Biophysical characterization of ABC transporters catalyzing import and export function [Elektronische Ressource] / von Britta Tschapek

Britta Tschapek

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• Publié le: 01 janvier 2011
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• Langue: English
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Extrait

Biophysical characterization of ABC transporters
catalyzing import and export function


Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf

vorgelegt beim Fachbereich
Biochemie


von
Britta Tschapek
aus Viersen

Düsseldorf, Februar 2011

















Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf


1. Gutachter: Prof. Dr. Lutz Schmitt
2. Gutachter: PD Dr. Ulrich Schulte


Tag der mündlichen Prüfung:

ABSTRACT II
ZUSAMMENFASSUNG IV
1. INTRODUCTION 1
1.1 ABC-TRANSPORTER 1
1.1.1 NUCLEOTIDE BINDING DOMAINS 4
1.1.2 SUBSTRATE BINDING PROTEINS 6
1.2 OBSTACLES TO OVERCOME: STUDYING ABC-TRANSPORTERS IN VITRO 9
1.3 BIOPHYSICAL METHODS: ANALYZING DETERGENTS 10
1.3.1 CMC DETERMINATION 11
1.3.2 CALCULATING AGGREGATION NUMBERS 13
1.4 TYPE I SECRETION IN ESCHERICHIA COLI: A MULTI PROTEIN COMPLEX INCLUDING THE ABC-TRANSPORTER
HLYB 15
2. LITERATURE 19
CHAPTER I 23
CHAPTER II 39
CHAPTER III 72
CHAPTER IV 118
CHAPTER V 127
CHAPTER VI 150
CHAPTER VII 166


I Abstract
Abstract
This work contributes to an understanding of substrate recognition and translocation
performed by ABC-transporters. ABC-transporter form one of the largest protein-familiy of
membrane proteins. Classically, they consist of two nucleotide binding (NBDs) and two
transmembrane domains (TMDs). This architecture facilitates transport of a large variety of
substrates using ATP as energy source in all three kingdoms of life. Among these import and
export systems are differentiated. Import systems are so far only found in prokaryotes and
archaea and require an additional substrate binding protein (SBP), which binds the substrate
in the periplasm or extracellular space and delivers it to the transporter. SBPs of ABC-
transporter show all a common architecture: They consist of two domains different in size, in
between a deep cleft where the substrate binding-site is located. Crystal structures of various
SBPs have shown mainly two conformations: one without substrate (open) and one with
substrate bound (close) where the substrate is located in the cleft and the two domains have
rotated towards each other. Through structural analysis of SBPs substrate specificity,
mechanism of substrate binding and release could be illustrated via the example of the ABC-
transporter OpuB from Bacillus subtilis and ProU from thermophilic Archaeoglobus fulgidus. The
contribution to substrate binding of single amino acids in the binding pocket could be
resolved both qualitatively and quantitatively for both proteins. For ProX the SBP of ProU
molecular dynamics simulation as well as structural analysis revealed a single amino acid that
is responsible for switching the affinity of the binding pocket from a rather low affinity state to
a high affinity binding site.
Biophysical investigation of full length ABC-transporter requires application of detergents
to keep the membrane protein in solution. Establishment of a method for determination of
critical micelle concentration (CMC) and aggregation numbers of diverse detergents in
various buffer solutions was also one part of this work. Both parameters depend on pH, salt
concentration, temperature and polymer concentration in the solution. Thus a reliable and
fast analysis of these characteristics is an important advantage prior to start biophysical and
structural analysis on membrane proteins.
With such a “toolbox” in hand establishing purification and functional analysis of single
components of Type I secretion system of Escherichia coli were the next steps. This system,
which translocates its substrate Haemolysin A in a single step across two membranes, is
composed of three proteins: The ABC-transporter Haemolysin B (HlyB), a so called membrane
fusion protein Haemolysin D (HlyD) and the outer membrane protein TolC. The ABC-
transporter has a special feature: an additional domain at its N-terminus, which belongs to
the family of C39 peptidase domains. However, in HlyB the catalytic relevant residues are
mutated and therefore this C39 domain is no longer able to cleave. Homologous
II Abstract
overexpression and purification of the ABC-transporter HlyB and subsequent functional assays
showed that ATP hydrolysis of NBDs can be stimulated by the addition of substrate (HlyA). This
increase ATPase activity does not occur due to binding of HlyA to C39 domain but binding of
the secretion signal of HlyA to the NBDs of HlyB. To further investigate the role of C39 domain
in the transport cycle, the protein was overexpressed separately, purified and for structural
analysis successfully crystallized.
III Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die hier vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zum Verständnis der Substraterkennung und
Translokation bei ABC-Transportern. ABC-Transporter verkörpern eine der größten Klassen von
Membranproteinen. Ihr klassischer Aufbau aus zwei Nukleotidbindendenden (NBD)- und zwei
Transmembrandomänen (TMDs) ermöglicht den Transport unterschiedlichster Substrate unter
ATP-Verbrauch in allen Reichen des Lebens. Dabei werden Import und Exportsysteme
unterschieden. Importsysteme sind bisher ausschließlich in Prokayoten und Archaeen
gefunden worden und benötigen zusätzlich noch ein Substratbindeprotein (SBP), welches das
Substrat aus dem Periplasma oder dem extracellulären Raum zum Transporter delegiert.
Durch Analyse struktureller Daten dieser Substratbindeproteine wird die Substratspezifität,
sowie der Mechanismus der Substratbindung und auch des Entlassen des Substrates in die
Translokationspore des Transporters an den Beispielen des ABC-Transporters OpuB aus Bacillus
subtilis und ProU aus dem thermophilen Archaeon Archaeoglobus fulgidus erklärt werden.
SBPs von ABC-Transportern zeigen alle einen ähnlichen Aufbau: Sie bestehen aus zwei
unterschiedlich großen Domänen, in deren Mitte sich die Substratbindestelle befindet.
Kristallstrukturen von verschiedenen SBPs haben gezeigt, dass diese eine offene Konformation
ohne Substrat und eine geschlossene Konformation, bei der Substrat in der Mitte gebunden ist
und die beiden Domänen zueinander rotiert sind, einnehmen können.
Welche einzelnen Aminosäuren die Substratspezifität der Bindungstasche ausmachen, konnte
mittels Analyse der Kristallstrukturen des SBPs OpuBC, das ausschließlich Cholin bindet, und
einem Vergleich mit homologen SBPs mit verändertem Substratspektrum gezeigt werden. Für
das ProX Protein, das SBP des ABC-Transporters ProU, konnte ein detaillierter Ablauf der
Substraterkennung, Bindung und der Entlassung des Substrats in die Translokationspore des
Transporters bestimmt werden.
Die biophysikalische Untersuchung gesamter ABC-Transporter erfordert die Anwendung von
Detergenzien um diese Membranproteine in wässrigen Lösungen zu stabilisieren. Die
Etablierung einer Methode zur Bestimmung der kritischen Mizellen Konzentration sowie der
Aggregationszahl unterschiedlicher Detergenzien in verschiedensten Pufferlösungen ist ein
weiterer Aspekt dieser Arbeit. Beide Parameter sind stark von pH-Wert, Salzkonzentration,
Temperatur und Polymeren in der Lösung abhängig. Daher ist eine zuverlässige und schnelle
Analyse dieser Parameter ein entscheidender Vorteil, bevor biophysikalische oder strukturelle
Analysen an Membranproteinen durchgeführt werden.
Mit diesem „Werkzeugkoffer“ konnte die Reinigung und funktionelle Analyse der einzelnen
Komponenten des Typ I Sekretionssystems aus Escherichia coli etabliert werden. Dieses
System, das das Substrat Hämolysin A in einem Schritt über zwei Membranen transportiert,
IV Zusammenfassung
besteht aus drei Komponenten: Dem ABC-Transporter Hämolysin B (HlyB), dem
Membranfusionsprotein Hämolysin D (HlyD) und dem Außenmembranprotein TolC. Dabei
besitzt der ABC-Transporter noch eine zusätzliche N-terminale Domäne, die in
Sequenzvergleichen sich als C39 Peptidasedomäne herausstellte. Allerdings sind die
katalytisch relevanten Aminosäuren mutiert, so dass sie nicht mehr in der Lage ist ihr Substrat
zu spalten. Die homologe Expression und Aufreinigung des ABC-Transporters HlyB, sowie die
anschließende funktionale Analyse haben gezeigt, dass die Hydrolyseaktivität der NBDs vom
Substrat HlyA stimuliert werden kann. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass diese
Stimulation nicht auf eine Bindung an die C39 Domäne hervorgerufen wird, sondern es sich
um eine Interaktion des Sekretionssignal mit den NBDs handeln muss. Um die Rolle der C39-
Domäne zu verstehen, wurde diese separat exprimiert und aufgereinigt und für strukturelle
Analysen erflgreich kristallisiert.
V Introduction
1. Introduction
Cellular membranes are composed of a lipid bi