Comparative analysis of midline guidance and axon pathfinding in the chelicerates Achaearanea tepidariorum and Cupiennius salei [Elektronische Ressource] / von Viktoria Linne

Vicky Kembe

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• Publié le: 01 janvier 2010
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Extrait

Comparative analysis of midline guidance and axon
pathfinding in the chelicerates
Achaearanea tepidariorum and Cupiennius salei




Dissertation
zur Erlangung des Akademischen Grades

doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fachbereich Biologie


Eingereicht an der Johannes Gutenberg-Universität
Mainz
von Diplom Biologin
Viktoria Linne


Geboren am 28.06.1978
in Dresden


Mainz, September 2010












Dekan:


1. Berichterstatterin:

2. Berichterstatter:




Datum der mündlichen Prüfung: 11.11.2010
Zusammenfassung

Die Neurogenese und axonale Wegfindung sind in den vergangenen Jahrzehnten
Thema einer Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen in den verschiedensten
Organismen gewesen. Die zusammengetragenen Daten in Insekten und Crustaceen
geben eine gute Übersicht darüber, wie das Nervensystem in Arthropoden aufgebaut
wird. Die entwicklungsbiologischen Prozesse, die daran beteiligt sind, sind in den
beiden genannten Gruppen sehr gut verstanden. In den Gruppen der Cheliceraten
und Myriapoden jedoch wurden ähnliche Analysen bisher kaum durchgeführt. Das
Hauptanliegen dieser Arbeit war es daher, Mechanismen in den Spinnen
Achaearanea tepidariorum und Cupiennius salei, zwei Vertretern der Cheliceraten,
zu untersuchen, die eine Rolle im Leitsystem der ventralen Mittellinie und bei der
axonalen Wegfindung spielen. Eine Vorraussetzung hierfür sind Kenntnisse über die
Architektur des Zentralnervensystems. In einem ersten Schritt beschrieb ich daher
grundlegend die Morphologie des Nervensystems im Verlauf der gesamten
Embryoalentwicklung. Ich konnte zeigen, dass in Spinnen ein für Arthropoden
typisches Strickleiternervensystem gebildet wird. Dieses wird von segmental
angelegten Neuronen geformt, wobei sowohl Gruppen von Zellen als auch einzelne
Neurone daran beteiligt sind, die primären axonalen Trakte zu etablieren. Im
Besonderen konnte ich eine Zelle identifizieren, die in Position, Projektionsmuster
und der Expression des Markergens even-skipped vergleichbar zum PR2 Neuron in
Drosophila ist, welches die posteriore Wurzel des Segmentalnervs anlegt.

In einem zweiten Ansatz untersuchte ich die ventrale Mittellinie in Spinnen im Bezug
auf ihre mögliche Funktion in der axonalen Wegfindung. Es konnte gezeigt werden,
dass es sich beim Epithel der Mittellinie, das die Lücke zwischen beiden
Keimstreifhälften während des gesamten Prozesses der Inversion überspannt, um
eine transiente Struktur handelt, die keine neuralen Zellen hervorbringt. Es ist daher
vergleichbar mit der so genannten Floor plate in Vertebraten, die ebenfalls nur
vorübergehend existiert. Die Untersuchung von single minded (sim) zeigte, dass es,
anders als in Drosophila, wo sim ein wichtiges regulatorisches Gen für die korrekte
Spezifizierung von Mittellinienzellen ist, nicht in den Zellen der Mittellinie, sondern in
diesen benachbarten Zellen, exprimiert wird. Das ist vergleichbar mit Vertebraten.
I
Zusätzlich konnte ich Expression von sim an den Basen der Gliedmassen und im
Kopf nachweisen. Wie in Vertebraten könnte sim an der Musterbildung dieser
Gewebe beteiligt sein. Dennoch spielt die Mittellinie in Spinnen eine wichtige Rolle
als Organisator für auswachsende, kommissurale Axone. Diese Funktion teilt sie mit
anderen Invertebraten und Vertebraten.

Die Signaltransduktionskaskade, die an der axonalen Wegfindung an der Mittellinie
beteiligt ist, ist in den verschiedensten Organismen hoch konserviert. In der
vorliegenden Arbeit konnte ich sowohl in Achaearanea als auch in Cupiennius ein
netrin Homolog identifizieren und eine konservierte Funktion des
Wegfindungsmoleküls während der Bildung der Kommissuren aufzeigen. RNAi
Experimente belegen, dass, wird die Funktion von netrin herunterreguliert, das
Strickleiternervensystem nicht korrekt gebildet wird, ins Besondere die
kommissuralen Faszikel. Des Weiteren konnte ich eine neue Funktion von netrin, die
bisher in anderen Organsimen noch nicht beschrieben wurde, identifizieren. Neben
seiner Rolle in der axonalen Wegfindung, scheint netrin auch an der epithelialen
Morphogenese im zentralen Nervensystem beteiligt zu sein. In dieser Funktion
scheint netrin in Gliazellen, die die epithelialen Vesikel der Invaginationsgruppen
umhüllen, wichtig zu sein, um neurale Vorläuferzellen in einem undifferenzierten
Zustand zu halten. Der Abbau von netrin Transkript durch RNA Interferenz führt zu
einer verfrühten Segregation neuraler Vorläuferzellen aus dem epithelialen Verband
der Invaginationsgruppen und zu einer Zunahme an Zellen, die den frühen
Differenzierungsmarker islet exprimieren.
II INDEX OF CONTENTS

Index of contents

1 INTRODUCTION ..................................................................................................... 1
1.1 Nervous system development in arthropods......................................................... 1
1.2 Axon pathfinding................................................................................................... 5
1.2.1 Axonogenesis in arthropods........................................................................... 5
1.2.2 Axon pathfinding in vertebrates...................................................................... 6
1.3 The ventral midline is an important organising centre in nervous system
development.......................................................................................................... 7
1.4 Single minded is the key regulator of midline cell fate in Drosophila and important
in CNS development in vertebrates....................................................................... 9
1.5 Netrin functions in midline guidance in Drosophila and in vertebrates................ 10
1.6 Anatomy of the adult nervous system in spiders ................................................ 11
1.7 Embryonic development of spiders..................................................................... 12
1.8 Aim ..................................................................................................................... 15
2 MATERIALS AND METHODS .............................................................................. 16
2.1 Solutions and chemicals..................................................................................... 16
2.2 Instruments and equipment ................................................................................ 16
2.3 Animals and animal care .................................................................................... 16
2.3.1 Achaearanea tepidariorum........................................................................... 16
2.3.2 Cupiennius salei........................................................................................... 17
2.4 Biomolecular methods ........................................................................................ 18
2.4.1 Working with RNA 18
2.4.2 RNA-Isolation............................................................................................... 18
2.4.3 Reverse transcription of RNA....................................................................... 19
I INDEX OF CONTENTS

2.4.4 PCR ............................................................................................................. 19
2.4.4.1 Standard PCR reaction.......................................................................... 19
2.4.4.2 Colony PCR........................................................................................... 22
2.4.5 DNA purification 23
2.4.5.1 Phenol-Chloroform extraction................................................................ 23
2.4.5.2 Precipitation of nucleic acids ................................................................. 24
2.4.6 Gel electrophoresis ...................................................................................... 24
2.4.6.1 DNA gel electrophoresis........................................................................ 24
2.4.6.2 RNA gel elis 25
2.4.7 Gel extraction of PCR fragments.................................................................. 25
2.4.8 In vitro transcription 26
2.4.9 Generation of double stranded probes for RNA interference ....................... 26
2.5 Microbiological methods ..................................................................................... 27
2.5.1 Vector and Vector preparation ..................................................................... 27
2.5.2 Preparation of the insert............................................................................... 28
2.5.3 Ligation ........................................................................................................ 28
2.5.4 Transformation of electrocompetent cells .................................................... 29
2.5.5 Transformation of chemically competent cells ............................................. 29
2.5.6 Culturing bacteria and preparation of plasmid DNA .............................