Biochemical analysis of the inhibition of Ralstonia solanacearum polygalacturonases by polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIP) from tomato stems and biochemical, histochemical and molecular analysis of the silicon effect in the tomato (Solanum lycopersicum) - Ralstonia solanacearum interaction [Elektronische Ressource] / Tanja Schacht

Tanja Schacht

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• Publié le: 01 janvier 2010
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Extrait

Biochemical analysis of the inhibition of Ralstonia solanacearum
polygalacturonases by polygalacturonase-inhibiting proteins
(PGIP) from tomato stems and biochemical, histochemical and
molecular analysis of the silicon effect in the tomato (Solanum
lycopersicum) – Ralstonia solanacearum interaction



Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Gartenbauwissenschaften
- Dr. rer. hort. -
genehmigte Dissertation
von


Dipl. –Ing. agr. Tanja Schacht
geboren am 30. Mai 1977 in Hannover


2009



















Referentin: Prof. Dr. Kerstin Wydra
Korreferent: PD Dr. Achim Gau
Tag der Promotion: 29.10.2009
Zusammenfassung II

ZUSAMMENFASSUNG


Bakterielle Welke, verursacht durch Ralstonia solanacearum, ist eine der bedeutendsten
Bakteriosen in den Tropen und Subtropen. Eine chemische Bekämpfung von
R. solanacearum ist nahezu unmöglich. Daher spielt die Entwicklung integrierter
Bekämpfungsmaßnahmen, unter Einbeziehung von Wirtspflanzenresistenzen und
Resistenzinduktion durch verschiedene Induktoren, eine bedeutende Rolle in der Bekämpfung
von R. solanacearum. Ein Hauptaugenmerk der bisherigen Forschung richtete sich auf die
Interaktion zwischen Wirtspflanze und R. solanacearum, aber die genauen
Resistenzmechanismen sind bis heute weitgehend unbekannt. Aus diesem Gund bestand der
erste Teil dieser Arbeit aus der Untersuchung einer Interaktion des Pathogens mit der
Modellpflanze Tomate, nämlich der Protein – Protein - Interaktion von Pflanzenzellwand-
abbauenden Polygalakturonasen (PGs) von R. solanacearum und Proteinen aus der
Pflanzenzellwand, den Polygalakturonase-inhibierenden Proteinen (PGIPs). Eine Inhibierung
bakterieller PGs durch pflanzliche PGIPs wird in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal
beschrieben.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Untersuchung von möglichen Mechanismen
der Siliziumdüngung über Bodenapplikation als Resistenzinduktur in Tomate gegenüber
R. solanacearum. Biochemisch wurden Peroxidasen (PODs) und Polyphenoloxidasen (PPOs),
histochemisch Lignifizierung, Tylosenbildung, Wasserstoffperoxid (H O ) Akkumulation und 2 2
Calloseablagerung, immunohistochemisch Veränderungen struktureller Komponenten der
pektischen Polysaccharide wie Arabinogalaktanprotein (AGP), (1→5)-α-L-Arabinan und
nicht-blockweise deesterifizierte pektische Epitope des Homogalakturonans, sowie mit einem
molekularen Ansatz die Expression von Genen verschiedener Pflanzenzellwandkomponenten,
wie AGP, Extensin and Callosesynthase, aber auch Gene involviert in ‚plant defense signalling
pathways‘, wie non-inducible immunity (NIM), jasmonate ZIM-domain protein1 (JAZ1),
ethylene responsive factor1 (ERF1) und coronatine-insensitive1 (COI1) untersucht.
Die Ergebnisse deuten auf eine Rolle von PPO und Tylosenbildung in der Silizium-induzierten
Resistenz von Tomate gegenüber R. solanacearum und, einen Einfluss von Calloseablagerung,
Pflanzenzellwandkomponenten wie AGP, Extensin, Callosesynthase, aber auch der Gene NIM
and JAZ1 in der Interaktion von R. solanacearum mit Tomate hin.

Ralstonia solanacearum, Protein – Protein - Interaktion, Silizium - induzierte Resistenz
Summary III
SUMMARY


Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is one of the most important bacterial
diseases in the subtropics and tropics. Chemical control of R. solanacearum is nearly
impossible, thus integrated approaches, including host plant resistance and resistance induction
by various inducers, are promising for a bacterial wilt management system. Many studies
focused on the interaction of R. solanacearum and its host plants, but resistance mechanisms
are not well understood so far. Thus, we conducted the first part of this study in order to
elucidate the interaction of the pathogen with the model host plant tomato, investigating the
protein-protein interaction of the pathogen’s cell wall degrading polygalacturonases (PGs) and
plant cell wall proteins, the polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs). Our results
demonstrate for the first time the effect of a PGIP that inhibits bacterial PGs.
In the second part of the study possible mechanisms by which silicon, supplied as soil
amendment, induces resistance in tomato to R. solanacearum should be identified.
We focussed in biochemical analyses on peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO),
histochemically on lignifications, tylsosis formation, hydrogen peroxide (H O ) accumulation 2 2
and callose deposition, immunohistochemically on structural componentes of pectic
polysaccharides like arabinogalactan protein (AGP), (1→5)-α-L-arabinan and non-blockwise
de-esterified epitopes of homogalacturonan and, with a molecular approach on the expression
of genes related to plant cell wall components like AGP, extensin and callose synthase as well
as on genes of plant defense signalling pathways like non-inducible immunity (NIM),
jasmonate ZIM-domain protein1 (JAZ1), ethylene responsive factor1 (ERF1) and coronatine-
insensitive1 (COI1).
Based on the observations, we suggest that PPO and tylosis formation are involved in the
silicon-induced resistance of tomato to R. solanacearum and, callose deposition, the cell wall
related components AGP, extensin, callose synthase, but also genes such as NIM and JAZ1 are
involved in the tomato – R. solanacearum interaction.


Ralstonia solanacearum, protein – protein - interaction, silicon - induced resistance


Contents IV
CONTENTS


Zusammenfassung ........................................................................................... II
Summary ......................................................................................................... III
Contents ........................................................................................................... IV
Abbreviations .................................................................................................. IX
General introduction ......................................................................................... 1
Ralstonia solanacearum ........................................................................................................ 1
Plant resistance ...................................................................................................................... 5
Silicon .................................................................................................................................... 8

CHAPTER 1: Inhibition of endo- and exopolygalacturonases of Ralstonia
solanacearum by polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) activity in
tomato stem extracts ........................................................................................ 11
1.1 Introduction .................................................................................................................. 12
1.2 Materials and methods .................................................................................................. 15
1.2.1 Bacterial cultures and media ............................................................................. 15
1.2.2 Fungal culture, medium and preparation of enzyme extract ............................ 16
1.2.3 Detection of polygalacturonase activity ........................................................... 16
1.2.3.1 Thin layer chromatography .............................................................. 16
1.2.3.2 Agarose diffusion assay (ADA) ....................................................... 16
1.2.3.3 Degradation assay ............................................................................ 17
1.2.4 Plant material and inoculation procedure ......................................................... 17
1.2.5 Symptom Evaluation ........................................................................................ 18
1.2.6 Extraction of plant material for determination of polygalacturonase-inhibiting
protein (PGIP) activity ...................................................................................... 18
1.2.7 Extraction and characterization of PG isozymes .............................................. 19
1.2.7.1 Isozyme separation by hydrophobic interaction chromatography ... 19
1.2.7.2 Fluorophor-assisted carbohydrate – polyacrylamid – gel
electrophoresis (FACE-PAGE) for quantification and analysis of
liberated carbohydrate fragments ..................................................... 19 Contents V
1.2.7.3 Mass spectrometry ........................................................................... 20
1.2.8 Polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) activity ...................................... 20
1.2.8.1 Agarose diffusion assay (ADA) ....................................................... 20
1.2.8.2 Calculation of PGIP activity ............................................................ 21
1.2.8.3 Degradation assay ...................................................................