Classification, identification and detection of toxigenic moulds [Elektronische Ressource] / Holger Schmidt

Holger Drachmann

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• Biologie
• Gesundheit

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2003
• Nombre de lectures: 28
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 20 Mo

Extrait

Lehrstuhl für Technische Mikrobiologie




Classification, Identification and Detection of Toxigenic Moulds



Holger Schmidt



Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung
des akademischen Grades eines


Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.



Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Erich F. Elstner
Prüfer der Dissertation:
1. Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Rudi F. Vogel
2. Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Rolf Geisen,
Universität Karlsruhe (TH)



Die Dissertation wurde am 16.4.2003 bei der Technischen Universität München eingereicht
und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung
und Umwelt am 10.06.2003 angenommen.





Classification, Identification and Detection of
Toxigenic Moulds

Holger Schmidt




Doctoral Thesis
Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und
Umwelt,
Freising, 2003



Acknowledgments

Mein herzlicher Dank gilt ...
... in erster Linie meinem Doktorvater Prof. Dr. Rudi F. Vogel dafür, dass er es mir
ermöglichte, diese Arbeit an seinem Lehrstuhl anzufertigen. Die Gelegenheit, sich im Laufe
der Promotion fachlich weiterzubilden, das entgegengebrachte Vertrauen zusammen mit den
gewährten Freiräumen und nicht zuletzt das angenehme Arbeitsklima am Lehrstuhl habe ich
sehr geschätzt.

... Herrn PD Dr. Rolf Geisen für die Bereitschaft diese Arbeit zu begutachten, nochmals die
Reise nach Weihenstephan anzutreten und die nette Zusammenarbeit im Projekt.

... Herrn PD Dr. Ludwig Niessen für die Betreuung und Durchsicht nicht nur dieser Arbeit.

... allen Angehörigen des Lehrstuhls für Technische Mikrobiologie für die entgegengebrachte
Hilfsbereitschaft, Kollegialität und die außermikrobiologischen Aktivitäten, besonders aber
Angela für die stete Hilfsbereitschaft beim Kampf gegen Formulare und meinen
„Zimmergenossen“ Helge (für das Schdügg frängische Heimad in Oberbayern) und Maher
(für die zahlreichen arabischen Weisheiten).

... Steff besonders dafür, dass er mich niemals ganz die Bodenhaftung verlieren ließ, Sandi
und Joschi und allen anderen, die ich nicht namentlich erwähne, für das Leben außerhalb des
Labors und die entgegengebrachte Freundschaft.

.... Irith für alles, was Sie mit und wegen mir durchgemacht hat, für ihre Geduld, Zuneigung,
Zuspruch, Nähe und einfach Alles.

... meinen Eltern, meinem Bruder Markus, meiner Schwester Katrin und der ganzen Familie,
die mich während meiner gesamten Ausbildung immer getragen hat und ohne die ich das hier
auch nicht geschafft hätte.

Allen nochmals ein herzliches Dankeschön!
Contents

I. Introduction............................................................................................................................. 1
1. Fungi in food production.................................... 1
2. Mycotoxins and mycotoxicoses ......................................................................................... 2
3. Toxigenic fungi .................................................. 4
4. Problems in fungal classification ....................................................................................... 8
5. PCR based detection of toxigenic fungi........... 12
6. Objectives of this study .................................................................................................... 14
II. Materials and methods......... 15
1. Organisms......................................................................................................................... 15
2. Maintenance of fungal cultures........................ 15
3. DNA extraction from pure fungal cltures (Möller et al., 1992) ....................................... 16
4. DNA concentration measurement .................................................... 17
5. DNA preparation from green coffee samples (Knoll et al., 2002b)................................. 17
6. Oligonucleotides for AFLP .............................................................................................. 18
6.1 Adapter preparation.................................... 18
6.2 Primer sequences........................................................................ 18
7. AFLP (Vos et al., 1995, Aarts and Keijer, 1999)............................. 19
7.1 Template preparation.................................................................................................. 19
7.2 Pre-amplification........ 19
7.3 Selective Amplification.............................................................................................. 19
7.4 Automated laser fluorescence analysis (ALFA)........................ 20
8. AFLP for the recovery of marker sequences.................................................................... 20
8.1 Modifications of the AFLP protocol.......... 20
8.2 Electrophoresis on polyacrylamide gels and silver staining ...................................... 21
8.3 DNA recovery, cloning, sequencing and PCR conditions......... 21
Contents

9. Standard polymerase chain reactions (PCRs) ............................................................ 22
10. Quantitative PCR............................................................................................................ 22
11. Computing and analysis of biological relationships...................... 23
11.1 Fingerprints .............................................................................................................. 23
11.2 Composite data sets.. 23
III. Results ................................................................................................................................ 25
1. AFLP typing of Fusarium poae, F. sporotrichioides and F. langsethiae Torp and
Nirenberg ined................................................................................................................... 25
2. Cluster analysis of composite datasets of Fusarium section Sporotrichiella isolates...... 29
3. AFLP typing of ochratoxinogenic Penicillium strains..................................................... 32
4. AFLP typing of Aspergillus niger and A. carbonarius and construction of SCAR
primers............................................................................................................................... 34
5. Typing of A. ochraceus and construction of SCAR primers............ 39
6. Detection of Aspergillus ochraceus in coffee samples .................................................... 45
7. Quantification of A. ochraceus DNA in coffee................................ 46
IV. Discussion .......................................................................................................................... 48
1. Methods............................ 48
2. Fusarium poae, F. sporotrichioides and F. langsethiae Torp and Nirenberg ined. ........ 49
3. Penicillium verrucosum and “P. nordicum” .................................................................... 50
4. Aspergillus carbonarius and A. niger .............................................. 51
5. Aspergillus ochraceus ...................................................................................................... 52
V. Summary ............................................................................................. 56
VI. Zusammenfassung.............................................................................................................. 58
VII. References......................... 60
VIII. Appendix ................................................................................................ 76
I. Introduction

I. Introduction
1. Fungi in food production
Fungi are widely used for fermentation of food and beverages, improving sensory and dietary
quality of raw products. Beer, wine and other alcoholic beverages result from the fermenta-
tion of sugar containing liquids (i. e. wort and grape juice) with yeasts. Sake is made in a
complex production procedure with Aspergillus oryzae as the most important organism in-
volved in the process. Kefir and Kumiss are drinks made from milk fermented with lacto-
bacilli and different yeasts. Apart from various well known cheese products like Stilton, Gor-
gonzola, Roquefort, Camembert etc., many traditional foods are made with the use of fungi.
Examples are Tempeh and Sufu in Asia, Ogi in Nigeria and sierra rice in Ecuador (Nout,
2000, Weidenbörner, 1998). In addition to that fungal biomass itself serves as human nutri-
tion. Apart from macromycetal fruiting bodies, e. g. mushrooms, until now the only industrial
produced foodstuff is “Quorn” (Marlow Foods ltd.), consisting of processed hyphae of a non-
toxigenic strain of Fusarium venenatum (O´Donnell et al., 1998, Yoder et al., 1998). On the
other hand, uncontrolled fungal growth often leads to con