Biological adhesion on nanopatterned substrates studied with force spectroscopy and microinterferometry [Elektronische Ressource] / presented by Christine Selhuber

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: ruprecht-karls-universitat_heidelberg
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 14
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 8 Mo

Extrait

Dissertation
submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
Christine Selhuber, M. Sc.
born in Landshut
Oral examination: December 4th, 2006Biological Adhesion
on Nanopatterned Substrates
Studied with Force Spectroscopy and
Microinterferometry
Referees:
Prof. Dr. Joachim Spatz
Prof. Dr. Heinz HornerUntersuchung biologischer Adh¨asionsprozesse auf nanostrukturierten Sub-
straten mittels Kraftspektroskopie und Mikro-Interferometrie
Fu¨r ein physikalisches Verst¨andnis von Adha¨sionsprozessen sind Oberfl¨achenstrukturen
mit definierten Adha¨sionseigenschaften vonno¨ten. In dieser Arbeit wurden biofunktionali-
sierteNanostrukturenverwendet,welcheeinequasi-hexagonaleAnordnungvonMoleku¨len
ermo¨glichen. Die Oberfl¨achenenergie einer solchen Anordnung von Streptavidinmoleku¨len
wurde interferometrisch analysiert. Desweiteren wurden Nanostrukturen verwendet, um
die integrinvermittelte Adha¨sion von Zellen zu untersuchen. Diese Art der Adha¨sion
stellt einen hochkomplexen biologischen Prozess dar und ist essenziell fu¨r zahlreiche Zell-
funktionen. Mit Hilfe von Nanostrukturen la¨sst sich der Abstand einzelner Integrin-
bindungsstellen pr¨azise definieren. In Zellkulturexperimenten zeigte sich, dass dieser Ab-
stand die Zelladha¨sion nachhaltig beeinflusst, insbesondere die Bildung von Adha¨sions-
clustern, den sogenannten Fokalkontakten. Um die Adha¨sionsclusterbildung bei ver-
schiedenen Absta¨nden von Integrinbindungsstellen zu erfassen, wurde im Rahmen dieser
Arbeit die Zelladha¨sion kraftspektroskopisch mit Hilfe einer magnetischen Pinzette und
eines Rasterkraftmikroskops (AFM) fu¨r verschiedene Adha¨sionszeitr¨aume untersucht. Die
Experimente zeigten, dass ein Abstand der Integrinbindungsstellen von 70 nm und mehr
die kooperative Ausbildung von Adha¨sionsclustern bereits in Kurzzeitadha¨sionsprozessen
erheblicheinschr¨ankt. InLangzeitadha¨sionsstudiennachmehrstu¨ndigerZelladha¨sionstell-
tesichheraus,dassdieFokalkontaktbildungzueinerkooperativenVerst¨arkungderlokalen
Adha¨sionssta¨rke fu¨hrt. Die gewonnen Resultate wurden mit theoretischen Modellen in
Beziehung gesetzt und leisten einen wesentlichen Beitrag zum physikalischen Verst¨andnis
der Zelladha¨sion.
Biological Adhesion on Nanopatterned Substrates Studied with Force Spec-
troscopy and Microinterferometry
For a physical understanding of adhesion, surfaces of defined adhesion properties are
required. In this work, biofunctional nanopatterns were employed, which allow molecules
to be positioned in a quasi-hexagonal lattice. For such an arrangement of streptavidin
moleculesthesurfaceenergywasanalysedmicrointerferometrically. Furthermore,nanopat-
terns were used to investigate integrin-mediated cell adhesion, which is a highly complex
biological process and essential for numerous cell functions. With nanopatterns the dis-
tancebetweenadjacentsingleintegrinbindingsitesispreciselydefined. Recentcellculture
experiments have revealed that this distance strongly affects cell adhesion, especially the
formation of adhesion clusters, known as focal contacts. To quantify the adhesion cluster
formationfor differentintegrin bindingsitespacings, celladhesionwasstudied atdifferent
timescales using magnetic tweezers and atomic force microscopy (AFM). The experiments
demonstrated that an integrin binding site spacing of 70 nm and more prevents the co-
operative formation of early adhesion clusters in initial adhesion. In long-term adhesion
studies, after several hours of cell adhesion, it turned out that focal contact formation
cooperatively increases the local adhesion strength. The obtained results could be related
to theoretical models and make an important contribution to the physical understanding
of cell adhesion.Contents
Introduction and Objective 1
I Principles of Adhesion 3
1 Cell-Surface Interactions 5
1.1 The Connective Tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 The Cell Adhesion Machinery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.1 Cell Adhesion Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.2 Cell Adhesion Clusters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3 A Closer Look at Adhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.1 Dynamics of Adhesion Structures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.2 Mechanical Properties of Adhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.3 Manipulation of Adhesion by Surface Engineering . . . . . . . . . . 12
2 Physical Adhesion Concepts 15
2.1 General Adhesion Models . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2 Specific Adhesion in Biological Systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.3 Multiple-Bond Adhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
II Experimental Design and Measurement Techniques 21
3 Nano- and Microadhesive Templates 23
3.1 Gold Nanostructures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.2 Methods to Prevent Non-specific Protein Adsorption . . . . . . . . . . . . . 25
3.2.1 Covalent coupling of mPEG2000-Urea to the surface . . . . . . . . . 26
3.2.2 Electrostatic Passivation with PLL-g-PEG . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.3 Functionalisation of Gold Nanopatterns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.3.1 Integrin Specific Functionalisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.3.2 General Coupling of Proteins to Nanodots . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.4 Gold Microstructures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.5 Discussion of the Surface Preparation Strategies . . . . . . . . . . . . . . . 31
vvi Contents
4 Methods to Characterise Adhesion 33
4.1 Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) . . . . . . . . . . . . . 33
4.1.1 Setup and Image Formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.1.2 Applications of RICM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.2 Magnetic Tweezers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.1 Experimental Setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.2 Calibration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.3 Atomic Force Microscopy (AFM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.3.1 Design of an AFM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.3.2 Cantilever Calibration and Sensitivity Analysis . . . . . . . . . . . . 42
4.3.3 Supported Cantilevers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.3.4 Cell Experiments and their Interpretation . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.4 Capabilities of the Different Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
III Adhesion on Nanopatterned Substrates 51
5 Surface Energy of Nanopatterns 53
5.1 Experimental Setup for Surface Energy Characterisation . . . . . . . . . . . 53
5.2 Models for the Elastic Contact of Solids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.2.1 The Hertz Model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.2.2 The Johnson-Kendall-Roberts Model . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.3 Elasticity Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
5.4 Surface Energy of Streptavidin Functionalised Nanopatterns . . . . . . . . . 58
5.5 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
6 Cell-Surface Contact Formation 63
6.1 Substrate Exploration by Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6.2 Fibroblast Spreading and its Quantitative Description . . . . . . . . . . . . 66
6.3 Dependence of Cell Adhesion on Passivation Chemistry . . . . . . . . . . . 69
6.4 RICM Studies of Focal Contacts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
IV Force Experiments with Live Cells 77
7 Initial Adhesion 79
7.1 Viscoelastic Cell Response . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
7.1.1 Viscoelastic Models . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
7.1.2 Cell Experiments and their Interpretation . . . . . . . . . . . . . . . 80
7.2 Interaction Forces of Cells with Passivated Substrates . . . . . . . . . . . . 83
7.3 Single Molecule Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
7.4 Adhesion Cluster Formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
7.4.1 Magnetic Tweezers Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
7.4.2 AFM Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
7.4.3 Modelling Adhesion Cluster Formation . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
7.5 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102Contents vii
8 Long-term Adhesion 103
8.1 Experimental Setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
8.2 Cell Detachment Forces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
8.3 Focal Contact Detachment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
8.4 Comparison with Theory . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
8.5