Characterization of a thermosensitive ribonucleotide reductase mutant derived from Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 and its use in the production of nucleotides [Elektronische Ressource] / von Hesham Elhariry

Qusai Al Abdallah

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• Biologie

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• Publié le: 01 janvier 2004
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Extrait

Characterization of a thermosensitive ribonucleotide reductase
mutant derived from Corynebacterium ammoniagenes ATCC
6872 and its use in the production of nucleotides




Von dem Fachbereich Biologie
der Universität Hannover

zur Erlangung des Grades eines
Doktors de Naturwissenschaften
-Dr. rer. nat.-


genehmigte Dissertation

von

M.Sc. Hesham Elhariry


geboren am 27. 05. 1969
in Kairo, Ägypten



2004





















Referent: Prof. Dr. G. Auling

Korreferent: Prof. Dr. H.-J. Jacobsen

Mitprüfer: Prof. Dr. A. Brakhage









Tag der Promotion: 10.05.2004




ABSTRACT

Hesham Elhariry

Characterization of a thermosensitive ribonucleotide reductase mutant
derived from Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 and its use in
the production of nucleotides

Coryneform bacteria are widely used for the production of flavor enhancers and
other nucleotides by direct fermentation of sugar into 5´-ribonucleotides. Here, the
metabolic correlation between nucleotide accumulation and arrest of cell-cycle in the B-,
C-, and D-phases was studied in non-synchronized cultures of C. ammoniagenes wild-
type and a thermosensitive (ts) mutant derived therefrom. Particular emphasis was laid on
the inhibition of DNA precursor biosynthesis in the wild-type by addition of radical
scavengers or by heat treatment of the nrd (nucleotide reduction) mutant CH31. Direct or
indirect inhibition of the cell-cycle of the wild-type strain ATCC 6872 by addition of
antibiotics or radical scavengers induced only limited elongation characteristic of
corynebacteria. In the order of B-, C-, and D-phase, the earliest inhibition of the cell-
cycle yielded the highest accumulation of NAD. The highest level (1.52 g / l) of NAD
was accumulated when the cell-cycle of the ts-mutant CH31 was arrested by temperature
shift to non-permissive conditions.
To identify the putative point mutation of the ts-mutant CH31 in the nrdE gene, 5.2
kb XmaI-fragment from the chromosomal DNA of the CH31 strain or its parent strain
were cloned. Sequence comparison of the nrdE genes revealed a nucleotide exchange at
position 1301 from cytosine to thymine. The deduced amino acid sequence of NrdE
indicated an exchange in the position 434 resulting in the substitution of serine for
phenylalanine adjacent to the active site. In order to determine the consequence of this
+amino acid exchange for the thermosensitivity of the ts-mutant CH31, either nrdE or
ts +nrdE genes were cloned and expressed in this mutant. Introduction of the nrdE gene
from the wild-type but not from the mutant complemented the thermosensitive phenotype
of strain CH31.
Under non-permissive conditions the strain CH31 was also able to accumulate
IMP. Extracellular accumulation of either NAD or IMP was distinctly enhanced by
adding precursors for exploitation of salvage pathways. For further improvement of IMP
production the ts-mutant CH31 was grown in a 10-liter bioreactor under modified
cultivation conditions.

Key words: Corynebacterium ammoniagenes, manganese-ribonucleotide reductase, cell
cycle, limited elongation, scanning electron microscopy, 5´-IMP, NAD, flavor enhancer.



Zusamenfassung

Hesham Elhariry

Charakterisierung der thermosensitiven Ribonucleotid Reduktase Mutante von
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 und deren Nutzung für die Pro-
duktion von Nucleotiden.

Coryneforme Bakterien werden in industriellem Maßstab für die Produktion von
Geschmacksverstärkern und anderen Nucleotiden durch direkte fermentative Umsetzung
von Zuckern zu 5´-Ribonucleotiden genutzt. In dieser Arbeit wurde die Beziehung
zwischen der Anhäufung von Nucleotiden und der Unterbrechung des Zellzyklus in der
B-, C- und D-Phase untersucht. Dazu wurden exponentielle Kulturen von C.
ammoniagenes ATCC 6872 und der daraus hergestellten thermosensitiven Mutante
CH31 hinsichtlich der Unterdrückung der DNA-Vorstufensynthese durch Zugabe von
Radikalfängern oder durch Hitzebehandlung der nrd ( nucleotide reduction)-Mutante
untersucht.
Direkte und indirekte Unterbrechung des Zellzyklus beim Wildtyp-Stamm ATCC 6872
durch Zugabe von Antibiotika oder Radikalfängern bewirkte nur eine eingeschränkte
Verlängerung der Zellen, wie sie für Corynebakterien typisch ist. Die Hemmung zum
frühest möglichen Zeitpunkt (B-Phase) führte zu einer höheren Produktion von NAD als
eine Unterbrechung in der C- und D-Phase. Der höchste NAD-Wert (1,52 g / L) wurde
tsbei Hemmung des Zellzyklus der nrd-Mutante durch Erhöhung der
Kultivierungstemperatur auf nicht-erlaubte Bedingungen erreicht (37°C).
Um die Punktmutation im nrdE-Gen der nrd-Mutante CH31 zu identifizieren, wurde ein
5,2 kb XmaI-Fragment aus der chromosomalen DNA des Stammes CH31 oder des
Elternstammes kloniert. Ein Sequenzvergleich der nrdE-Gene ergab einen Nucleotid-
Austausch von Thymin gegen Cytosin an Position 1301. Die abgeleitete Aminosäure-
Sequenz des NrdE-Proteins zeigte an Position 434 einen Austausch von Serin gegen
Phenylalanin in der Region neben dem katalytischen Zentrum. Um die
Verantwortlichkeit dieser Punktveränderung festzustellen, wurden nrdE-Gene des
tsWildtyps und der Mutante in die nrdE Mutante CH31 kloniert und dort exprimiert. Mit
dem nrdE-Gen des Wildtyps konnte durch genetische Komplementation wieder Wildtyp-
Verhalten erreicht werden, nicht jedoch mit dem defeken nrdE-Gen des Stammes CH31.
Die Mutante CH31 konnte bei erhöhter Temperatur auch IMP akkumulieren. Sowohl die
Produktion von NAD wie von IMP ließ sich durch Zugabe von Vorstufen im salvage
pathway dramatisch steigern. Für die IMP-Produktion wurden die Ergebnisse aus
Schüttelkolben erfolgreich auf die Anzucht im 10 L-Maßstab (Bioreaktor) übertragen.

Schlagworte: Corynebacterium ammoniagenes, Mangan-Ribonucleotid Reduktase,
Zellzyklus, Rasterelektronenmikroskopie, 5´-IMP, NAD, Geschmacksverstärker


i


TABLE OF CONTENTS
LIST OF ABBREVIATIONS…….….....….…..……..…………………....………………III
1 INTRODUCTION ………………………………………………….……………………...…1
1.1 Production of flavor enhancers by corynebacteria......................................................... 2
1.2 Prokaryotic cell-cycle .................................................................................................... 4
1.3 Cell-cycle of coryneform bacteria................................................................................ 11

2 MATERIALS AND METHODS ............................................................................................. 14
2.1 Chemicals and enzymes 14
2.2 Microorganisms, plasmids, and primers.................................................................... 16
2.3 Media........................................................................................................................... 18
2.4 Microbiological methods............................................................................................ 20
2.4.1 Maintenance of strains.......................................................................................... 20 .4.2 Examination of ts-mutant CH31 phenotype ........................................................ 20
2.4.3 Bacterial growth.................................................................................................... 20
2.4.3.1 Measurement of turbidity ................................................................................. 20
2.4.3.2 Measurement of cell dry weight....................................................................... 21
2.4.3.3 Viable count ..................................................................................................... 22
2.4.4 Minimum inhibitory concentration (MIC) ............................................................. 22
2.4.5 Scanning electron microscopy (SEM) ................................................................. 22
2.5 Molecular biological methods.................................................................................... 23
2.5.1 Determination of DNA concentration.................................................................. 23
2.5.2 Agarose gel electrophoresis 24
2.5.3 Digestion of DNA by restriction endonucleases................................................. 24
2.5.4 Isolation of DNA fragments 24
2.5.5 Ligation.................................................................................................................. 24 .5.6 Isolation of chromosomal DNA ........................................................................... 25
2.5.7 Mini-preparation of plasmid DNA....................................................................... 26
2.5.8 Midi-preparation of plasmid DNA..........................