukoseausbeuten (bis
zu 100%) konnten durch eine physikalischchemische Vorbehandlung erzielt werden,
bei der 1 g Holzpartikel in 8 ml einer 85%igen bzw. 80%igen Phosphorsäure für 20 sec
in einer Mikrowelle erhitzt wurde, und eine anschließende Hydrolyse mit einer Mi
1 1 1schung aus 4 U ml Zellulase, 4 U ml Xylanase und 4 U ml Laccase oder, alternativ
1
zur Laccase, 4 U ml βGlukosidase für 24 h in 5 ml 50 mM NatriumacetatPuffer,
pH 5.0. Die Mikrowellenbehandlung erlaubte eine Reduzierung der Phosphoräurekon
zentration unter 80% bis hin zu 40% und 20% mit noch annehmbaren Zuckerausbeuten
in nachfolgender enyzmatisch