Characterization of early responses to sulfur deficiency treatment in poplar (Populus temula x Populus alba) [Elektronische Ressource] / by Anne Honsel

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• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 11
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

Characterization of early responses to
sulfur deficiency treatment in poplar
(Populus tremula x Populus alba)
Thesis submitted in partial fulfilment of the requirements of
the degree Doctor rer. nat. of the
Faculty of Forest and Environmental Sciences,
Albert-Ludwigs-University Freiburg im Breisgau, Germany
by
Anne Honsel
Freiburg im Breisgau, Germany
2010Dean of the faculty: Prof. Dr. Dr. h.c. G. Becker
Supervisors: Prof. Dr. H. Rennenberg
Prof. Dr. C. Herschbach
Second Reviewer: Prof. Dr. S. Fink
Date of thesis´defence: 1st December 2010Contents
1 Introduction 1
1.1 Importance of sulfur for plants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Sulfate reduction and assimilation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.3 Sulfate uptake and distribution within the plant: the sulfate transporter family . . . . . . . 3
1.4 Regulation of sulfur metabolism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.4.1 Regulation of sulfur metabolism upon sulfur deficiency . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4.2 Post-transcriptional regulation: role of microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4.3 The role of plant hormones in regulation of sulfur metabolism . . . . . . . . . . . 12
1.5 Poplar as model system - special features of trees . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.6 Aims and research questions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2 Materials and Methods 17
2.1 Plant material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.1 Plant propagation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.2 Planting on sand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.3 Growth conditions in the greenhouse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.4 Plant protection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2 Plant treatments and sampling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.1 Sulfur deficiency treatments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.2 Feeding experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.3 Molecular biological methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.1 Cloning of gene sequences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.2 Standard DNA amplification via PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.3.3 Separation of DNA segments by agarose gel-electrophoresis . . . . . . . . . . . 28
2.3.4 Isolation of DNA from gels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.3.5 DNA ligation into the pCR2.1 vector . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.3.6 Preparation of competent E. coli cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.3.7 Transformation of E. coli strain INVF´ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.3.8 Isolation of transformed and proliferated plasmids . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.3.9 Determination of nucleic acid concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.3.10 Preparation of RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
iii Contents
2.3.11 Preparation of DNA free RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.3.12 cDNA synthesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.3.13 Northern blotting for mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.3.14 Northern blotting for microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.3.15 Quantitative real-time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.4 Physiological and analytical methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.4.1 Chlorophyll contents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.4.2 Ion chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.4.3 Soluble carbohydrates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.4.4 Thiol analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.4.5 Phytohormone analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
15 142.4.6 Determination of N/ N-ratio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.5 Biometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.6 Bioinformatic target prediction for microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.7 Statistical analyses and calculations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3 Results 59
3.1 Experimental conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.1.1 Sulfate availability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.1.2 Phenotypic plant features . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.2 Fine roots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.2.1 Sulfate and phosphate concentrations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.2.2 Gene expression data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2.3 Thiol contents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.2.4 Content of soluble sugars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.2.5 Plant Hormones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.2.6 Analysis of correlation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.3 Young leaves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.3.1 Sulfate and phosphate concentrations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.3.2 Gene expression data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
3.3.3 Thiol contents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.3.4 Contents of soluble sugars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.3.5 Pigment contents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.3.6 Plant hormones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.3.7 Analysis of correlation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.4 Mature leaves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
3.4.1 Sulfate and phosphate concentrations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
3.4.2 Gene expression analyses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
3.4.3 Thiol contents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114Contents iii
3.4.4 Contents of soluble sugars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
3.4.5 Pigment contents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
3.4.6 Plant hormones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
3.4.7 Analysis of correlation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
3.5 Xylem sap . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
3.5.1 Sulfate concentrations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
3.5.2 Thiols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
3.5.3 Sugars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
3.5.4 Plant hormones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
3.5.5 Analysis of correlation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
3.6 Phloem exudates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
3.6.1 Sulfate concentrations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
3.6.2 Thiols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
3.6.3 Sugars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
3.6.4 Plant hormones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
3.6.5 Analysis of correlation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
3.7 Role of microRNAs in regulation of sulfur metabolism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
3.7.1 Bioinformatic target prediction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
3.7.2 Expression of miR395 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
3.8 Feeding experiments with cytokinins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
3.8.1 Root feeding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
3.8.2 Feeding into a leaf vein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
4 Discussion 147
4.1 Early changes due to reduced sulfate supply in fine roots . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
4.1.1 Responses to sulfate limitation in fine roots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
4.1.2 Early sulfate deficiency in fine roots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
4.2 Early changes due to reduced sulfate supply in young leaves . . . . . . . . . . . . . . .