Analysis of the spore formation process in Myxococcus xanthus [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Frank-Dietrich Müller

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• Publié le: 01 janvier 2009
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• Langue: Deutsch
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Extrait

Analysis of the spore formation process
in Myxococcus xanthus
D I S S E R T A T I O N

zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)

dem
Fachbereich Biologie
der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von
Frank-Dietrich MÜLLER
aus Zwickau






Marburg/Lahn im Januar 2009
II





















Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am

____________________ angenommen.


Erstgutachter: Prof. Dr. MD Lotte Søgaard-Andersen
Zweitgutachter: Prof. Dr. Renate Renkawitz-Pohl

Tag der mündlichen Prüfung: 31.03.2009
III
IV




Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von Dezember 2005 bis
November 2008 am Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie Marburg unter
der Leitung von Dr. Penelope I. Higgs durchgeführt.

*
Die während der Promotion erzielten Ergebnisse wurden und werden in folgenden
Originalpublikationen veröffentlicht:

Müller, F.-D. & Jakobsen, J. S. (2008). Expression analysis. In: Myxobacteria.
Multicellularity and Differentiation. D. E. Whitworth (ed). Washington, D.C.: ASM
Press, pp. 479 - 489.
Müller, F.-D. & Higgs, P. I. (2009). Identification of a novel locus involved in spore
formation in Myxococcus xanthus by transcriptome profiling. In preparation.

*
Ergebnisse aus in dieser Dissertation nicht erwähnten Projekten sind in folgenden
Originalpublikationen veröffentlicht:

Kleinsteuber, S., Müller, F.-D., Chatzinotas, A., Wendt-Potthoff, K., Harms, H. (2008).
Diversity and in situ quantification of Acidobacteria subdivision 1 in an acidic mining
lake. FEMS Microbiol Ecol. 63(1): 107-17.
V VI KURZFASSUNG

Myxococcus xanthus ist ein Vertreter Gram-negativer Bakterien, die die Fähigkeit
besitzen, als Antwort auf sich verschlechternde Umweltbedingungen widerstandsfähige
und metabolisch inaktive Sporen zu bilden. Im Gegensatz zu bereits gut untersuchten
Gram-positiven Modellorganismen, die Sporen durch spezialisierte Zellteilung hervor-
bringen, werden M. xanthus–Sporen durch Abrunden vollständiger, stäbchenförmiger
Zellen gebildet. Die Sporulation erfolgt normalerweise innerhalb multizellulärer Frucht-
körper als letztes Stadium eines komplizierten, durch Nährstoffmangel induzierten Ent-
wicklungsprogramms. Die Analyse des Sporulationsprozesses wird durch das Auftreten
nicht sporulierender Teilpopulationen innerhalb einer sich differenzierenden Kolonie
sowie den geringen Anteil der tatsächlich sporenbildenden Zellen und die hohe
Widerstandsfähigkeit der Sporen nachhaltig erschwert. Deshalb wurde in der vor-
liegenden Arbeit die glycerininduzierte, synchrone Sporulation als Modell für den
Differenzierungsprozess vegetativer M. xanthus-Zellen in resistente, sphärische Sporen
genutzt. Eine Transkriptomanalyse der glycerin-induzierten Zellen mit Hilfe von Micro-
arrays ergab, dass während der ersten vier Stunden nach erfolgter Induktion 1.596 Gene
mindestens zweifach höher oder niedriger transkribiert werden, als in vegetativen
Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass die Gruppe der differentiell regulierten Gene die
meisten der bisher beschriebenen sporulationsspezifischen Markergene enthält, nicht
jedoch Gene, die für Aggregation und Fruchtkörperbildung spezifisch sind. Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Glycerininduktion speziell den Sporulationsprozess aktiviert
und als Modellsystem für die Differenzierung vegetativer M. xanthus-Zellen geeignet
ist.
Die Analyse der Microarraydaten führte zur Identifikation eines bisher unbeschriebenen
Genclusters, der als nfs (necessary for sporulation) bezeichnet wurde. Alle acht hier
codierten Proteine besitzen keine Homologie zu bereits charakterisierten Proteinen. In-
frame-Deletion aller acht Gene führte zu einem Defekt sowohl in glycerin- als auch in
nährstoffmangelinduzierter Sporenbildung, während Aggregation und Fruchtkörper-
bildung nicht beeinträchtigt waren. Von der nfs-Promotorregion ausgehende Transkrip-
tion war 30 Minuten nach Glycerininduktion und während nährstoffmangelinduzierter
Sporulation ausschließlich in der sporenbildenden Subpopulation nachweisbar. Diese
Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die nfs-Gene den zentralen Sporulationsgenen
zugehören. Die glycerininduzierte Sporulation führte zu vorübergehendem Auftreten
morphologisch aberranter Zellen. Die Analyse verschiedener Entwicklungsmutanten
weist außerdem darauf hin, dass die Expression der nfs-Gene während
nährstoffmangelinduzierter Sporulation C-Signal abhängig ist und durch FruA
kontrolliert wird. Zellfraktionierung, Bioinformatik- und Immunoblot-Analysen legen
nahe, dass die Nfs-Proteine mit der Zellhülle assoziiert sind und interagieren. Die
Ergebnisse lassen insgesamt darauf schließen, dass die Nfs-Proteine für die Bildung
widerstands- und lebensfähiger Sporen essentiell sind und einen speziell während der
Sporulation gebildeten und in der Zellhülle verankerten Komplex bilden.
VII Darüber hinaus wurde die Rolle des filament- und cytoskelettbildenden Proteins MreB
bei der Zellform-Konversion während der Sporenbildung und Sporenkeimung in M.
xanthus untersucht. MreB ist in den meisten stäbchenförmigen Bakterien maßgeblich an
der Aufrechterhaltung der Zellform sowie an Wachstums- und Zellteilungsprozessen
beteiligt. Immunoblot-Analysen legen nahe, dass MreB während glycerininduzierter
Sporenbildung in vergleichbaren Mengen erhalten bleibt, während nährstoffmangel-
induzierter Sporenbildung jedoch abgebaut wird. Dies deutet an, dass alternative
Mechanismen der Zellformkonversion in M. xanthus existieren. Ferner weist die
Analyse der Sporenkeimung in Gegenwart der MreB-destabilisierenden Verbindung
A22 darauf hin, dass die Bildung polymerer MreB-Filamente einen wesentlichen Schritt
während des Keimungsprozesses, also während der Konversion sphärischer Zellen in
stäbchenförmige, darstellt.
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, mit Hilfe von M.
xanthus als Modellorganismus fundamentale Mechanismen der Entstehung bakterieller
Zellmorphologie, gesteuerter Konversion der Zellform, Zellwandsynthese und Bildung
resistenter Sporen in Gram-negativen Bakterien zu entschlüsseln.
VIII ABSTRACT

Myxococcus xanthus is a representative of Gram-negative bacteria that are able to form
quiescent, environmentally-resistant spores in response to changes in environmental
conditions, such as nutrient depletion. M. xanthus spores are formed inside fruiting
bodies as final stage of an elaborate developmental program. In contrast to well studied
Gram-positive spore formers, where sporulation is linked to cell division, M. xanthus
spores are formed by rounding up of an entire rod-shaped cell. Studies on the core
sporulation process in M. xanthus are impeded by the complexity of the starvation
induced developmental program, subpopulations within a developing colony, the low
proportion of cells that convert into spores, and their high mechanical resistance. We
took advantage of the glycerol induced spore formation process and performed micro
array analysis. This study revealed that 1,596 genes are significantly at least two-fold
up- or down-regulated within four hours after addition of the inducer. Most of the genes
that previously have been identified to play a role during starvation induced sporulation
were found to be up-regulated indicating that the glycerol induced sporulation is an
appropriate model to study the core sporulation process in M. xanthus.
The array data analysis led to identification of a novel and highly up-regulated genomic
locus termed nfs (necessary for sporulation). The nfs locus encodes for eight proteins
that show no homology to characterized proteins. Bioinformatics, mutational and
immunoblot analysis suggest that the Nfs-proteins localize to the cell envelope and form
a complex. In-frame deletion of the nfs-genes led to a severe defect both in glycerol and
starvation induced sporulation, whereas aggregation was not affected. In response to
glycerol induction, the ∆nfs mutant displayed transiently aberrant cell morphology.
Transcription from the nfs-promoter was detectable 30 minutes after induction with
glycerol. Translational fusion of the putative promoter region to mcherry as reporter
suggests that the nfs-genes only accumulate in spores. Analysis of nfs-expression in
developmental mutant backgrounds suggests that nfs-expression is dependent on C-
signaling and controlled by FruA. Based on this observation it is hypothesized that the
Nfs proteins are specifically expressed during spore formation, that they form a cell
envelope-associated complex and that they play a crucial role in generating viable
spores.
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